菌种保藏的方法课件

任务1-7

菌种的保藏任务1-7

菌种的保藏1一、菌种保藏的目的

①菌种存活，不丢失，不污染

②防止优良性状丧失

③随时为生产、科研提供优良菌种一、菌种保藏的目的2二、菌种保藏的原理：首先，选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等）其次，创造微生物代谢不活波，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等）

再次，添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏过程中细胞受伤。二、菌种保藏的原理：首先，选用优良的纯种（最好是休眠体，如分3三、菌种保藏的方法斜面保藏法穿刺保藏法沙土管干燥保藏法真空冷冻保藏法液氮保藏法低温保藏法三、菌种保藏的方法斜面保藏法4斜面低温保藏法方法：接种适宜斜面培养基→培养→4℃保藏原理：低温下，微生物代谢强度明显下降适用：各大类保藏期：3-6个月缺点：保存期短，传代多，易退化斜面低温保藏法5菌种保藏的方法课件6

半固体穿刺保藏法方法：适宜半固体→培养→4℃保藏原理：缺氧、低温适用：好气性细菌，酵母等保藏期：6-12个月步骤：用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，至培养基的1/2处，待微生物生长良好后覆盖2-3mm无菌液体石蜡.石蜡可防止培养基失水又隔绝氧气,降低代谢.但不适用于可以石蜡为碳源的微生物.半固体穿刺保藏法7菌种保藏的方法课件8

砂土管干燥保藏法方法：将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土管，然后接种保藏。原理：无营养，缺氧，干燥适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有芽孢的细菌保藏期：2-10年或更长砂土管干燥保藏法9河沙60目筛弃去大颗粒及杂质80目筛去掉细沙吸铁石吸去铁质10％～20％的盐酸浸泡24h去除有机物水洗至中性烘干或晒干土：取地面下40～60cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，100目过筛，水洗至中性，烘干。

将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，121℃高压间歇灭菌2-3次，烘干备用。孢子或芽孢悬液→加入无菌砂土管中→干燥→封口→4-6℃保藏步骤：沙：河沙60目筛弃去大颗粒及杂质80目筛去掉细沙吸铁石吸去铁质110无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。沙土管恢复培养无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出11真空冷冻干燥保藏法：方法：菌种培养→用保护剂悬浮→加入安醅管中→低温冻结（-25—-40℃）→抽真空→真空封口→4-5℃保藏措施：低温、干燥，缺氧，保护剂适用：各大类保藏期：5-10年或更长真空冷冻干燥保藏法：方法：菌种培养→用保护剂悬浮→12步骤1安瓿管的处理

直径8-10mm，长度不小于100mm，洗净高压灭菌备用。2保护剂

低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖类、蛋白质等。常用的是脱脂奶和血清。3菌悬液制备

最适培养条件、生长后期。产孢子的微生物须适当延长培养时间以获得成熟的孢子。4冷冻干燥5安瓿管的保藏

4-5℃保藏步骤1安瓿管的处理直径8-10mm，长度不小于100m13复苏方法：——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，——将安瓿管顶部烧热，——用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，——用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。复苏方法：14菌种保藏的方法课件15

液氮超低温保藏法方法：菌悬液→加入保护剂→分装至安醅管中（0.2-1cm菌悬液）→逐步降温至-25℃→液氮罐（-196℃）保藏措施：低温、加保护剂（10%甘油）适用：范围广泛保藏期：一般2～3年，长则9年。液氮超低温保藏法方法：菌悬液→加入保护剂→分装至16菌种的准备可采用下列几种方法：刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内；将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约5-10毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。菌种的准备可采用下列几种方法：17复苏方法：

从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。复苏方法：18菌种冻存管菌种冻存管19四、菌种保藏的注意事项菌种在保藏前所处的状态：孢子或芽孢菌种保藏所用的基质：碳源操作过程对细胞结构的损害四、菌种保藏的注意事项菌种在保藏前所处的状态：孢子或芽孢207种常用菌种保藏方法的比较方法主要措施适宜菌种保藏期评价斜面低温保藏法低温（4℃）各大类约1～6月简便冰箱保藏法（半固体）低温（4℃），避氧细菌，酵母菌约6～12月简便液体石蜡封藏法低温（4℃），阻氧各大类约1～2年简便砂土干燥保藏法干燥，无营养产孢子的微生物约1～10年简便有效甘油悬液保藏法低温（－70℃），保护剂（15～50％甘油）细菌，酵母菌约10年较简便冷冻干燥保藏法干燥、低温、无氧，有保护剂各大类>5~15年繁而高效液氮保藏法超低温（－196℃），有保护剂各大类>15年繁而高效7种常用菌种保藏方法的比较方法主要措施适宜菌种保藏期评价斜面21菌种保藏机构Ex：美国的标准菌种保藏所（ATCC）美国农业部农业研究服务部（ARS）英国国立标准菌种保藏所（NCTC）我国：1

普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）2农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）3工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）4医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）5抗生素菌种保藏管理中心（CACC）6兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）菌种保藏机构22任务1-7

菌种的保藏任务1-7

菌种的保藏23一、菌种保藏的目的

①菌种存活，不丢失，不污染

②防止优良性状丧失

③随时为生产、科研提供优良菌种一、菌种保藏的目的24二、菌种保藏的原理：首先，选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等）其次，创造微生物代谢不活波，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等）

再次，添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏过程中细胞受伤。二、菌种保藏的原理：首先，选用优良的纯种（最好是休眠体，如分25三、菌种保藏的方法斜面保藏法穿刺保藏法沙土管干燥保藏法真空冷冻保藏法液氮保藏法低温保藏法三、菌种保藏的方法斜面保藏法26斜面低温保藏法方法：接种适宜斜面培养基→培养→4℃保藏原理：低温下，微生物代谢强度明显下降适用：各大类保藏期：3-6个月缺点：保存期短，传代多，易退化斜面低温保藏法27菌种保藏的方法课件28

半固体穿刺保藏法方法：适宜半固体→培养→4℃保藏原理：缺氧、低温适用：好气性细菌，酵母等保藏期：6-12个月步骤：用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，至培养基的1/2处，待微生物生长良好后覆盖2-3mm无菌液体石蜡.石蜡可防止培养基失水又隔绝氧气,降低代谢.但不适用于可以石蜡为碳源的微生物.半固体穿刺保藏法29菌种保藏的方法课件30

砂土管干燥保藏法方法：将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土管，然后接种保藏。原理：无营养，缺氧，干燥适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有芽孢的细菌保藏期：2-10年或更长砂土管干燥保藏法31河沙60目筛弃去大颗粒及杂质80目筛去掉细沙吸铁石吸去铁质10％～20％的盐酸浸泡24h去除有机物水洗至中性烘干或晒干土：取地面下40～60cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，100目过筛，水洗至中性，烘干。

将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，121℃高压间歇灭菌2-3次，烘干备用。孢子或芽孢悬液→加入无菌砂土管中→干燥→封口→4-6℃保藏步骤：沙：河沙60目筛弃去大颗粒及杂质80目筛去掉细沙吸铁石吸去铁质132无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。沙土管恢复培养无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出33真空冷冻干燥保藏法：方法：菌种培养→用保护剂悬浮→加入安醅管中→低温冻结（-25—-40℃）→抽真空→真空封口→4-5℃保藏措施：低温、干燥，缺氧，保护剂适用：各大类保藏期：5-10年或更长真空冷冻干燥保藏法：方法：菌种培养→用保护剂悬浮→34步骤1安瓿管的处理

直径8-10mm，长度不小于100mm，洗净高压灭菌备用。2保护剂

低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖类、蛋白质等。常用的是脱脂奶和血清。3菌悬液制备

最适培养条件、生长后期。产孢子的微生物须适当延长培养时间以获得成熟的孢子。4冷冻干燥5安瓿管的保藏

4-5℃保藏步骤1安瓿管的处理直径8-10mm，长度不小于100m35复苏方法：——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，——将安瓿管顶部烧热，——用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，——用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。复苏方法：36菌种保藏的方法课件37

液氮超低温保藏法方法：菌悬液→加入保护剂→分装至安醅管中（0.2-1cm菌悬液）→逐步降温至-25℃→液氮罐（-196℃）保藏措施：低温、加保护剂（10%甘油）适用：范围广泛保藏期：一般2～3年，长则9年。液氮超低温保藏法方法：菌悬液→加入保护剂→分装至38菌种的准备可采用下列几种方法：刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内；将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约5-10毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。菌种的准备可采用下列几种方法：39复苏方法：

从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。复苏方法：40菌种冻存管菌种冻存管41四、菌种保藏的注意事项菌种在保藏前所处的状态：孢子或芽孢菌种保藏所用的基质：碳源操作过程对细胞结构的损害四、菌种保藏的注意事项菌种在保藏前所处的状态：孢子或芽孢427种常用菌种保藏方法的比较方法主要措施适宜菌种保藏期评价斜面低温保藏法低温（4℃）各大类约1～6月简便冰箱保藏法（半固体）低温（4℃），避氧细菌，酵母菌约6～12月简便液体石蜡封藏法低温（4℃），阻氧各大类约1～2年简便砂土干燥保藏法干燥，无营养产孢子的微生物约1～10年简便有效甘油悬液保藏法低温（－70℃），保护剂（15～50％甘油）细菌，酵母菌约10年较简便冷冻干燥保藏法干燥、低温、无氧，有保护剂各大类>5~15年繁而高效液氮保藏法超低温（－196℃），有保护剂各大类>15年繁而高效7