水飞蓟宾对KB口腔癌细胞的作用机制探究,口腔科学论文

水飞蓟宾对KB口腔癌细胞的作用机制探究,口腔科学论文摘要：目的:讨论水飞蓟宾对人口腔上皮样癌细胞KB细胞株增殖和侵袭的影响。方式方法:用不同浓度的水飞蓟宾和JNK抑制剂sp600125作用于体外培养的KB细胞株,应用CCK-8检测细胞24h,48h和72h存活率；平板克隆构成实验检测KB细胞的增殖情况，Transwell检测KB细胞的侵袭能力，蛋白免疫印迹实验分析p-JNK,VEGF和MMP-9蛋白的表示出水平。结果：CCK-8结果显示水飞蓟宾对KB细胞株的增殖具有明显的抑制作用，且呈时间剂量依靠性；平板克隆实验表示清楚，水飞蓟宾显着抑制KB细胞的集落构成；侵袭试验结果表示清楚，水飞蓟宾能够以剂量依靠的方式抑制KB细胞的侵袭作用；蛋白免疫印迹试验显示水飞蓟宾处理后，JNK的磷酸化水平、VEGF和MMP-9的表示出水平显着下调。JNK抑制剂sp600125作用于KB细胞后，VEGF和MMP-9蛋白的表示出水平明显下调，且集落的构成和侵袭均遭到了明显的抑制。结论：水飞蓟宾具有明显的抑制KB细胞增殖和侵袭的作用；其作用机制可能是通过抑制JNK通路，进而下调VEGF和MMP-9的表示出。本文关键词语：水飞蓟宾;KB细胞株;增殖;侵袭;Abstract：Objective:ToinvestigatetheeffectofsilibininonproliferationandinvasioninhumanoralepithelioidcarcinomaKBcellline.Methods:TheKBcellswereculturedinvitrowithdifferentconcentrationsofsilibininandJNKinhibitorsp600125.CCK-8assaywasusedfordetectingthesurvivalrateofcellsat24h,48hand72h.PlatecolonyformationassaywasusedtodetecttheeffectofKBcellproliferation.TranswellchamberwasusedtodetecttheinvasionofKBcells.Theexpressionlevelsofp-JNK,VEGFandMMP-9wereanalyzedbywesternblotting.Results:CCK-8resultsshowedthatsilibininhadasignificantinhibitoryeffectontheproliferationofKBcelllinesinatime-dose-dependentmanner.PlatecloningexperimentsshowedthatsilibininsignificantlyinhibitedcolonyformationofKBcells.TheresultsoftheinvasiontestshowedthatsilibinincouldinhibittheinvasionofKBcellsinadose-dependentmanner.WesternblottingshowedthatthephosphorylationlevelofJNK,theexpressionlevelsofVEGFandMMP-9weresignificantlydown-regulatedaftertreatmentwithsilibinin.TheexpressionlevelsofVEGFandMMP-9proteinsweresignificantlydown-regulated,andtheformationandinvasionofcoloniesweresignificantlyinhibitedaftertreatingwiththeJNKinhibitorsp600125inKBcells.Conclusion:SilibininhasobviousinhibitoryeffectonKBcellproliferationandinvasion.Theanti-tumormechanismmayberelatedtodown-regulatetheexpressionofVEGFandMMP-9byinhibitingJNKpathway.Keyword：silibinin;KBcellline;proliferation;invasion;口腔癌是一种主要与吸烟、饮酒、慢性炎症、病毒感染及遗传有关的多因素恶性肿瘤[1],其特征为高度局部浸润性和高颈淋逢迎转移率。相关研究表示清楚口腔癌的病理病因与调节细胞生长、增殖和细胞凋亡的基因突变密切相关[2]。当前,口腔癌治疗策略最常见的是化疗、放疗和手术以及这些方式方法的组合[3]。单一的治疗手段容易发生术后复发和转移,远期疗效不理想,而化学药物治疗可抑制肿瘤细胞活性,为较好的预后提供可能的时机[4]。但是化疗药物的全身毒性使其在癌症治疗中的有效性遭到限制,因而,通过从天然产物及其衍生物中寻找具有高效力和最小副作用的新型抗癌物质进行预防和治疗是癌症治疗的新兴领域。大多数植物化学物质是人类饮食的组成部分并被视为膳食补充剂。水飞蓟宾是从水飞蓟(silybummarianumL.Gaertn)的果实和种子中分离的类黄酮水飞蓟素的主要活性成分,是有效的膳食植物化学物质之一,其较强的抗肿瘤活性和分子作用机制是当前研究的热门。研究表示清楚水飞蓟宾对肝癌[5]、宫颈癌[6]、膀胱癌[7]、结肠癌[8]、肺癌[9]、卵巢癌[10]均有抑制作用,主要表现为阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、毁坏有丝分裂和抑制血管生成等作用[11]。在口腔癌方面,李云鹏等[12]考察了水飞蓟宾对人舌癌细胞的抑制作用,并阐述其可能是阻滞G1期;Chen等[13]发现水飞蓟宾通过抑制MAPK途径抑制SCC-4舌癌细胞的侵袭;Gohulkumar等[14]将水飞蓟宾包封在纳米颗粒中并研究其在口腔癌(KB)细胞中的细胞毒性和细胞凋亡诱导的抗癌作用,结果表示清楚水飞蓟宾纳米颗粒可用作有效药物输送系统来治疗癌症。尽管水飞蓟宾已显示作为化学治疗剂抑制口腔癌细胞的潜力,但其分子机制仍然未知。因而,本研究的目的是通过作用于KB口腔癌细胞,确定水飞蓟宾能否具有作为化疗药物的潜力并说明水飞蓟宾在KB细胞中的作用机制。1、材料和方式方法1.1、细胞株人口腔上皮癌KB细胞株,购于中科院上海细胞库。1.2、主要试剂MEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibco公司;DMSO、CCK-8和结晶紫染料购自碧云天生物技术研究所;Transwell小室和Matrigel基质胶购于美国Corning公司;水飞蓟宾和sp600125购自美国Sigma公司;兔抗人p-JNK抗体、兔抗人JNK抗体、兔抗人MMP-9抗体、兔抗人-actin抗体和山羊抗兔二抗购自美国CST公司,兔抗人VEGF抗体购自美国Abcam公司。1.3、方式方法细胞培养KB细胞培养于含10%胎牛血清的MEM培养基中,置于37℃、5%CO2浓度的恒温培养箱中培养,每2～3天传代1次。1.3.1、CCK-8检测细胞存活率消化收集对数生长期的细胞,以5103个/孔接种于96孔板中过夜培养。待细胞贴壁后,更换含不同浓度水飞蓟宾(0,5,10,20,50mol/L)的培养基,置于培养箱培养24h、48h、72h。终止培养前2h在每孔中参加10lCCK-8溶液,继续培养2h后,酶标仪读OD450nm,对照组设置为100%,给药组与对照组相比,计算细胞存活率。1.3.2、平板克隆构成实验将KB细胞以200个/孔接种于6孔板中,在含有不同浓度的水飞蓟宾(0,5,10,20mol/L)或JNK抑制剂sp600125(10mol/L)的培养基中培养10天,待集落构成后,弃去培养液,用PBS清洗2遍,多聚甲醛固定15min后,用结晶紫染色15min,PBS清洗多余的结晶紫染料。1.3.3、Transwell侵袭实验将KB细胞用0、5、10、20mol/L的水飞蓟宾或10mol/L的sp600125预处理24小时后,PBS清洗3次,消化收集细胞并计数;将预先铺设好基质胶的Transwell小室放入24孔板中,下室参加600l含5%FBS的培养基;将细胞以5104/孔种于上室,上下室均含有实验分组浓度的药物,置37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养12h。取出Transwell小室,用棉签擦去微孔膜上层细胞;PBS冲洗2遍;使用多聚甲醛室固定15min,结晶紫染色15min,PBS冲洗去除多余染料;在倒置显微镜下对迁移至微孔膜下层的细胞进行观察拍照。1.3.4、Westrenblot蛋白印迹实验将不同浓度(0,5,10,20mol/L)的水飞蓟宾作用KB细胞1h,检测JNK的蛋白表示出。使用不同浓度(0,5,10,20mol/L)的水飞蓟宾和10mol/Lsp600125作用KB细胞48h,检测VEGF和MMP-9的表示出。药物处理相应的时间后,用RIPA裂解液裂解细胞,提取总蛋白,并用BCA测定总蛋白的浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,并使用湿转将蛋白转移至PVDF膜上,用5%脱脂牛奶在37℃封闭1h,一抗4℃过夜孵育,TBST漂洗3次后,二抗室温孵育1h,TBST漂洗6次后,用ECL发光液曝光显影。用软件扫描蛋白条带并定量分析蛋白的表示出情况。1.4、统计学方式方法实验数据统计分析采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,结果以均数标准差(x?s)(x?s)来表示,并用单因素方差分析进行处理,组间进行t检验,P0.05以为差异具有统计学意义。2、结果2.1、水飞蓟宾对人口腔癌KB细胞增殖的影响不同浓度的水飞蓟宾(0,5,10,20,50mol/L)作用于人口腔癌KB细胞后,使用CCK-8检测细胞存活率,判定水飞蓟宾对KB细胞增殖的影响。结果表示清楚:与对照组相比,水飞蓟宾能显着抑制KB细胞的增殖(P0.05),且随着药物浓度的升高,抑制作用逐步加强,表现出剂量依靠性。同时随着药物作用时间的增加(24,48,72h),抑制作用也愈加明显,半数抑制浓度IC50分别为:55.36mol/L,22.18mol/L和9.64mol/L(图1)。2.2、水飞蓟宾对人口腔癌KB细胞克隆构成和侵袭的影响根据CCK-8的结果,选取低于半数抑制浓度的5,10,20mol/L的水飞蓟宾作用于KB细胞,通过平板克隆构成实验和Transwell实验分别检测水飞蓟宾对KB细胞增殖和侵袭转移能力的影响。结果显示:培养10天后,随着水飞蓟宾浓度的升高,克隆构成的数量明显减少(P0.05),表示清楚了水飞蓟宾对KB细胞增殖的抑制作用;同时水飞蓟宾预处理24h的细胞,在小室中培养12h后,穿过基质胶的KB细胞数量也明显减少(P0.05),表示清楚KB细胞的侵袭转移能力同样遭到水飞蓟宾的抑制(图2)。图1水飞蓟宾对人口腔上皮癌KB细胞增殖的影响Fig.1CellviabilityofKBcellstreatmentwithsilibinin图2水飞蓟宾对KB细胞的集落构成和侵袭的影响(结晶紫100)Fig.2InhibitionofKBcellscolonyformationandinvasionbytreatingwithsilibinin(violetcrystal100)2.3、水飞蓟宾对p-JNK、VEGF和MMP-9表示出的影响使用不同浓度的水飞蓟宾(5,10,20mol/L)作用于KB细胞,Westernblot检测p-JNK、VEGF和MMP-9的表示出。从图3中能够看出不同浓度的水飞蓟宾组中,JNK的磷酸化水平以及VEGF和MMP-9的表示出水平较空白对照组显着降低(P0.05)。图3水飞蓟宾对p-JNK、VEGF和MMP-9蛋白表示出的影响Fig.3Expressionofp-JNK,VEGFandMMP-9inKBcellstreatedwith0,5,10,20mol/Lsilibinin2.4、JNK抑制剂sp600125对p-JNK、VEGF和MMP-9表示出的影响用10mol/L的JNK抑制剂sp600125作用于KB细胞,Westernblot检测VEGF和MMP-9的表示出。结果表示清楚:sp600125显着降低VEGF和MMP-9的表示出水平(P0.05)(图4A)。2.5、JNK抑制剂sp600125对人口腔癌KB细胞克隆构成和侵袭的影响用10mol/L的JNK抑制剂sp600125处理KB细胞,平板克隆构成实验的结果显示:sp600125作用于细胞10天后,显着抑制KB细胞克隆数量的构成(P0.05),Transwell实验的结果表示清楚:sp600125预处理细胞24h,在小室中培养12h后,侵袭穿过基质胶的KB细胞数量,较对照组明显减少(P0.05)(图4B)。3、讨论天然化合物一直在世界医疗保健和传统医学系统中发挥着宏大的作用。水飞蓟宾作为长期应用的保肝药被发如今抗肿瘤活性方面有良好的开发前景。研究表示清楚水飞蓟宾可在癌变经过的不同阶段发挥作用:抑制增殖、调节细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制新生血管生成、抑制迁移等[11]。因而,作为一种潜在的抗癌药物,水飞蓟宾的作用机制值得深切进入研究。本研究以人口腔上皮样癌细胞KB细胞株为研究对象,讨论水飞蓟宾对其增殖及侵袭的影响并分析其潜在的抗肿瘤作用机制。图4JNK抑制剂sp600125对KB细胞中VEGF和MMP-9蛋白的表示出(A)以及KB细胞的集落构成和侵袭(B)的影响(结晶紫100)Fig.4InhibitionofVEGFandMMP-9expressioninKBcells(A)andtheKBcellscolonyformationandinvasionbytreatingwith10mol/Lsp600125(B)(violetcrystal100)异常增殖是肿瘤细胞的基本特征,能否抑制肿瘤细胞增殖是抗肿瘤药物的前提条件[15]。本试验通过CCK-8和平板克隆试验研究水飞蓟宾对KB细胞增殖的抑制作用。CCK-8试验结果显示,水飞蓟宾能显着抑制KB细胞的增长,且随着水飞蓟宾浓度的增加和作用时间的延长,抑制作用逐步加强,呈时间和剂量依靠性。平板克隆试验结果显示,随着水飞蓟宾浓度的升高,克隆构成的数量明显减少。两者共同表示清楚了水飞蓟宾对KB细胞增殖具有抑制作用。侵袭与转移是肿瘤恶化的标志,本研究通过Transwell侵袭实验研究证实了水飞蓟宾对KB细胞侵袭的抑制作用。VEGF是一种重要的促血管生成因子,作用于血管内皮细胞,肿瘤组织新生血管的生成是肿瘤细胞增殖并发生侵袭与转移的关键因素[16]。除此之外,毁坏和降解细胞外基质,是肿瘤细胞侵袭与转移经过中的关键步骤[17]。基质金属蛋白酶类MMPs是一种肿瘤细胞外表释放的蛋白水解酶,能够降解细胞外基质,毁坏基底膜,进而使肿瘤细胞侵入血管并向周围组织浸润扩散[18]。本研究通过Westernblot实验证实水飞蓟宾显着抑制VEGF和MMP-9的表示出,并且显着抑制丝裂原活化蛋白激酶JNK的磷酸化水平,克隆构成及Transwell实验表示清楚水飞蓟宾抑制了细胞的增殖与转移。因而揣测水飞蓟宾是通过对JNK通路的抑制,进而对VEGF和MMP-9的蛋白表示出产生影响,最终抑制KB细胞的增殖和转移。随后使用JNK抑制剂sp600125进行佐证,结果表示清楚sp600125抑制JNK的活化后,VEGF和MMP-9蛋白的表示出水平明显下调,KB细胞集落的构成以及Transwell侵袭的细胞数量显着降低。使用sp600125的结果提示,在KB细胞中,JNK通路在VEGF和MMP-9的表示出中发挥重要作用,最终影响了KB细胞的增殖与转移。综上所述,水飞蓟宾可能通过抑制JNK的活化,进而抑制VEGF和MMP-9的蛋白表示出,最终抑制人口腔上皮癌细胞KB细胞株的增殖和转移。以下为参考文献[1]StJohnMA.Inflammatorymediatorsdrivemetastasisanddrugresistanceinheadandnecksquamouscellcarcinoma[J].TheLaryngoscope,2021(125):S1-S11.[2]KimJS,OhD,YimMJ,etal.BerberineinducesFasL-relatedapoptosisthroughp38activationinKBhumanoralcancercells[J].OncologyReports,2021,33(4):1775-1782.[3]HUANGZH,CHENK,ZHANGTZ.Researchprogressoftheeffectsofdifferenttreatmentsonsurvivalqualityofpatientswithoralcancer[J].HainanMedicalJournal,2021,29(6):834-837.[黄泽浩,陈坤,张铁柱.不同治疗方式对口腔癌患者生存质量影响的研究进展[J].海南医学,2021,29(6):834-837.][4]EidA,LiS,GarzaR,etal.Chemotherapyfororalandmaxillofacialtumors:Anupdate[J].OralandMaxillofacialSurgeryClinics,2020,26(2):163-169.[5]PolachiN,BaiG,LiT,etal.Modulatoryeffectsofsilibinininvariouscellsignalingpathwaysagainstliverdisordersandcancer-Acomprehensivereview[J].EuropeanJournalofMedicinalChemistry,2021(123):577-595.[6]ZhangY,GeY,ChenY,etal.Cellularandmolecularmechanismsofsilibinininducescell-cyclearrestandapoptosisonHeLacells[J].CellBiochemistryandFunction,2020,30(3):243-248.[7]WuK,NingZ,ZengJ,etal.Silibinininhibits-catenin/ZEB1signalingandsuppressesbladdercancermetastasisviadual-blockingepithelial-mesenchymaltransitionandstemness[J].CellularSignalling,2020,25(12):2625-2633.[8]AkhtarR,AliM,MahmoodS,etal.Anti-proliferativeactionofsilibininonhumancolonadenomatouscancerHT-29cells[J].NutricionHospitalaria,2020,29(2):388-392.[9]MateenS,RainaK,AgarwalR.Chemopreventiveandanti-cancerefficacyofsilibininagainstgrowthandprogressionoflungcancer[J].NutritionandCancer,2020,65(sup1):3-11.[10]MomenyM,GhasemiR,ValentiG,etal.Effectsofsilibininongrowthandinvasivepropertiesofhumanovariancarcinomacellsthroughsuppressionofheregulin/HER3pathway[J].TumorBiology,2021,37(3):3913-3923.[11]ZHANGYX,YUM,RONGJM,etal.Thepleiotropicmechanismsofsilibininagainstcancers[J].GuangdongChemicalIndustry,2021,44(22):94-96.[张元新,于明,荣家闵,等.水飞蓟宾抗肿瘤作用机制研究进展[J].广东化工,2021,44(22):94-96.][12]LIYP,LISQ,CHENGXB,etal.InhibitioneffectsofsilibininonhumantonguecancercelllineTca[J].JournalofPracticalStomatology,2018,25(2):281-284.[李云鹏,李绍青,程晓兵,等.水飞蓟宾对人舌癌细胞Tca的抑制作用[J].实用口腔医学杂志,2018,25(2):281-284.][13]ChenPN