第十二章-遗传工程-课件

第十二章遗传工程ppt课件第十二章遗传工程ppt课件1第十二章-遗传工程-课件2第十二章-遗传工程-课件3第十二章-遗传工程-课件4第二节基因的分离基因分离（克隆）包括3个步骤：1.目标DNA片段（基因）的分离2.目标基因克隆到载体上3.载体导入宿主细胞并在其中大量复制第二节基因的分离5一、工具酶1、限制性内切核酸酶

限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列的磷酸二脂酶Ⅰ型酶：仅EcoB和EcoK两种，催化限制性切割和修饰核苷酸2种功能Ⅱ型酶：遗传工程中应用最广泛Ⅲ型酶：具有特异的识别位点，识别位点是非对称的

一、工具酶6Ⅱ型限制性酶的基本特性：①有特异识别和切割的序列部位②DNA分子上两个单链断裂的部位通常不是直接相对的③断裂所形成的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末端）④内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催化所完成，即内切酶活性和甲基化作用活性是分开的

Ⅱ型限制性酶的基本特性：7限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接

回纹序列限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接回纹序列8图12-1通过用相同的限制性内切酶切割形成一个重组DNA分子

第十二章-遗传工程-课件9限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点平齐末端限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点平齐末端102、DNA连接酶

DNA连接酶是重组DNA分子构建必不可少的工具酶，能催化DNA中相邻的3’–OH和5’–磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来2、DNA连接酶113、反转录酶

反转录酶是一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，故又称依赖于RNA的DNA聚合酶通常用反转录酶构建cDNA文库（cDNAlibrary）

3、反转录酶124、聚合酶链式反应(PCR)

PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的Mullis(1986)发明,1993年诺贝尔化学奖

PCR可对特定DNA片段进行扩增，且可用痕量DNA作模板，对DNA纯度要求也不高,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝PCR反应在一种混合液中进行，该混合液包括四种主要成分：两个引物（一般为20bp）、模板DNA、热稳定的DNA聚合酶（Taq酶，在95℃甚至更高的温度下活性稳定）和四种脱氧核苷酸。PCR反应在PCR仪上自动进行4、聚合酶链式反应(PCR)13PCR反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤：1）变性：95℃，DNA双链分离成单链2）退火(复性)：55℃左右，引物与单链的模板DNA序列互补结合3）延伸：72℃左右，Taq酶通过在引物的3’-OH端增加碱基的办法使引物延伸PCR反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤：14表12-2PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系循环数PCR产物拷贝数12125253210210102415215327682022010485762522533554432302301073741824表12-2PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系循环数15二、载体1、重组DNA技术重组DNA：指利用不同生物来源的DNA分子拼接的杂种DNA分子，是自然界中不存在的DNA分子重组DNA技术是基因克隆的关键技术，其主要步骤为：1)从细胞或组织获得DNA并纯化2)用限制酶切割DNA3)将获得的限制片段连接到载体上,形成重组DNA分子4)重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内复制，产生大量相同拷贝的重组DNA分子--克隆5)克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收，纯化6)克隆的DNA可以转录和翻译，其产品可以被分离出来用于研究或商业开发。

二、载体16图12-5重组DNA技术流程图12-5重组DNA技术流程172、载体

载体：将外源基因送入受体细胞的工具载体类型：细菌质粒、噬菌体或病毒、细菌/酵母菌人工染色体BAC、YAC等载体特点：①在宿主细胞中能独立复制，即本身为复制子，有独立的复制起始位点②有限制酶切位点，允许外源基因插入且插入后随载体DNA分子一同进行复制或扩增③有选择标记，便于选择含重组DNA分子的寄主细胞④分子量小，多拷贝，易于操作⑤具有安全性等2、载体18

（1）细菌质粒：广泛应用于基因工程图12-6质粒PUC18的结构及多克隆位点

（1）细菌质粒：广泛应用于基因工程图12-6质粒PUC119Ti质粒及其衍生载体Ti质粒包括五个区域，1.LB与RB之间的T-DNA，这段序列整合到植物基因组中；2.质粒转移区(PT)；3.冠瘿碱代谢区；4.复制原点；5.毒性区。

Ti质粒及其衍生载体20→T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。→Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。→T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺21Ti质粒是约150-200kb的环状DNA分子，很难直接使用，故需对其加以改造，构建出Ti质粒的衍生载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体：（1）双元载体(binaryvectors）如pBin19载体，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及α-互补显色标记（2）共整合载体(integratedvectors)

Ti质粒是约150-200kb的环状DNA分子，很难直接使用22（2）噬菌体载体1、噬菌体；

2、噬菌体DNA；

3、噬菌体DNA中间基因簇；4、将连接物体外包装后感染细菌，制备基因库（用于基因库构建）（2）噬菌体载体23（3）克隆大片段DNA的载体

粘粒载体克隆外源片段的长度在15~45kb之间（3）克隆大片段DNA的载体24细菌人工染色体(BAC)上述的几种载体都不能携带大于50kb的外源DNA片段，而很多真核生物基因长度在50kb以上。细菌人工染色体载体就是为克隆更大的外源DNA片段而设计构建的图12-9细菌人工染色体载体pBAC108L及其多克隆位点。可插入达300kb左右的DNA片段细菌人工染色体(BAC)图12-9细菌人工染色体载体pBA25酵母人工染色体（YAC）YAC载体可以插入大片段的DNA（1-2Mb），成为人类基因组计划（HGP）的一种重要工具

酵母人工染色体（YAC）26三、基因分离方法一个基因就是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子。利用DNA重组技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。分离与鉴定基因是DNA重组中的关键步骤之一。

三、基因分离方法271、基于文库的基因分离方法基因文库(library)：是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因文库（1）构建基因文库

基因组文库：使用与切割质粒相同的限制性内切酶，将供体生物体的基因组DNA切成许多片段，然后将其连接到载体上构成的一个重组DNA群体cDNA文库：以mRNA为模板，在反转录酶作用下，合成cDNA，将其与适当载体连接并转化到宿主细胞内进行扩增构建成的基因库。克隆特定基因

1、基于文库的基因分离方法28（2）筛选基因库大多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库如：筛选λ噬菌体构建的库常利用菌落杂交法：将经重组噬菌体(来自基因库)感染的宿主细菌细胞与培养基混合后，倒在培养皿中，培养过夜，形成噬菌斑

（2）筛选基因库29

图12-11菌落杂交技术

图12-11菌落杂交技术30（3）阳性克隆的分析与鉴定

从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能得到目的基因生物信息分析功能预测、功能鉴定（3）阳性克隆的分析与鉴定312、T-DNA标签克隆基因

利用T-DNA插入突变创造突变体，获取目标基因或克隆T-DNA载体构建转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子筛选T2，获突变子，应为3:1分离确定T-DNA与突变型共分离的个体

产生纯合后代克隆T-DNA两侧的植物DNA利用侧翼DNA序列作探针从cDNA文库中钓取基因

基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）图12-12T-DNA标签克隆基因的基本原理

2、T-DNA标签克隆基因T-DNA载体构建转化植物（T323、基于PCR的基因克隆

PCR可在数小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝，可代替一些经载体克隆基因的方法。其原理是根据待扩增基因的序列合成引物，使两个引物序列之间的基因序列获得大量扩增，产生大量的基因拷贝用于研究

4、基因的人工合成

对于已知核苷酸序列、分子量较小的基因可以通过化学合成法制备基因。一般先一段一段地合成，然后将这些小片段连接起来。人工合成基因可以由DNA自动合成仪来完成3、基于PCR的基因克隆33四、重组DNA分子四、重组DNA分子34第三节外源基因的导入一、农杆菌介导的遗传转化1、根癌农杆菌(Ti质粒)

第三节外源基因的导入352、发根农杆菌(Ri质粒)发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根(发状根)Ri质粒的结构与Ti质粒的结构很相似，可以分为T区、vir区、ori区和其它区域等几个部分。T区与Ti质粒的T-DNA十分相似，包括①T区的左右边界序列;②TL-DNA区;③TR-DNA区。

2、发根农杆菌(Ri质粒)36图12-15棉花转基因植株生产过程F1.共培养2.在选择培养基上筛选3.筛选获得的抗性愈伤5.胚萌发成苗6.转基因植株移栽大田4.抗性愈伤分化成胚状体图12-15棉花转基因植株生产过程F1.共培养2.在选37二、农杆菌介导的遗传转化

基因枪法\生物弹法\微粒枪法\微粒轰击法依赖高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术。基因枪法是继农杆菌介导法之后又一应用较广的遗传转化技术。其优点是该方法无宿主限制，可以对任何基因型材料进行转化研究

二、农杆菌介导的遗传转化基因枪法\生物弹法\微粒枪法\微38第四节转基因生物的检测与鉴定

PCRSouthernblotNorthernblotWesternblot性状（表型）鉴定第四节转基因生物的检测与鉴定39第十二章-遗传工程-课件40M12

3456

789PCRSouthernblotM1234567841第十二章-遗传工程-课件42第五节基因工程的应用一、基因工程的应用1、转基因植物抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆的优良品系或品种，很多已经大面积种植推广。2002年5000万公顷：大豆、玉米、棉花、水稻、马铃薯、番茄、小麦等第五节基因工程的应用432、转基因动物：羊、牛2、转基因动物：羊、牛44

3、基因工程工业

生产胰岛素等

在细菌中产生胰岛素的方法在细菌中产生胰岛素的方法454、遗传疾病诊断RFLP法（镰刀性贫血病）

4、遗传疾病诊断465、基因治疗

利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病基因治疗的载体和重组DNA分子

5、基因治疗基因治疗的载体和重组DNA分子476、DNA芯片

DNA芯片(DNAchips)是将核酸分子杂交的原理和方法,与半导体技术结合而发展形成的一门新技术6、DNA芯片48二、安全问题

1、转基因植物成为杂草2、导致新的病虫害，威胁生物多样性3、食品安全性二、安全问题49第十二章遗传工程ppt课件第十二章遗传工程ppt课件50第十二章-遗传工程-课件51第十二章-遗传工程-课件52第十二章-遗传工程-课件53第二节基因的分离基因分离（克隆）包括3个步骤：1.目标DNA片段（基因）的分离2.目标基因克隆到载体上3.载体导入宿主细胞并在其中大量复制第二节基因的分离54一、工具酶1、限制性内切核酸酶

限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列的磷酸二脂酶Ⅰ型酶：仅EcoB和EcoK两种，催化限制性切割和修饰核苷酸2种功能Ⅱ型酶：遗传工程中应用最广泛Ⅲ型酶：具有特异的识别位点，识别位点是非对称的

一、工具酶55Ⅱ型限制性酶的基本特性：①有特异识别和切割的序列部位②DNA分子上两个单链断裂的部位通常不是直接相对的③断裂所形成的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末端）④内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催化所完成，即内切酶活性和甲基化作用活性是分开的

Ⅱ型限制性酶的基本特性：56限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接

回纹序列限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接回纹序列57图12-1通过用相同的限制性内切酶切割形成一个重组DNA分子

第十二章-遗传工程-课件58限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点平齐末端限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点平齐末端592、DNA连接酶

DNA连接酶是重组DNA分子构建必不可少的工具酶，能催化DNA中相邻的3’–OH和5’–磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来2、DNA连接酶603、反转录酶

反转录酶是一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，故又称依赖于RNA的DNA聚合酶通常用反转录酶构建cDNA文库（cDNAlibrary）

3、反转录酶614、聚合酶链式反应(PCR)

PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的Mullis(1986)发明,1993年诺贝尔化学奖

PCR可对特定DNA片段进行扩增，且可用痕量DNA作模板，对DNA纯度要求也不高,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝PCR反应在一种混合液中进行，该混合液包括四种主要成分：两个引物（一般为20bp）、模板DNA、热稳定的DNA聚合酶（Taq酶，在95℃甚至更高的温度下活性稳定）和四种脱氧核苷酸。PCR反应在PCR仪上自动进行4、聚合酶链式反应(PCR)62PCR反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤：1）变性：95℃，DNA双链分离成单链2）退火(复性)：55℃左右，引物与单链的模板DNA序列互补结合3）延伸：72℃左右，Taq酶通过在引物的3’-OH端增加碱基的办法使引物延伸PCR反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤：63表12-2PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系循环数PCR产物拷贝数12125253210210102415215327682022010485762522533554432302301073741824表12-2PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系循环数64二、载体1、重组DNA技术重组DNA：指利用不同生物来源的DNA分子拼接的杂种DNA分子，是自然界中不存在的DNA分子重组DNA技术是基因克隆的关键技术，其主要步骤为：1)从细胞或组织获得DNA并纯化2)用限制酶切割DNA3)将获得的限制片段连接到载体上,形成重组DNA分子4)重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内复制，产生大量相同拷贝的重组DNA分子--克隆5)克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收，纯化6)克隆的DNA可以转录和翻译，其产品可以被分离出来用于研究或商业开发。

二、载体65图12-5重组DNA技术流程图12-5重组DNA技术流程662、载体

载体：将外源基因送入受体细胞的工具载体类型：细菌质粒、噬菌体或病毒、细菌/酵母菌人工染色体BAC、YAC等载体特点：①在宿主细胞中能独立复制，即本身为复制子，有独立的复制起始位点②有限制酶切位点，允许外源基因插入且插入后随载体DNA分子一同进行复制或扩增③有选择标记，便于选择含重组DNA分子的寄主细胞④分子量小，多拷贝，易于操作⑤具有安全性等2、载体67

（1）细菌质粒：广泛应用于基因工程图12-6质粒PUC18的结构及多克隆位点

（1）细菌质粒：广泛应用于基因工程图12-6质粒PUC168Ti质粒及其衍生载体Ti质粒包括五个区域，1.LB与RB之间的T-DNA，这段序列整合到植物基因组中；2.质粒转移区(PT)；3.冠瘿碱代谢区；4.复制原点；5.毒性区。

Ti质粒及其衍生载体69→T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。→Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。→T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺70Ti质粒是约150-200kb的环状DNA分子，很难直接使用，故需对其加以改造，构建出Ti质粒的衍生载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体：（1）双元载体(binaryvectors）如pBin19载体，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及α-互补显色标记（2）共整合载体(integratedvectors)

Ti质粒是约150-200kb的环状DNA分子，很难直接使用71（2）噬菌体载体1、噬菌体；

2、噬菌体DNA；

3、噬菌体DNA中间基因簇；4、将连接物体外包装后感染细菌，制备基因库（用于基因库构建）（2）噬菌体载体72（3）克隆大片段DNA的载体

粘粒载体克隆外源片段的长度在15~45kb之间（3）克隆大片段DNA的载体73细菌人工染色体(BAC)上述的几种载体都不能携带大于50kb的外源DNA片段，而很多真核生物基因长度在50kb以上。细菌人工染色体载体就是为克隆更大的外源DNA片段而设计构建的图12-9细菌人工染色体载体pBAC108L及其多克隆位点。可插入达300kb左右的DNA片段细菌人工染色体(BAC)图12-9细菌人工染色体载体pBA74酵母人工染色体（YAC）YAC载体可以插入大片段的DNA（1-2Mb），成为人类基因组计划（HGP）的一种重要工具

酵母人工染色体（YAC）75三、基因分离方法一个基因就是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子。利用DNA重组技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。分离与鉴定基因是DNA重组中的关键步骤之一。

三、基因分离方法761、基于文库的基因分离方法基因文库(library)：是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因文库（1）构建基因文库

基因组文库：使用与切割质粒相同的限制性内切酶，将供体生物体的基因组DNA切成许多片段，然后将其连接到载体上构成的一个重组DNA群体cDNA文库：以mRNA为模板，在反转录酶作用下，合成cDNA，将其与适当载体连接并转化到宿主细胞内进行扩增构建成的基因库。克隆特定基因

1、基于文库的基因分离方法77（2）筛选基因库大多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库如：筛选λ噬菌体构建的库常利用菌落杂交法：将经重组噬菌体(来自基因库)感染的宿主细菌细胞与培养基混合后，倒在培养皿中，培养过夜，形成噬菌斑

（2）筛选基因库78

图12-11菌落杂交技术

图12-11菌落杂交技术79（3）阳性克隆的分析与鉴定

从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能得到目的基因生物信息分析功能预测、功能鉴定（3）阳性克隆的分析与鉴定802、T-DNA标签克隆基因

利用T-DNA插入突变创造突变体，获取目标基因或克隆T-DNA载体构建转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子筛选T2，获突变子，应为3:1分离确定T-DNA与突变型共分离的个体

产生纯合后代克隆T-DNA两侧的植物DNA利用侧翼DNA序列作探针从cDNA文库中钓取基因

基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）图12-12T-DNA标签克隆基因的基本原理

2、T-DNA标签克隆基因T-DNA载体构建转化植物（T813、基于PCR的基因克隆

PCR可在数小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝，可代替一些经载体克隆基因的方法。其原理是根据待扩增基因的序列合成引物，使两个引物序列之间的基因序列获得大量扩增，产生大量的基因拷贝用于研究

4、基因的人工合成

对于已知核苷酸序列、分子量较小的基因可以通过化学合成法制备基因。一般先一段一段地合成，然后将这些小片段连接起来。人工合成基因可以由DNA自动合成仪来完成3、基于PCR的基因克隆82四、重组DNA分子四、重组DNA分子83第三节外源基因的导入一、农杆菌介导的遗传转化1、根癌农杆菌(Ti质粒)

第三节外源基因的导入842、发根农杆菌(Ri质粒)发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根(