全柱成像毛细管电泳cIEF课件

全柱成像毛细管电泳（cIEF-WCID）:新一代毛细管电泳技术蛋白质药物快速表征的利器全柱成像毛细管电泳（cIEF-WCID）:蛋白质药物快速表征1报告内容报告内容2毛细管等电聚焦（CapillaryIsoelectricFocusing,cIEF）：一种根据蛋白质等电点pI不同而进行分离的技术。cIEF是蛋白质等两性分子分析最有力的工具之一，是生物实验室被广泛应用的分析技术。传统的cIEF的问题：需移动条带分析速度慢(40min)分辨率下降聚焦时间不易优化方法开发时间长重复性不佳CEInfinite:全柱成像等电聚焦系统毛细管等电聚焦（CapillaryIsoelect3AdvancedElectrophoresisSolutions,LtdCambridge,Ontario,CanadaCEInfiniteCEInfinite：毛细管电泳等电聚焦--全柱成像检测技术（cIEF-WCID）AES(AdvancedElectrophoresisSolutions,Ltd.)

——专注于全柱检测高效毛细管电泳技术（CE）的研发AdvancedElectrophoresisSolut4

CEInfinite将UV的点光源转换为线光源均匀地分布在长度为5cm的分离柱上，整个聚焦过程大约5-10min，聚焦过程中蛋白质在分离柱内的任何变化都能通过动态检测器（CMOS照相机）得到实时的成像检测。CEInfinite将UV的点光源转换为线光源5CEInfinite(10min)传统cIEF(40min)离子交换(60min)GELIEF(400min)CEInfinite的优势省去移动过程，缩短分析时间快速分析（<10min）；保持cIEF的高分辨率；

复杂蛋白质的分离和

pI点的测定变得异常轻松；超高通量和出色的重复性；蛋白质pI点测定的黄金技术！CEInfinite传统cIEF离子交换GELIE6CEInfinite的优势蛋白分析过程全程可视蛋白药物的动态聚焦过程CMOS照相技术，全程成像显示蛋白聚焦或变化过程；蛋白分离方法开发更简单；

彻底颠覆了传统电泳技术在

蛋白质表征中的定义！CEInfinite的优势蛋白分析过程全程可视蛋白药物的动7CEInfinite的优势快速开发蛋白分离方法

快速

-5-12min聚焦时间方法优化简单-Ampholytes-Urea-FocusingtimeCEInfinite的优势快速开发蛋白分离方法

快速8

多种不同涂层的分离柱（FC/DB/PA），满足不同蛋白的分离需求涂层均匀稳定，寿命长久，分辨率高，重复性好多种内径：100um、180um、200um200um内径减少蛋白凝聚，不易发生堵塞，灵敏度更高、更快的进样速度50次进样的重复性200µmid100µmidpH10pH3CEInfinite的优势高灵敏度的毛细管柱

多种不同涂层的分离柱（FC/DB/PA），满足不同蛋白的分9

AES公司自主研发的两性电解质，共两个系列，10种pH范围HR3-10、2.5-5、5-8、6-9、8-10.5，适用于一般蛋白的分离SH3-10、2.5-5、5-8、6-9、8-10.5，适用于复杂蛋白，如融合蛋白、ADC等有效成分高、低蛋白吸附、pH梯度线性好、280nm背景吸收低。Aeslyte超高的分辨率CEInfinite的优势完善的两性电解质载体Aeslyte8-10.5Servalyte9-11

AES公司自主研发的两性电解质，共两个系列，10种pH范10Ampholytes,cartrigecoatingandmarkerscanbecustomizedCEInfinite的优势-相对于市面上同种类仪器Ampholytes,cartrigecoating11CEInfinite的优势-相对于市面上同种类仪器Morestableauto-samplerCEInfinite的优势-相对于市面上同种类仪器Mor12CIEFofamonoclonalantibodywithCEInfinite1%HRpH3-10and3%HR5-8CIEFofamonoclonalantibody13CIEFofanantibodydrugconjugate(ADC)withCEInfinite

2%HRpH3-10and2%SH8-10.5CIEFofanantibodydrugconju14CIEFofafusionproteinwithSH4-8

CIEFofafusionproteinwith15CIEFofhemoglobinAFSCwithdifferentpHrangeCAsCIEFofhemoglobinAFSCwithd16SHpH4-8SHpH5.5-7CIEFoffusionproteinwithdifferentpHrangeCAsSHpH4-8SHpH5.5-7CIEFoffu17

AES公司自主研发的pI标记物，数量多达29种，pI范围2.8-10.5小分子pI标记物，pI标示准确、稳定性好每0.5

pH单位有一对Marker,有足够的Marker和样品峰尽量靠近，保证pI校正的重复性和准确性。2.8510.497.057.06.616.145.855.915.124.647.558.187.658.48.718.799.339.469.7710.17.4pI标记物CEInfinite的优势宽范围覆盖的pI标记物

AES公司自主研发的pI标记物，数量多达29种，pI范围18报告内容报告内容19全柱成像cIEF技术作为一种创新的等电聚焦方法，可以应用于蛋白质或其他两性物质等电点的测定，等电点的测定可精确至0.01个pH单位。在生物制药厂的实验室里，全柱成像cIEF可应用于药物研发、细胞株筛选、生产过程分析、药物制剂研究分析、药物稳定性研究以及最终产品的质量控制分析。

单克隆抗体重组蛋白疫苗等电点测定及异质性表征：CEInfinite:抗体药物表征的利器全柱成像cIEF技术作为一种创新的等电聚焦方法，可20

根据蛋白质电荷特性的差异可区分鉴别蛋白，因此通过测定蛋白质的等电点，可以部分地确定蛋白质的属性。通过对所分离的不同蛋白变异株的定量，可评估其异质性。某单克隆抗体的全柱成像cIEF结果IEF条件：蛋白浓度：0.4mg/mlCA：4%HRpH3-10电场：600V/minUrea：4mol/L聚焦时间：5min蛋白质pI测定根据蛋白质电荷特性的差异可区分鉴别蛋白，因此通过测定蛋21

在生产和纯化过程中，蛋白质能表现出多种电荷异质性改变，这些变化不仅影响药物的稳定性，也影响活性，而且还可能导致有害的免疫反应。所以，开发和生产过程中蛋白药物的电荷异异构体的分析非常关键。蛋白质药物和抗体药物的电荷异质性表征在生产和纯化过程中，蛋白质能表现出多种电荷异质性改变，22药物差异化表征3种不同的IgG：人源与鼠源差异明显药物差异化表征3种不同的IgG：人源与鼠源差异明显23HSA:厂家1HSA:厂家2HSA:厂家3国内3厂家的人血清白蛋白HSAHSA:厂家1HSA:厂家2HSA:厂家3国内24细胞株筛选标准对照细胞株1细胞株2细胞株3细胞株4细胞株5细胞株筛选标准对照细胞株1细胞株2细胞株3细胞株4细25蛋白质药物的稳定性研究在25℃、40℃、65℃

三个Incubation温度条件下，目标蛋白质构象保持稳定，四个电荷异构体的CIEF-WCID电泳图没有明显差异；在25℃、40℃、65℃

三个Incubation温度条件下，四个电荷异构体的pI值完全一致，说明在65oC的高温下，蛋白质没有变性，其构象稳定。

每个温度下的样品重复二次分析，其重复性出色，pI值测定的RSD<1%。25oC40oC65oC1234蛋白质药物的稳定性研究在25℃、40℃、65℃三个Inc26将Incubation温度持续提高到75℃，研究发现其CIEF-WCID的电泳图发生显著改变（与25-65℃），意味着蛋白质发生明显变性，其构象完全改变，75℃为其构象改变的临界温度；

在75℃的温度下，与25-65℃相比，四个主要电荷异构体的峰消失，形成一个“宽包”峰（pI范围7.4-8.3），整体pI点向酸性位移；在75℃的温度下，整体pI点向酸性位移，意味着蛋白质变性，更多的酸性功能基团暴露。65oC75oC将Incubation温度持续提高到75℃，研究发现27定量分析mAb定量分析mAb28ADCADC29FusionProteinFusionProtein30报告内容报告内容31PreparativecIEFcIEF-WCIDtandemMSAES独有专利技术在完成cIEF-WCID聚焦分离后，在移动聚焦蛋白区带的过程中，分辨率不会发生明显的降低AES在生物制药和蛋白质组学研究中的重要突破PreparativecIEFAES独有专利技术AES在32SchematicofCEInfinitescanningimagingpreparativeCIEFPreparativeCIEFwithCEInfiniteproprietarycartridges(patentpending)allowsthefocusedpeakstobetransferredintoindividualcollectionvialsorionsourcesofmassspectrometers(MS)forfurtherstructurebasedcharacterization.ProteinPeakTransferSchematicofCEInfinitescanni33PreparativescanningimagingCIEFhemoglobinAFSCindividualpeakcollection1.PreparativecIEF----StepA:FractionationPreparativescanningimagingC34CIEFconfirmationofindividualpeakcollectionPreparativecIEF----StepB:cIEFconfirmationCIEFconfirmationofindividua352.cIEF-WCIDtandemMS:newbreakthroughforproteinidentification2.cIEF-WCIDtandemMS:newbr36报告内容报告内容37

生物大分子、蛋白质-药物之间的相互作用能够直接反应其功能和活性机制。相互作用的研究在蛋白质药物和疫苗药物的研发和生产中起到非常重要作用，不仅能够阐明治病机理、药理机理，而且对于蛋白质药物的质量控制和生产工艺起到决定性的作用。CEInfinite:抗体药物表征的利器WuXZ,HuangTM.etal.,JournalofMicrocolumnSeparation.,13,322-326,2001生物大分子、蛋白质-药物之间的相互作用能够直接反应其功38ProteinControlProtein-Compound1Protein-Compound2pI7.30pI7.26pI7.30pI7.32

蛋白质-小分子药物1：Protein从单一峰分叉变成两个峰，很清楚的表明相互作用的产生。此复合物的pI向碱性区域移动0.02pI单位，标志着由于相互作用，蛋白质构象发生改变，其表面负电荷被遮蔽，正电荷密度增强（推测次此小分子可能为碱性药物）。而且，所加入的小分子药物的摩尔比偏低，蛋白质没有发生完全作用（原型蛋白被部分保留)，继续加大小分子药物浓度，可能会观察到多作用靶点的存在（多个复合物的峰)；初步推测此相互作用是动态可逆过程；蛋白质-小分子药物2：与Control相比，仍然保持单一峰，但其pI为7.26，向酸性区域移动0.04pI单位，标志着由于相互作用，蛋白质构象发生改变，其表面正电荷被遮蔽，负电荷密度增强（推测次此小分子可能为酸性药物）。而且由于原型蛋白基本消失，表明蛋白质和小分子药物完全发生反应形成复合物，而且形成复合物的速度（K值）大于其解离速度，由于复合物的峰较宽，而且存在肩峰，推测存在多靶点的相互作用，从而产生多重蛋白质-小分子药物的复合物。ProteinControlProtein-Compoun39Proteinmoleculecomplex*Protein*pI9.33**********CalculationofKdandkon,koffcanbedonewithanovelmethod.MakeproteinandsmallmoleculesolutioninIEFsolutionwithproteinat0.0001M,andsmallmoleculeat0.0001M.TheincreaseofproteinpeakanddecreaseofproteincomplexwereobservedintheE-gram.0S67S134S201S302SKoffCalculationmethodforKDTheinitialproteinconcentrationwas0.0001M,andsmallmoleculeat0.0001M.Theequilibriumproteinconcentrationcanbecalculated0.00009M.Theequilibriumsmallmoleculeconcentrationwascalculated0.00009M.TheKdcanbecalculatedtobe8.110-4M,andKb1.2103M-1The

applicationwascooperatedwithRockDan’sGroupfromAmgen,Seattle.Proteinmoleculecomplex*Prot40CEInfinite:研发新进展TemperaturecontroloftheseparationchamberinCEInfiniteC01CGECartridgedevelopment.WholecolumnfluorescencedetectionCEinstrumentwithCMOSsensorHighresolutionproteinfractionationSupernarrowrangecarrierampholytesCarrierampholytesfor214nmdetectionCEInfinite:研发新进展Temperaturec41CEInfinite:选择原因DatafromAEScanbeconsistentwithorbetterthanPSTheinstrumentcostsless(atleast200KRMB,20%less)Thecostperformanceofconsumableitemisperfect（330K

RMBless）Morestableauto-samplerHigherefficiencyofoperationAmpholytesandmarkerscanbecustomizedSoftwarecanmeetclient’srequirementStrongR&Dteam(alsoinapplication)WideapplicationslikeMSandprotein-proteininteractionCEInfinite:选择原因DatafromAES42GlobalusersofCEInfinite

GlobalusersofCEInfinite

43ThankYou!ThankYou!44全柱成像毛细管电泳（cIEF-WCID）:新一代毛细管电泳技术蛋白质药物快速表征的利器全柱成像毛细管电泳（cIEF-WCID）:蛋白质药物快速表征45报告内容报告内容46毛细管等电聚焦（CapillaryIsoelectricFocusing,cIEF）：一种根据蛋白质等电点pI不同而进行分离的技术。cIEF是蛋白质等两性分子分析最有力的工具之一，是生物实验室被广泛应用的分析技术。传统的cIEF的问题：需移动条带分析速度慢(40min)分辨率下降聚焦时间不易优化方法开发时间长重复性不佳CEInfinite:全柱成像等电聚焦系统毛细管等电聚焦（CapillaryIsoelect47AdvancedElectrophoresisSolutions,LtdCambridge,Ontario,CanadaCEInfiniteCEInfinite：毛细管电泳等电聚焦--全柱成像检测技术（cIEF-WCID）AES(AdvancedElectrophoresisSolutions,Ltd.)

——专注于全柱检测高效毛细管电泳技术（CE）的研发AdvancedElectrophoresisSolut48

CEInfinite将UV的点光源转换为线光源均匀地分布在长度为5cm的分离柱上，整个聚焦过程大约5-10min，聚焦过程中蛋白质在分离柱内的任何变化都能通过动态检测器（CMOS照相机）得到实时的成像检测。CEInfinite将UV的点光源转换为线光源49CEInfinite(10min)传统cIEF(40min)离子交换(60min)GELIEF(400min)CEInfinite的优势省去移动过程，缩短分析时间快速分析（<10min）；保持cIEF的高分辨率；

复杂蛋白质的分离和

pI点的测定变得异常轻松；超高通量和出色的重复性；蛋白质pI点测定的黄金技术！CEInfinite传统cIEF离子交换GELIE50CEInfinite的优势蛋白分析过程全程可视蛋白药物的动态聚焦过程CMOS照相技术，全程成像显示蛋白聚焦或变化过程；蛋白分离方法开发更简单；

彻底颠覆了传统电泳技术在

蛋白质表征中的定义！CEInfinite的优势蛋白分析过程全程可视蛋白药物的动51CEInfinite的优势快速开发蛋白分离方法

快速

-5-12min聚焦时间方法优化简单-Ampholytes-Urea-FocusingtimeCEInfinite的优势快速开发蛋白分离方法

快速52

多种不同涂层的分离柱（FC/DB/PA），满足不同蛋白的分离需求涂层均匀稳定，寿命长久，分辨率高，重复性好多种内径：100um、180um、200um200um内径减少蛋白凝聚，不易发生堵塞，灵敏度更高、更快的进样速度50次进样的重复性200µmid100µmidpH10pH3CEInfinite的优势高灵敏度的毛细管柱

多种不同涂层的分离柱（FC/DB/PA），满足不同蛋白的分53

AES公司自主研发的两性电解质，共两个系列，10种pH范围HR3-10、2.5-5、5-8、6-9、8-10.5，适用于一般蛋白的分离SH3-10、2.5-5、5-8、6-9、8-10.5，适用于复杂蛋白，如融合蛋白、ADC等有效成分高、低蛋白吸附、pH梯度线性好、280nm背景吸收低。Aeslyte超高的分辨率CEInfinite的优势完善的两性电解质载体Aeslyte8-10.5Servalyte9-11

AES公司自主研发的两性电解质，共两个系列，10种pH范54Ampholytes,cartrigecoatingandmarkerscanbecustomizedCEInfinite的优势-相对于市面上同种类仪器Ampholytes,cartrigecoating55CEInfinite的优势-相对于市面上同种类仪器Morestableauto-samplerCEInfinite的优势-相对于市面上同种类仪器Mor56CIEFofamonoclonalantibodywithCEInfinite1%HRpH3-10and3%HR5-8CIEFofamonoclonalantibody57CIEFofanantibodydrugconjugate(ADC)withCEInfinite

2%HRpH3-10and2%SH8-10.5CIEFofanantibodydrugconju58CIEFofafusionproteinwithSH4-8

CIEFofafusionproteinwith59CIEFofhemoglobinAFSCwithdifferentpHrangeCAsCIEFofhemoglobinAFSCwithd60SHpH4-8SHpH5.5-7CIEFoffusionproteinwithdifferentpHrangeCAsSHpH4-8SHpH5.5-7CIEFoffu61

AES公司自主研发的pI标记物，数量多达29种，pI范围2.8-10.5小分子pI标记物，pI标示准确、稳定性好每0.5

pH单位有一对Marker,有足够的Marker和样品峰尽量靠近，保证pI校正的重复性和准确性。2.8510.497.057.06.616.145.855.915.124.647.558.187.658.48.718.799.339.469.7710.17.4pI标记物CEInfinite的优势宽范围覆盖的pI标记物

AES公司自主研发的pI标记物，数量多达29种，pI范围62报告内容报告内容63全柱成像cIEF技术作为一种创新的等电聚焦方法，可以应用于蛋白质或其他两性物质等电点的测定，等电点的测定可精确至0.01个pH单位。在生物制药厂的实验室里，全柱成像cIEF可应用于药物研发、细胞株筛选、生产过程分析、药物制剂研究分析、药物稳定性研究以及最终产品的质量控制分析。

单克隆抗体重组蛋白疫苗等电点测定及异质性表征：CEInfinite:抗体药物表征的利器全柱成像cIEF技术作为一种创新的等电聚焦方法，可64

根据蛋白质电荷特性的差异可区分鉴别蛋白，因此通过测定蛋白质的等电点，可以部分地确定蛋白质的属性。通过对所分离的不同蛋白变异株的定量，可评估其异质性。某单克隆抗体的全柱成像cIEF结果IEF条件：蛋白浓度：0.4mg/mlCA：4%HRpH3-10电场：600V/minUrea：4mol/L聚焦时间：5min蛋白质pI测定根据蛋白质电荷特性的差异可区分鉴别蛋白，因此通过测定蛋65

在生产和纯化过程中，蛋白质能表现出多种电荷异质性改变，这些变化不仅影响药物的稳定性，也影响活性，而且还可能导致有害的免疫反应。所以，开发和生产过程中蛋白药物的电荷异异构体的分析非常关键。蛋白质药物和抗体药物的电荷异质性表征在生产和纯化过程中，蛋白质能表现出多种电荷异质性改变，66药物差异化表征3种不同的IgG：人源与鼠源差异明显药物差异化表征3种不同的IgG：人源与鼠源差异明显67HSA:厂家1HSA:厂家2HSA:厂家3国内3厂家的人血清白蛋白HSAHSA:厂家1HSA:厂家2HSA:厂家3国内68细胞株筛选标准对照细胞株1细胞株2细胞株3细胞株4细胞株5细胞株筛选标准对照细胞株1细胞株2细胞株3细胞株4细69蛋白质药物的稳定性研究在25℃、40℃、65℃

三个Incubation温度条件下，目标蛋白质构象保持稳定，四个电荷异构体的CIEF-WCID电泳图没有明显差异；在25℃、40℃、65℃

三个Incubation温度条件下，四个电荷异构体的pI值完全一致，说明在65oC的高温下，蛋白质没有变性，其构象稳定。

每个温度下的样品重复二次分析，其重复性出色，pI值测定的RSD<1%。25oC40oC65oC1234蛋白质药物的稳定性研究在25℃、40℃、65℃三个Inc70将Incubation温度持续提高到75℃，研究发现其CIEF-WCID的电泳图发生显著改变（与25-65℃），意味着蛋白质发生明显变性，其构象完全改变，75℃为其构象改变的临界温度；

在75℃的温度下，与25-65℃相比，四个主要电荷异构体的峰消失，形成一个“宽包”峰（pI范围7.4-8.3），整体pI点向酸性位移；在75℃的温度下，整体pI点向酸性位移，意味着蛋白质变性，更多的酸性功能基团暴露。65oC75oC将Incubation温度持续提高到75℃，研究发现71定量分析mAb定量分析mAb72ADCADC73FusionProteinFusionProtein74报告内容报告内容75PreparativecIEFcIEF-WCIDtandemMSAES独有专利技术在完成cIEF-WCID聚焦分离后，在移动聚焦蛋白区带的过程中，分辨率不会发生明显的降低AES在生物制药和蛋白质组学研究中的重要突破PreparativecIEFAES独有专利技术AES在76SchematicofCEInfinitescanningimagingpreparativeCIEFPreparativeCIEFwithCEInfiniteproprietarycartridges(patentpending)allowsthefocusedpeakstobetransferredintoindividualcollectionvialsorionsourcesofmassspectrometers(MS)forfurtherstructurebasedcharacterization.ProteinPeakTransferSchematicofCEInfinitescanni77PreparativescanningimagingCIEFhemoglobinAFSCindividualpeakcollection1.PreparativecIEF----StepA:FractionationPreparativescanningimagingC78CIEFconfirmationofindividualpeakcollectionPreparativecIEF----StepB:cIEFconfirmationCIEFconfirmationofindividua792.cIEF-WCIDtandemMS:newbreakthroughforproteinidentification2.cIEF-WCIDtandemMS:newbr80报告内容报告内容81

生物大分子、蛋白质-药物之间的相互作用能够直接反应其功能和活性机制。相互作用的研究在蛋白质药物和疫苗药物的研发和生产中起到非常重要作用，不仅能够阐明治病机理、药理机理，而且对于蛋白质药物的质量控制和生产工艺起到决定性的作用。CEInfinite:抗体药物表征的利器WuXZ,HuangTM.etal.,JournalofMicrocolumnSeparation.,13,322-326,2001生物大分子、蛋白质-药物之间的相互作用能够直接反应其功82ProteinControlProtein-Compound1Protein-Compound2pI7.30pI7.26pI7.30pI7.32

蛋白质-小分子药物1：Protein从单一峰分叉变成两个峰，很清楚的表明相互作用的产生。此复合物的pI向碱性区域移动0.02pI单位，标志着由于相互作用，蛋白质构象发生改变，其表面负电荷被遮蔽，正电荷密度增强（推测次此小分子可能为碱性药物）。而且，所加入的小分子药物的摩尔比偏低，蛋白质没有发生完全作用（原型蛋白被部分保留)，继续加大小分子药物浓度，可能会观察到多作用靶点的存在（多个复合物的峰)；初步推测此相互作用是动态可逆过程；蛋白质-小分子药物2：与Control相比，仍然保持单一峰，但其pI为7.26，向酸性区域移动0.04pI单位，标志着由于相互作用，蛋白质构象发生改变，其表面正电荷被遮蔽，负电荷密度增强（推测次此小分子可能为酸性药物）。而且由于原型蛋白基本消失，表明蛋白质和小分子药物完全发生反应形成复合物，而且形成复合物的速度（K值）大于其解离速度，由于复合物的峰较宽，而且存在肩峰，推测存在多靶点的相互作用，从而产生多重蛋白质-小分子药物的复合物。ProteinControlProtein-Compoun83Proteinmoleculecomplex*Protein*pI9.33**********CalculationofKdandkon,koffcanbedonewithanovelmethod.