现代生命科学的发展与人类的生存

第4节核酸的研究方法

生命科学与化学学院安建平教授联系电话836252413893853252

一、核酸的分离、提纯和定量测定

二、核酸的超速离心

三、核酸的凝胶电泳

四、核酸的核苷酸序列测定

五、DNA聚合酶链式反应

六、DNA的化学合成目录一、核酸的分离、提纯和

定量测定

（一）DNA的分离

（二）RNA的分离

（三）核酸含量的测定法（一）DNA的分离真核生物中的染色体DNA与碱性蛋白（组蛋白）结合成核蛋白（DNP)形式存在于核内。DNP溶于水和浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但不溶于生理盐溶液（0.14molmol/L氯化钠）。利用这一性质，可将细胞破碎后用浓盐溶液提取，然后用水稀释至0.14mol/L盐溶液，使DNP纤维沉淀出来。使其缠绕在玻璃棒上，再溶解和沉淀多次以纯化。用苯酚抽提，除去蛋白质。苯酚是很强的蛋白质变性剂，用水饱和的苯酚与DNP一起振荡，冷冻离心，DNA溶于上层水相，不溶性变性蛋白质残留物位于中间界面，一部分变性蛋白质停留在酚相。如此操作反复多次以除净蛋白质。将含DNA的水相合并，在有盐存在的条件下加2倍体积冷的乙醇，可将DNA沉淀出来。用乙醚和乙醇洗沉淀。用此方法可以得到纯的DNA。用氯仿一辛醇（或异戊醇）与DNP溶液振荡，借助表面变性除去蛋白质，反复多次直至得到不含蛋白质的DNA。此操作过程与苯酚法相似。为了得到大分子DNA，避免核酸酶和机械振荡对DNA的降解，在细胞悬液中直接加入2倍体积含1%（SDS)的缓冲溶液，并加入广谱蛋白酶（如蛋白酶K)最后浓度达100ug/mL，在65℃保温4h，蛋白质全部降解，然后用苯酚抽提，除净蛋白酶和蛋白质的部分降解产物。DNA制品中的少量RNA可用纯的RNase分解除去。此方法现在比较常用。氯化铯密度梯度离心（cesiumchloridedensitygradientcentrifugation）也是实验室制备高质量DNA常用的方法。（二）RNA的分离RNA比DNA更不稳定，而且RNase又无处不在，因此RNA的分离更为困难。制备RNA通常需要注意3点：①所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙烤，塑料用具经过高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.196焦碳酸二乙酰（DEPC）处理，再煮沸以除净DEPC。DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性。②在破碎细胞的同时加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活。③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin)。目前最常用的制备RNA方法有两个：其一，用酸性胍盐／苯酚／氯仿抽提。异硫氰胍是极强烈的蛋白质变性剂，它几乎使所有遇到的蛋白质都被变性。然后用苯酚和氯仿多次除净蛋白质。此法用于小量制备RNA。其二，用胍盐／氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心。蛋白质密度<1.33g/cm3,在最上层。DNA密度在1.71g/cm3左右，位于中间。RNA密度>1.89g/cm3，沉在底部。用此方法可制备较大量高纯度的天然RNA。分离poly(A)十mRNA通常采用寡聚胸腺嘧啶核苷酸(oligo(dT)，）亲和层析法。用寡聚（dT)纤维素柱或寡聚（dT）琼脂糖凝胶柱吸附mRNA，洗涤后用低离子强度缓冲液回收mRNA，得到较高质量的制品。不同功能RNA常分布于细胞的不同部位，分离这些RNA常需先用差速离心法，将细胞核、线粒体、叶绿体、胞质体等各部分分开，再从这些部分中分离出RNA.（三）核酸含量的测定法1.紫外分光光度法

2.定磷法

3.定糖法

4.生物材料的处理2.定磷法法磷的测定最最常用的是是钼蓝比色色法。此法法需先用浓浓硫酸或过过氯酸将有有机磷水解解成无机磷磷。在酸性性条件下正正磷酸与钼钼酸作用生生成磷钼酸酸，在还原原剂存在下下被还原成成钼蓝，其其最大吸收收峰在660nm处，在一一定范围内内溶液光密密度与磷含含量成正比比，据此可可以计算出出核酸含量量。3.定糖法法定糖法常用用的也是比比色法。当当RNA与与盐酸共热热时核糖转转变为糠醛醛，它与甲甲基苯二酚酚（地衣酚酚）反应呈呈鲜绿色，，最大吸收收峰在670nm处，反应应需要三氯氯化铁作催催化剂。DNA在酸酸性溶液中中与二苯胺胺共热，其其脱氧核糖糖可参与反反应生成蓝蓝色化合物物，最大吸吸收峰在595nm处。此外外，还有一一些比色反反应也可给给出灵敏的的结果。4.生物材料料的处理理细胞或组组织中核核酸含量量的测定定需要先先对生物物材料作作一定的的处理，，以便定定量提取取出核酸酸的成分分。组织织预先处处理的目目的是除除去酸溶溶性含磷磷化合物物及脂溶溶性含磷磷化合物物。常用用冷的5%～10%过过氯酸(PCA)或三三氯乙酸酸（TCA）处处理粉碎碎的生物物材料，，抽提液液为酸溶溶性部分分，包括括核苷酸酸，及相相对分子子质量小小的寡核核苷酸等等。再将将残留物物用有机机溶剂（（如乙醇醇、乙醚醚、氯仿仿等）除除去脂溶溶性含磷磷物质。。抽提液液中，主主要是磷磷脂类物物质。留留下的残残渣为不不溶于酸酸的非脂脂类含磷磷化合物物，包括括DNA、RNA、蛋蛋白质及及少量其其他含磷磷化合物物。二、核酸酸的超速速离心

1.核酸酸的密度度测定

2.测定定DNA中G-C含含量

3.溶液液中核酸酸构象的的研究

4.用于于核酸的的制备1.核酸酸的密度度测定以测定DNA浮浮力密度度为例。。将8.0mol几几的氯化化铯溶液液装人离离心杯中中，DNA样品品溶于氯氯化铯溶溶液，装装在离心心杯顶部部。开动动离心机机，以每每分钟45000转的的速度运运转16h以以上。此此时离心心杯中形形成线形形氯化铯铯密度梯梯度，自自杯底的的1.80g/cm3,到到顶部的的1.55g/cm3。当当DNA样品的的沉降速速度与扩扩散速度度达到平平衡状态态时，DNA形形成一稳稳定的区区带，漂漂浮于氯氯化铯密密度梯度度中的一一定位置置上。此此时DNA所处处的位置置上的氯氯化铯密密度等于于DNA的浮力力密度。。可以用用公式直直接计算算出DNA的浮浮力密度度。不过更方方便的办办法是应应用1一一2个已已知其浮浮力密度度的标准准DNA样品作作参考，，与未知知样品一一起离心心。待达达到平衡衡后，通通过离心心机上的的光学系系统测定定DNA与转头头的中心心轴之间间的距离离，按下下式计算算出未知知DNA的浮力力密度：：ρ＝ρ0＋4.2ω2（γ2一γ02）×10-10式中：ρρ为未知知DNA的密度度，ρ0为标准DNA的的密度，，ω为角角速度（（弧度／／秒），，γ为未未知DNA与转转轴之间间的距离离，γ0为已知DNA的的距离。。2.测定定DNA中G-C含含量G-C碱碱基对比比A-T碱基对对之密度度大，因因为G-C对中中有3个个氢键。。所以含含G-C对多的的DNA，浮力力密度大大，含G-C对对少的DNA，，浮力密密度小。。而且G-C的的百分含含量与DNA的的浮力密密度之间间呈正比比关系。。因此用用这个方方法能迅迅速而精精确地测测定DNA的碱碱基成分分。Rolfe-Meselson导出了了如下计计算公式式：ρ＝0.100xG-C＋1.6583.溶液液中核酸酸构象的的研究RNA只只有局部部双螺旋旋结构，，它的浮浮力密度度比双链链DNA高。双双链DNA又比比蛋白质质的密度度高。双双螺旋DNA受受热变性性后成为为单链，，密度增增高。核核酸的不不同构象象具有不不同的浮浮力密度度，可利利用此技技术研究究核酸的的构象变变化及其其动力学学过程。。4.用于于核酸的的制备应用溴化化乙锭一一氯化铯铯密度梯梯度平衡衡超离心心，很容容易将不不同构象象的DNA,RNA及蛋白白质分开开。这个个方法是是目前实实验室中中纯化质质粒DNA时最最常用的的方法。。如果应应用垂直直转头，，每分钟钟65000转转（BeckmanL一70超离离心机）），只要要6h可可以完成成分离工工作。但但是如果果采用角角转头，，转速为为每分钟钟45000转时，，则需16h。。离心完完毕后，，离心管管中各种种成分的的分布可可以在紫紫外光照照射下显显示得一一清二楚楚（图15一2),蛋蛋白质漂漂浮在最最上面，，RNA沉淀在在底部，，超螺旋旋DNA沉降较较快，开开环及线线型DNA沉降降较慢。。经染料-氯化铯密度梯度超离心后，质粒DNA及各种杂质的分布超螺旋DNA闭环质粒DNA开环质及线型DNA蛋白质石蜡油用注射针针头从离离心管侧侧面在闭闭环质粒粒DNA区带部部位刺人人，收集集这一区区带的DNA,用异戊戊醇抽提提收集到到的DNA以除除去染料料，然后后透析除除去CsCI，，再用苯苯酚抽提提1-2次，即即可用乙乙醇将DNA沉沉淀出来来。这样样得到的的DNA有很高高的纯度度，可供供DNA重组，，测定序序列及限限制酶图图谱等之之用。在在少数情情况下，，需要特特别纯的的DNA时，可可以将此此DNA样品再再进行一一次氯化化铯密度度梯度超超离心分分离。三、核酸酸的凝胶胶电泳

（一）脂脂糖电泳泳

（二）聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳（一）脂脂糖电泳泳

1.影响响电泳迁迁移率因因素

2.DNA分析析

3.DNA分分子片断断的测定定

4.样品品的回收收1.影响响电泳迁迁移率因因素（1）核核酸分子子大小迁迁移率与与相对分分子质量量对数成成反比；；（2）胶胶浓度迁迁移率与与胶浓度度成反比比，常用用1%胶胶分离DNA;（3）DNA的的构象一一般条件件下超螺螺旋DNA的迁迁移率最最快，线线型DNA其次次，开环环DNA最慢。。但在胶胶中加人人过多的的澳化乙乙锭时，，上述分分布次序序会发生生改变；；（4）电电压一般般采用5V/cm,在在适当的的电压差差范围内内，迁移移率与电电压大小小成正比比；（5）碱碱基组成成有一定定影响，，但影响响不大；；（6）温温度4--30℃都可可以，常常在室温温进行，，电流量量过大时时凝胶温温度升高高，溶液液蒸发，，会造成成电泳异异常。2.DNA分析析电泳完毕毕后，将将胶在荧荧光染料料溴化乙乙锭的水水溶液中中染色(0.5ug/mL）。溴溴化乙锭锭为一扁扁平分子子，很易易插人DNA中中的碱基基对之间间。DNA与溴溴化乙锭锭结合后后，经紫紫外光照照射，可可发射出出红一橙橙色可见见荧光。。1ngDNA即可用用此法检检出，所所以此方方法十分分灵敏。。根据荧荧光强度度可以大大体判断断DNA样品的的浓度。。若在同同一胶上上加一已已知浓度度的DNA作参参考，则则所测得得的样品品浓度更更为准确确。可以以用灵敏敏度很高高的负片片将凝胶胶上所呈呈现的电电泳图谱谱在紫外外光照射射下拍摄摄下来，，作进一一步分析析与长期期保留之之用。3.DNA分分子片断断的测定定应用凝胶胶电泳可可以正确确地测定定DNA片段的的分子大大小。实实用的方方法是在在同一胶胶上加一一已知其其相对分分子质量量的样品品（如图图15-3中的的ADNA/Hind皿的的片段））。电泳泳完毕后后，经澳澳化乙锭锭染色，，照相，，从照片片上比较较待测样样品中的的DNA片段与与标准样样品中的的哪一条条带最接接近，即即可推算算出未知知样品中中各片段段的大小小。目前前许多试试剂公司司都能提提供各种种不同相相对分子子质量的的标准样样品。4.样品品的回收收胶上某一一区带在在紫外光光照射下下，切割割下来，，将切下下的胶条条放在透透析袋中中，装上上电泳液液，在水水平电泳泳槽中进进行电泳泳，让胶胶上的DNA释释放出来来并进一一步粘在在透析袋袋内壁上上，电泳泳3-4h后后，将电电极倒转转，再通通电30-60s，，粘在壁壁上的DNA重重又释放放到缓冲冲液中。。取出透透析袋内内的缓冲冲液（丢丢弃胶条条），用用苯酚抽抽提1一一2次，，水相用用乙醇沉沉淀。这这样回收收的DNA纯度度很高，，可供进进一步进进行限制制酶分析析、序列列分析或或作末端端标记。。回收率率在50%以上上。（二）聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳以聚丙烯烯酰胺作作支持物物。单体体丙烯酰酰胺在加加人交联联剂后，，就成聚聚丙烯酰酰胺。由由于这种种凝胶的的孔径比比琼脂糖糖胶要小小，所以以可用予予分析相相对分子子质量小小于1000bp的DNA片段段和RNA的电电泳。聚聚丙烯酰酰胺中一一般不含含有RNase，用于于RNA的分析析不会分分解样品品。但仍仍要留心心缓冲液液及其他他器皿中中所带的的RNase。。聚丙烯烯酰胺凝凝胺强度度较好，，常用垂垂直板电电泳。聚丙烯酰酰胺凝胶胶上的RNA样样品，经经溴化乙乙锭染色色，在紫紫外光照照射下，，也能发发出荧光光，但较较暗。这这是因为为RNA的双螺螺区较少少，其荧荧光远比比DNA为弱，，浓度很很低的样样品不能能用此法法检测出出来，需需要用亚亚甲蓝或或银染来来显示。。四、核酸酸的核苷苷酸序列列测定

1.Sanger等人人提出的的酶法（（双脱氧氧链终止止法）

2.Maxam和和Gilibert提提出的化化学降解解法比较常用用的是Sanger的的双脱氧氧链终止止法五、DNA聚聚合酶链链式反应应

1.概述述

2.步骤骤

3.应用用1.概述述聚合酶链链反应（（PCR）体外外扩增DNA已已成为应应用最广广泛的一一种生物物技术。。1985年K.Mullis在研研究DNA聚合合酶反应应时发明明了这项项技术。。最初采采用Klenow酶来来扩增DNA，，但每次次加热变变性DNA时都都会使酶酶失活，，需要重重新添加加DNA聚合酶酶，因此此使用不不方便。。1988年Saiki等人人用耐热热的TaqDNA聚聚合酶取取代Klenow酶之之后，才才使这项项技术成成熟，从从而得到到各方面面的应用用。2.步骤骤（1）设设计一对对引物以以便有效效扩增所所需要的的DNA序列，，并尽量量减少可可能产生生的非特特异产物物。（2）优优化反应应体系，，以便获获得最好好的扩增增效果。。该反应应体系应应包括适适量模板板(1ng～～0.001ng)，引物物（～100pmol/100ul））,4种种dNTP(200umol/L）TaqDNA聚聚合酶（（2u/100ul），，和适量量Mg（（0.05～5mmol/L)。（3）选选择3个个温度进进行热循循环。这这3个温温度为：：变性，，94℃℃，45～60s；；退火（（根据引引物与模模板的Tm值来来定，一一般为两两引物中中较低Tm值减减2），，1min；延伸伸，72℃，1min,开开始时热热变性5～10min，热热循环25，检检测扩增增结果。。最普通通的检测测方法是是进行凝凝胶电泳泳，用澳澳化乙锭锭染色，，在紫外外光下检检查结果果。PCR技技术十分分灵敏，，少数几几个模板板分子即即可检查查出来。。它的扩扩增效率率非常高高，通常常可扩增增106倍。其扩扩增产量量可按下下列公式式计算：：y＝（1＋x））ny＝产量量x＝扩增增效率n=循环环次数3.应用用（1）遗遗传病和和某些疑疑难病的的诊断以以及孕妇妇的产前前检查。。（2）病病原体的的检测。。某些恶恶性疾病病用一般般微生物物学、生生化和免免疫学技技术无法法查出病病原体时时，可用用PCR来检查查。（3）法法医和刑刑侦鉴定定。PCR可灵灵敏检测测出亲属属间的亲亲缘关系系，并对对生物残残留的痕痕量样品品进行鉴鉴定，因因此，对对刑侦极极为有用用。（4）癌癌基因的的检查。。（5）基基因探针针的制备备。（6）基基因组测测序、染染色体巡巡视。（7）cDNA库的构构建。（8）基基因突变变的分析析和定位位诱变。。（9）DNA重组。。（10））基因的的分离和和克隆。。六、DNA的的化学合成成随着基因工程程的发展，定定向地修改、、设计生物基基因组的日子子已经到来了了。快速合成成DNA片段段的方法显得得十分重要。。目前市场上上已有完全自自动化的固相相合成DNA片段的仪器器了。这种仪仪器可以在几几小时或一天天内合成出长长度为几十个个核苷酸或一一百多个核苷苷酸的DNA片段，供实实验室应用。。DNA固相合合成的原理如如下：全部反反应是按一个个不大的固相相柱子中进行行的。首先要要将待活化的的核苷酸上的的某些游离基基团保护（封封闭）起来，，使反应按设设计的方向进进行。5'-OH用二对对甲氧三苯甲甲基(DMT)保护，，碱基上的氨氨基用苯甲酸酸保护。然后后对3'-OH则用氨基基亚磷酸化合合物进行活化化。9、静夜四无无邻，荒居居旧业贫。。。12月-2212月-22Sunday,December25,202210、雨中黄叶叶树，灯下下白头人。。。08:08:4008:08:4008:0812/25/20228:08:40AM11、以我独沈沈久，愧君君相见频。。。12月-2208:08:4008:08Dec-2225-Dec-2212、故人江海海别，几度度隔山川。。。08:08:4008:08:4008:08Sunday,December25,202213、乍乍见见翻翻疑疑梦梦，，相相悲悲各各问问年年。。。。12月月-2212月月-2208:08:4008:08:40December25,202214、他乡乡生白白发，，旧国国见青青山。。。25十十二二月20228:08:40上上午08:08:4012月月-2215、比不不了得得就不不比，，得不不到的的就不不要。。。。十二月月228:08上上午午12月月-2208:08December25,202216、行动动出成成果，，工作作出财财富。。。2022/12/258:08:4008:08:4025December202217、做前，能能够环视四四周；做时时，你只能能或者最好好沿着以脚脚为起点的的射线向前前。。8:08:40上上午8:08上上午08:08:4012月-229、没有失败败，只有暂暂时停止成成功！。12月-2212月-22Sunday,December25,202210、很多事情情努力了未未必有结果果，但是不不努力却什什么改变也也没有。。。08:08:4008:08:4008:0812/25/20228:08:40AM11、成成功功就就是是日日复复一一日日那那一一点点点点小小小小努努力力的的积积累累。。。。12月月-2208:08:4008:08Dec-2225-Dec-2212、世间成事，，不求其绝对对圆满，留一一份不足，可可得无限完美美。。08:08:4008:08:4008:08Sunday,December25,202213、不知知香积积寺，，数里里入云云峰。。。12月月-2212月月-2208:08:4008:08:40December25,202214、意志志坚强强的人人能把把世界界放在在手中中像泥泥块一一样任任意揉揉捏。。25十十二二月20228:08:40上上午08:08:4012月月-2215、楚楚塞塞三三湘湘接接，，荆荆门门九九派派通