ELISA试验方法的相关问题及质量控制

ELISA试验方法的相关问题及质量控制河北医科大学第二医院检验科李永军

酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)

1971年由瑞典学者Engrall和Perlmann,荷兰学者Vanweeman和Schuurs报道。开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法。酶免疫技术的分类

酶免疫组化酶免疫技术

均相酶免疫测定

酶免疫测定液相酶免疫测定异相酶免疫测定固相酶免疫测定

（ELISA）

Ag+Ab*

AgAb*+Ab*均相法：抗原抗体反应后AgAb*中的标记物失去特性，不需进行AgAb*与Ab*的分离，可直接测定游离的Ab*量，从而推算标本中的Ag量。异相法：抗原抗体反应后，需将AgAb*与Ab*，然后测定AgAb*或Ab*的量，从而推算标本中的

Ag

量。ELISA方法的基本原理（1）使抗原或抗体结合到固相载体表面，并保持其免疫活性。（2）使抗原或抗体与酶结合成酶标抗原或抗体，并保持抗原或抗体的免疫活性和酶的活性。（3）酶标的抗原或抗体与相应的抗体或抗原反应后，结合在免疫复合物上的酶催化底物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色的深浅与标本中的抗原或抗体的量直接相关。ELISA方法的基本类型

（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（一）双抗体夹心法

洗涤洗涤洗涤待测抗原（二）间接法洗涤洗涤洗涤待测抗体酶标抗抗体（三）竞争法洗涤洗涤待测抗原酶标抗原双位点夹心法洗涤酶标抗BAB捕获法法固相抗抗IgM特异IgM非特异异IgM标本特异抗抗原抗原特特异酶酶标抗抗体底物ELISA试验的的方法法学原原理一步法法：Ab+Ag+Ab*→Ab——Ag—Ab*(a)Ab——Ag(b)Ag——Ab*(c)Ab*--Ag—Ab(d)二步法法Ab——Ag+Ab*→Ab——Ag—Ab*Ab*+Ag→Ab*—Ag(洗涤)ELISA方法的的影响响因素素及控控制表面效效应(Surfaceeffects)蛋白质质分子子在吸吸附过过程中中，为为了克克服与与固相相载体体之间间的排排斥力力需要要重新新分布布其表表面的的功能能性基基团，，使疏疏水性性基团团充分分暴露露，然然后局局部接接触区区域的的偶极极分子子脱氢氢，再再通过过范德德华引引力而而固相相到载载体表表面。。表面面效应应可直直接影影响抗抗原、、抗体体的够够象和和功能能固相导导致抗抗原的的变化化为了测测定抗抗体的的水平平，需需预先先将抗抗原（（包被被）到到极性性和疏疏水性性的聚聚苯乙乙烯（（PS））或聚氯氯乙烯烯（PVC）微板上上，利利用直直接物物理吸吸附方方法固固相蛋蛋白质质抗原原，可可引起起分子子够象象和抗抗原性性发生生改变变固相对对抗体体的影影响将抗体体固相相化时时，直直接吸吸附法法固相相抗体体分子子，除除了呈呈团串串状，，不均均匀分分布，，易解解吸等等外，，还可可发生生构象象改变变，使使抗体体结合合价减减少甚甚至失失活。。高剂剂量量钩钩镰镰效效应应(HD-HookEffects)发生生在在固固相相法法试试验验过过程程中中的的，，可可造造成成假假低低值值甚甚至至假假阴阴性性错错误误结结果果的的特特殊殊效效应应，，称称为为HD-Hook效应应。边缘缘效效应应(Edgeeffects)由于于微微量量反反应应板板周周边边孔孔与与内内部部孔孔升升降降温温速速率率的的差差别别，，造造成成周周边边孔孔与与内内部部孔孔结结果果的的差差异异，，这这就就是是边边缘缘效效应应或或位位置置效效应应弥散散效效应应(Diffusionlimits)在固固相相法法中中抗抗原原抗抗体体结结合合，，底底物物与与酶酶的的接接触触，，转转换换的的信信号号产产物物向向液液体体内内弥弥散散的的过过程程中中，，液液相相与与固固相相中中的的分分子子必必须须穿穿过过液液面面的的Nernst层，，也也就就是是液液固固屏屏障障，，使使反反应应速速率率受受到到限限制制。。干扰扰物物质质类风风湿湿因因子子补体体嗜异异性性抗抗体体血清清粘粘度度过过大大、、血血脂脂过过高高胆红红素素、、血血红红蛋蛋白白抗凝凝剂剂（（肝肝素素、、EDTA）酶类类风湿因因子类人血清清中IgM、、IgG型风湿因因子可以以与ELISA系统中的的捕获抗抗体及酶酶标记二二抗的FC段直接结合，导导致假阳阳性。将热变性性IgG（（63℃℃，10分钟）加加入到标标本稀释释液中。。用2-巯巯基乙醇醇加入到到标本稀稀释液中中，使RF降解。补体在固相化化和标记记抗体的的过程中中，抗体体FC段的补体体C1q分子结合合位点被被暴露，，使C1q可以将二二者连接接起来，，造成假假阳性。。用EDTA稀释标本本。用63℃℃，10分钟或或56℃℃，30分钟加加热使C1q灭活。嗜异性抗抗体人类血清清中含有有能与齿齿齿类动动物（鼠鼠）Ig结合的天天然嗜异异性抗体体，可将将ELISA系统中一一抗和二二抗连接接起来，，造成假假阳性。。在标本稀稀释液中中加入过过量的动动物Ig。标本溶血血标本溶血血可使红红细胞破破坏溶解解释放出出大量的的具有过过氧化物物酶活性性的血红红蛋白，，从而导导致非特特异性显显色。标本受细细菌污染染菌体中含含有内源源性辣根根过氧化化物酶，，被细菌菌污染的的标本，，在以辣辣根过氧氧化物酶酶为标记记物的ELISA测定中，，会导致致非特异异性显色色。标本保存存不当在冰箱中中保存过过久的标标本，血血清中IgG可聚合成成多聚体体、AFP可形成二二聚体，，在间接接法ELISA测定中会会造成假假阳性。。标本放置置时间过过长，有有时抗原原或抗体体的免疫疫活性减减弱，亦亦可出现现假阴性性。5天内测定定的血清清标本可可存放4℃，1周后测测定的血血清标本本应低温温冻存。。标本凝集集不全在没有促促凝剂和和抗凝剂剂的情况况下，正正常血液液采集后后1/2—2小小时开始始凝固，，18——24小时完全凝凝固。强强行分离离血清，，血清中中会有纤纤维蛋白白原残留留，形成成假阳性性。充分凝固固后分离离血清；；用带分分离胶的的采血管管或采血血管中加加入抗凝凝剂。添加物质质的影响响抗凝剂（（如肝素素，EDTA）、酶抑制剂剂（如NaN3)、分离胶等等可干扰扰ELISA测定。ELISA试验的有有关问题题洗涤液洗涤的目目的：除去未未结合的的免疫反反应物；；终止抗抗原抗体体的继续续结合；；除去血血清中与与反应无无关的其其它成份份和游离离的酶结结合物；；以及在在反应过过程中非非特异性性地吸附附于固相相载体的的干扰物物质。洗涤液的的种类：：蒸馏水吐温-蒸蒸馏水吐温-生生理盐水水PBS-吐温-蒸蒸馏水Tris-吐温-蒸蒸馏水（PH均为7.2或7.4））Tween20—月桂酸（（液液体）Tween40—棕榈酸（（液液体）Tween60—硬脂酸（（固固体）Tween80—油酸（（液体））阈值(Cutoff值，阴阳阳界值)进行大量量阴性标标本OD值的检测测，统计计阴性标标本的平平均值和和标准差差。以X+SD为界值，，一个标标本值小小于此界界值时，，是阴性性的可能能性为68%。。以X+2SD为界值，，一个标标本值小小于此界界值时，，是阴性性的可能能性为95%。。以X+3SD为界值值，一一个标标本值值小于于此界界值时时，是是阴性性的可可能性性为99%。为什么么阴性性标本本会略略显色色而不不是完完全无无色呢呢？由于目目前分分离、、纯化化、检检测技技术等等方面面的限制，，基因因工程程抗原原和合合成多多肽都都不可可能达达到100%纯度度，往往往含含有2-5%的的杂蛋蛋白。。同时时ELISA反应板板的非非特异异性吸吸附也也不可可避免免。阳性标标本不不显色色（2））基因工工程抗抗原和和合成成多肽肽抗原原的差差别ELISA试验的的影响响因素素及对对策灵敏度度：能能检测测到的的分析析物的的最小小量，，表示检检测下下限的的能力力。相对灵灵敏度度=真真阳性性/（（真阳阳性+假阴阴性））*100%1）试试剂盒盒（运运输时时间太太长、、温度度太高高）2）试试剂、、样品品用前前要平平衡3）试试剂开开启时时间长长、长长菌4）吸吸液器器吸量量不足足5）恒恒温箱箱不足足37℃或或温育育时间间不足足6）洗洗涤方方式不不对7）显显色剂剂加量量不足足8）显显色反反应时时间不不足重复性性：对对同一一样品品重复复分析析的结结果间间的符符合性性变变异系系数CV=SD/X*100%1）样样品加加入后后未混混匀2）移移液器器加样样量不不一致致3）洗洗涤方方式不不正确确4）唾唾液或或其它它杂质质掉入入孔内内5）酶酶或显显色剂剂B加量不不一致致6）标标本处处理不不当7）酶酶标仪仪测定定重复复性差差8）保保温时时间及及显色色时间间不一一致9）阈阈值附附近的的标本本特异性性：对对阴性性标本本给出出阴性性结果果的能能力相相对对特异异性=真阴阴性/（真真阴性性+假假阳性性）*100%1）配配制洗洗液的的蒸馏馏水污污染2）酶酶加量量过多多3）洗涤不不充分，样样品中其他他成分残留或有酶残残留4）显色剂剂暴露时间间太长5）恒温箱箱温度失控控6）加酶或或显色剂后后反应时间间过长7）吸头重重复使用室内质量控控制分析批：是是一个区间间（一段时时间或测量量样本量)预期期在此区间间内检测系系统的准确度和和精密度是是稳定的。。分析批长度度厂家推荐的的批长度用户规定的的批长度质控品每一分析项项目在用户户规定的分分析批长度度内必须检测质控控品。质控品的成成分应与检检测患者样样本的基质质一样或相似。质控品应均均一、稳定定，瓶间变变异性要小小于分析系统的变变异。质控品不能能作为校准