高中生物竞赛：蛋白组学 第二章 第二节蛋白质的电泳分离技术课件

1第二章:蛋白质的电泳分离技术蛋白组学课程之第二节实验仪器部分2实验仪器－电泳设备IPGphorTMisoelectricfocusingsystemHoeferSE600(standardvertical)EPS601PowerSupply3IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3~10不同值的缓冲体系。实验仪器－胶条槽、干胶条4实验仪器-其它设备紫外分光光度计离心机脱色摇床5蛋白质一向电泳试剂提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。平衡缓冲液：1.5MTris-Cl6.7ml(pH8.8)，尿素72.07g，87％的甘油69ml，SDS4g，溴酚蓝少许。溶涨液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚蓝少许溶于无菌水中，总体积为25ml。使用之前再加入IPG缓冲液0.5ul/100ul，DTT1.5ul/100ul。实验试剂6蛋白质二向电泳试剂

丙烯酰胺单体储液：丙烯酰胺60g，甲叉双丙烯酰胺1.6g，溶于无菌水中，总体积200ml

分离胶缓冲液：Trisbase181.5g，溶于750ml无菌水中，调PH8.8，总体积1000ml10％SDS：5gSDS溶于无菌水中，总体积50ml10％过硫酸铵：0.1g溶于无菌水中，总体积1mlSDS电泳缓冲液：Tris-base15.1g，甘氨酸72.1g，SDS5g，溶于无菌水中，总体积5000ml

封胶溶液：SDS电泳缓冲液100ml，琼脂糖0.5g，溴酚蓝少许实验试剂7蛋白质定量（Bradford方法）试剂

Bradford储存液：100ml95％乙醇；200ml88％磷酸；350mgServaG蓝，室温下长期保持稳定。

Bradford工作液：425ml双蒸水；15ml95％乙醇；30ml88％磷酸；30mlBradford储存液滤纸过滤，棕色瓶中室温保存，可保存数周，但在使用前需要过滤。

1mg/ml牛血清蛋白（BSA）实验试剂8蛋白质样品制备蛋白质定量（Bradford法）蛋白质分离获得感兴趣蛋白质组分双向电泳实验流程样品的制备一向等电聚焦一向等电聚焦到二向电泳的平衡SDS电泳凝胶的染色凝胶的图像处理分析9（1）取植物材料放入预冷研钵后，加入液氮，充分研磨至粉末状。（2）于1.5mL离心管中加入3倍体积的提取缓冲液，将粉末加入到离心管中，混匀后在-20℃的条件下过夜。（3）4℃，40000g，离心1hr，弃上清。(4）使沉淀重悬浮于等体积的预冷丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇）中，4℃，40000g，离心1hr（可重复一次）。（5）真空干燥沉淀。（6）将沉淀用最小体积的裂解液充分溶解，其间可漩涡振荡助溶。（7）15℃，40000g，离心1hr，上清即为获得的蛋白质样品，可分装放入-80℃备用，临时保存可在4℃。（8）Brandford法蛋白定量。实验步骤－蛋白质样品制备101．上样：一般采取加样品溶涨法，取大约30-60μg的蛋白与溶胀液混合，总体积为250μL。蛋白与溶胀液混合物加入胶条槽从酸性端去掉胶条的保护膜放置胶条：胶条酸性端（尖端）朝胶条槽阳极（尖端）方向放入胶条槽，慢慢下压，最后放下胶条碱性端（平端），使溶液浸湿整个胶条，避免生成气泡。在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。将胶条槽平放于IPGphor仪器上，与水平方向垂直，如是多个胶条槽注意相互平行实验步骤－一向等电聚焦112．第一向等电聚焦设置IPGphor仪器的运行参数。工作温度20℃，每胶条最大电流50μA，以下为电压设定情况：电压（V）升压模式电泳时间30Step-n-hold12hr200Step-n-hold1hr500Step-n-hold1hr1000Step-n-hold1hr8000Gradient3hr3．一向到二向胶条的平衡将胶条放入10mL平衡缓冲液Ⅰ中（含1%DTT）封口，在摇床上振荡15min。将胶条取出放入10mL平衡缓冲液Ⅱ中（含2.5%碘乙酰胺）封口，在摇床上振荡15min。去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几min，以去除多余的液体。实验步骤一向等电聚焦1213144．二向电泳（SDS）（1）灌胶模具的安装：按仪器说明书装好灌胶模具。（2）凝胶浓度确定：根据预分离蛋白质分子量范围确定需配置的凝胶浓度，主要指分离胶浓度（表4-3-1）。一般实验中多采用浓度10％或12.5%的分离胶及浓度为5％的浓缩胶，制胶参照下表。表分离胶和浓缩胶的配制药品浓度10％12.5%5％单体储液13.3mL16.7mL1.064mL分离胶缓冲液10mL10mL－浓缩胶缓冲液－－2mL10×SDS0.4mL0.4mL0.4mL无菌水16.1mL12.8mL4.8mL10％过硫酸铵200μL200μL80μLTEMED13.3μL13.3μL40μL实验步骤－二向SDS1516（3）灌注分离胶：按配比配制分离胶，配制完成后即可加入到制作好的制胶模具中，该过程需均匀注入，防止产生气泡，同时动作要迅速。灌注一定量的分离胶后迅速注入水覆盖在凝胶溶液上层，将“三明治”充满。（4）分离胶凝结后会形成清晰的胶平面，此时可参照浓缩胶配方配制浓缩胶。（5）灌注浓缩胶：倒掉覆盖液，注入浓缩胶。（6）放入平衡好的胶条，并用琼脂糖封顶。实验步骤－二向SDS17（7）将固定制胶模具与底座的凸轮取下，用其将上层电泳槽与凝胶模具连接。按照顺序依次固定好电泳设备。（8）将灌注好的制胶模具放入到盛有1SDS电泳液的电泳槽中，然后在制胶模具内注入1SDS电泳液，上槽电泳液为新配制的，约需1L，下槽电泳液可为回收的电泳缓冲液，一般需4L。（9）电泳：可选择恒压或恒流方式，通常SDS-PAGE电泳条件为浓缩胶部分为100V，50mA，约30min，分离胶部分为250V，50mA大约需要3hr，电泳温度为15℃。（10）凝胶的检测：当溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳，取下胶放入染色盒中进行染色。实验步骤－二向SDS18固定：25ml冰醋酸，100ml甲醇，125ml去离子水，60min。敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸钠（使用之前加入），

17g醋酸钠，165ml去离子水，30min。清洗：250ml去离子水清洗3次每次5min。银染：0.625g硝酸银，250去离子水，（使用之前配制）

20min。显色：6.25g碳酸钠，100ul的甲醛（使用之前加入），250ml

去离子水。终止：5%的醋酸。（整个操作在摇床上进行）扫描分析。实验步骤－凝胶染色（硝酸银染色）1920凝胶图像的扫描图像加工斑点检测和定量凝胶配比数据分析数据呈递和解释2-DE数据库的建立分析软件：ImageMaster2Dplatinumversion5.0实验步骤－凝胶的图像分析21导入凝胶图像22凝胶图像选点23设置