高效液相色谱法-课程课件

6.高效液相色谱法《仪器分析》精品课程组6.高效液相色谱法《仪器分析》精品课程组16.1概述6.2高效液相色谱仪6.1概述一、高效液相色谱法简介高效液相色谱法起源于经典液相色谱法，它是现代分析化学中最重要的分离分析方法之一。直到20世纪60年代后期，才产生了具有现代意义的高效液相色谱。高效液相色谱是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术。国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。一、高效液相色谱法简介二、液相色谱分离原理及分类

和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相，即固定相和流动相组成。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。

二、液相色谱分离原理及分类

按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质（分离机理）的不同，液相色谱可分为：分配色谱：——分配系数吸附色谱：——吸附力离子交换色谱：——离子交换能力凝胶色谱（体积排阻色谱）：——分子大小而引起的体积排阻按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质（三、高效液相色谱法的特点

高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物，以及生物活性物质和多种天然产物。其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。三、高效液相色谱法的特点高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g,荧光检测器—10-11g。高效液相色谱与经典液相色谱法比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。高效液相色谱与气相色谱法比较分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物；HP9.2高效液相色谱仪

高效液相色谱仪是实现液相色谱分析的仪器设备，自1967年问世以来，由于使用了高压输液泵、全多孔微粒填充柱以及高灵敏的检测器，实现了对样品的高速、高效和高灵敏的分离测定。9.2高效液相色谱仪高效液相色谱仪是实高效液相色谱法的分析流程高效液相色谱法的分析流程一、高压输液系统贮液器作用：提供足够数量的符合要求的流动相以完成分析任务。要求（1）必须具有足够的容积；（2）脱气方便；（3）能耐一定的压力；（4）所用材质对所使用的溶剂都是惰性的。注意（1）溶剂在放入贮液罐之前，必须经过滤膜过滤，以除去溶剂中的机械杂质；（2）溶剂在使用前必须脱气。一、高压输液系统2.高压输液泵作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱分离系统。要求（1）能耐化学腐蚀；（2）能在高压下连续工作；（3）输出流量稳定，无脉冲，重复性高；（4）适用于梯度洗脱。类型（1）恒压泵：输出无脉动，对检测器噪声低。但流速不够稳定。（2）恒流泵：泵的内体积小，适于梯度洗脱。

2.高压输液泵3.过滤器在高压输液泵的进口和它的出口与进样阀之间，应设置过滤器。4.梯度洗脱装置梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。3.过滤器（1）根据梯度装置所能提供的流路个数分为：二元梯度、三元梯度等；（2）依据溶液混合的方式分为：高压梯度和低压梯度。高压梯度，一般只用于二元梯度。精度很高，易于自动化控制。但必须使用两台高压输液泵，仪器价格昂贵，故障率亦相对较高。低压梯度，只需一台高压输液泵，成本低廉，使用方便。（1）根据梯度装置所能提供的流路个数分为：二元梯度、三元梯度二、进样器进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，要求：密闭性好，死体积小，重复性好，进样引起色谱分离系统的压力和流量波动要小。1.隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。二、进样器2.高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由定量管控制，因此进样准确，重复性好，如图。装入样品出口泵入溶剂采样环进色谱柱进样2.高压进样阀：目前最常用的为六通阀。装入样品出口泵入溶剂采3.自动进样器

由计算机自动控制定量阀，按预先编好的样品注射程序进行工作。取样、进样、复位、管路清洗等，可全部自动完成。一次可完成几十个、上百个样品的分析。3.自动进样器三、色谱柱

担负分离作用的色谱柱是色谱仪的心脏。通常要求色谱柱的柱效要高，选择性要好，分析速度要快。常用分析柱的柱内径一般在2～5mm，也有用内径小于1mm的细柱，柱长一般在15～50cm。用于半制备或制备目的的色谱柱内径一般在6mm以上。三、色谱柱色谱柱的维护使用预柱保护分析柱。大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2～7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围。避免流动相组成及极性的剧烈变化。流动相使用前必须经脱气和过滤处理。如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕后将柱子冲洗干净，并保存于乙腈中。压力升高是需要更换预柱的信号。色谱柱的维护使用预柱保护分析柱。四、检测器1.作用将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，以完成定性、定量分析的任务。2.分类（1）通用型检测器如折光指数（示差折光）检测器、电导检测器和蒸发光散射检测器等。（2）专用型如紫外检测器、荧光检测器、安培检测器等。四、检测器3.对检测器的要求（1）具有高灵敏度和可预测的响应，响应线性范围宽；（2）对样品中所有组分都有响应，适用范围广，响应速度快；（3）温度和流动相流速的变化对响应没有影响；3.对检测器的要求（4）响应与流动相的组成无关，可作梯度洗脱；（5）死体积小，不造成柱外谱带扩展；（6）使用方便、可靠、耐用、易清洗和维修；（7）不破坏样品组成；（8）能对被检测的峰提供定性和定量信息。（4）响应与流动相的组成无关，可作梯度洗脱；4.紫外检测器紫外检测器是目前液相色谱中应用最广泛的检测器。在HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广，几乎所有的液相色谱装置中都配有紫外检测器。紫外检测器实际上是一个紫外光度计，有分光（可变波长式）与不分光（固定波长式）两种。4.紫外检测器

紫外检测器结构简单，应用范围光，具有很高的灵敏度，检测限可达10-9g/mL，此外，该检测器对温度和流速变化不敏感，可用于梯度洗提。缺点在于：不适用于对紫外光完全不吸收的试样，且溶剂的选择受限制（对紫外光有吸收的溶剂不能使用）。紫外检测器结构简单，应用范围光，具有很高的灵5.示差折光检测器5.示差折光检测器

示差折光检测器为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。其主要缺点是：对温度变化敏感，故检测器的控温精度应在±10-3℃。且该检测器不适于梯度洗提。示差折光检测器为通用型检测器，灵敏度为10-6.光电二极管阵列检测器（PDA）光电二极管阵列检测器一般认为是目前液相色谱最有发展、最好的检测器。光电二极管阵列检测器，获得的检测信号是在全部紫外波段上的色谱信号。因此PDA得到的不是一般意义上的色谱图，而是具有三维空间的立体色谱光谱图。6.光电二极管阵列检测器（PDA）波长可的松氟美松皮质酮快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图波长可的松氟美松皮质酮快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测五、液相色谱仪的使用1.惠普1100液相色谱仪的使用（录像）2.测定邻苯二甲酸酯的含量（录像）五、液相色谱仪的使用6.高效液相色谱法《仪器分析》精品课程组6.高效液相色谱法《仪器分析》精品课程组306.1概述6.2高效液相色谱仪6.1概述一、高效液相色谱法简介高效液相色谱法起源于经典液相色谱法，它是现代分析化学中最重要的分离分析方法之一。直到20世纪60年代后期，才产生了具有现代意义的高效液相色谱。高效液相色谱是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术。国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。一、高效液相色谱法简介二、液相色谱分离原理及分类

和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相，即固定相和流动相组成。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。

二、液相色谱分离原理及分类

按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质（分离机理）的不同，液相色谱可分为：分配色谱：——分配系数吸附色谱：——吸附力离子交换色谱：——离子交换能力凝胶色谱（体积排阻色谱）：——分子大小而引起的体积排阻按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质（三、高效液相色谱法的特点

高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物，以及生物活性物质和多种天然产物。其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。三、高效液相色谱法的特点高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g,荧光检测器—10-11g。高效液相色谱与经典液相色谱法比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。高效液相色谱与气相色谱法比较分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物；HP9.2高效液相色谱仪

高效液相色谱仪是实现液相色谱分析的仪器设备，自1967年问世以来，由于使用了高压输液泵、全多孔微粒填充柱以及高灵敏的检测器，实现了对样品的高速、高效和高灵敏的分离测定。9.2高效液相色谱仪高效液相色谱仪是实高效液相色谱法的分析流程高效液相色谱法的分析流程一、高压输液系统贮液器作用：提供足够数量的符合要求的流动相以完成分析任务。要求（1）必须具有足够的容积；（2）脱气方便；（3）能耐一定的压力；（4）所用材质对所使用的溶剂都是惰性的。注意（1）溶剂在放入贮液罐之前，必须经过滤膜过滤，以除去溶剂中的机械杂质；（2）溶剂在使用前必须脱气。一、高压输液系统2.高压输液泵作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱分离系统。要求（1）能耐化学腐蚀；（2）能在高压下连续工作；（3）输出流量稳定，无脉冲，重复性高；（4）适用于梯度洗脱。类型（1）恒压泵：输出无脉动，对检测器噪声低。但流速不够稳定。（2）恒流泵：泵的内体积小，适于梯度洗脱。

2.高压输液泵3.过滤器在高压输液泵的进口和它的出口与进样阀之间，应设置过滤器。4.梯度洗脱装置梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。3.过滤器（1）根据梯度装置所能提供的流路个数分为：二元梯度、三元梯度等；（2）依据溶液混合的方式分为：高压梯度和低压梯度。高压梯度，一般只用于二元梯度。精度很高，易于自动化控制。但必须使用两台高压输液泵，仪器价格昂贵，故障率亦相对较高。低压梯度，只需一台高压输液泵，成本低廉，使用方便。（1）根据梯度装置所能提供的流路个数分为：二元梯度、三元梯度二、进样器进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，要求：密闭性好，死体积小，重复性好，进样引起色谱分离系统的压力和流量波动要小。1.隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。二、进样器2.高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由定量管控制，因此进样准确，重复性好，如图。装入样品出口泵入溶剂采样环进色谱柱进样2.高压进样阀：目前最常用的为六通阀。装入样品出口泵入溶剂采3.自动进样器

由计算机自动控制定量阀，按预先编好的样品注射程序进行工作。取样、进样、复位、管路清洗等，可全部自动完成。一次可完成几十个、上百个样品的分析。3.自动进样器三、色谱柱

担负分离作用的色谱柱是色谱仪的心脏。通常要求色谱柱的柱效要高，选择性要好，分析速度要快。常用分析柱的柱内径一般在2～5mm，也有用内径小于1mm的细柱，柱长一般在15～50cm。用于半制备或制备目的的色谱柱内径一般在6mm以上。三、色谱柱色谱柱的维护使用预柱保护分析柱。大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2～7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围。避免流动相组成及极性的剧烈变化。流动相使用前必须经脱气和过滤处理。如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕后将柱子冲洗干净，并保存于乙腈中。压力升高是需要更换预柱的信号。色谱柱的维护使用预柱保护分析柱。四、检测器1.作用将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，以完成定性、定量分析的任务。2.分类（1）通用型检测器如折光指数（示差折光）检测器、电导检测器和蒸发光散射检测器等。（2）专用型如紫外检测器、荧光检测器、安培检测器等。四、检测器3.对检测器的要求（1）具有高灵敏度和可预测的响应，响应线性范围宽；（2）对样品中所有组分都有响应，适用范围广，响应速度快；（3）温度和流动相流速的变化对响应没有影响；3.对检测器的要求（4）响应与流动相的组成无关，可作梯度洗脱；（5）死体积小，不造成柱外谱带扩展；（6）使用方便、可靠、耐用、易清洗和维修；（7）不破坏样品组成；（8）能对被检测的峰提供定性和定量信息。（4）响应与流动相的组成无关，可作梯