果蔬采后病理及病害的控制研究现状及发展趋势

果蔬采后病理及病害的控制研究现状及发展趋势摘要：本文主要对果蔬采后主要病原菌及侵染过程做了介绍，主要介绍了酵母类抗菌剂防病害的生物防治方法，并对微生物种类、拮抗机理及生物防治应用前景进行了介绍。关键词：采后病理；酵母菌类抗菌剂；病害侵染；微生物防治；1.前言影响食品食用安全性的最主要因素是化学农药残留。天然植物成分(精油和植物提取物)、生物药剂(酵母和细菌类拮抗菌)和非选择性生物杀菌剂(碳酸钠、碳酸氢钠、活性氯、山梨酸)等防治果蔬采后病害的技术已越来越受到关注。本文重点介绍微生物抗菌剂防治果蔬采后病害的一些研究进展。迄今为止，已从苹果、柑橘、梨、桃、猕猴桃等10余种水果中筛选出几十种拮抗微生物，目前商品化应用的主要有：丁香假单胞杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌中的季也蒙毕赤酵母菌、哈氏木霉、白粉寄生菌[1~2]。果蔬采后病害造成的腐烂损失十分巨大。据统计报道,发达国家为l0%～30%,发展中国家则高达40%～50%。长期以来防治果蔬采后病害主要依靠化学杀菌剂,然而,连续使用化学杀菌剂易使病原真菌产生抗药性,易造成环境污染,且危害公众健康。上世纪80年代中期开始,在农作物大田病害生物防治蓬勃发展的带动下,生物防治果蔬采后病害成为研究热点[3～4]。果实采后病原性腐败的生物防治技术是近年来国外发展起来的极具前途的绿色防腐技术，主要原理是利用微生物之间的拮抗作用，通过改变果实表面微生态环境，促进病原微生物拮抗菌的繁殖，达到抑制病原微生物生长，减少腐败的目的[1]该技术安全环保性能优越，越来越受到普遍欢迎可以预见，采用生物防治将是今后果蔬防腐保鲜技术的发展方向果蔬采后病害的生物防治因其无毒无害不污染环境，深受人们的重视与欢迎。2.果蔬采后主要病原菌及侵染过程2.1主要病原菌引起蔬菜采后腐烂的病原菌主要有真菌、细菌、病毒和原生动物，其中以真菌和细菌性病原菌为主[5~6]。2.1.1真菌是最主要和最流行的病原微生物，侵染广，危害大，是造成果菜类在贮藏运输期间损失的重要原因。蔬菜采后病原真菌以霉菌为主，表现症状为组织变色、斑块、腐败、干缩、变质等。其中鞭毛菌亚门有腐霉、疫霉和霜疫霉菌，如引起瓜类和菜豆荚的绵腐病，瓜类和茄果类疫病等。接合菌亚门有根霉、毛霉等，如引起草莓的软腐病等。子囊菌亚门有小丛壳、囊孢壳、间座壳、核盘菌和链核盘菌等，如炭疽病、焦腐病、蒂腐病、褐腐病、黑腐病等。担子菌亚门没有蔬菜贮藏期间的重要病原真菌，仅有亡革菌引起的草莓干腐病和菜豆荚腐病，小核菌引起的韭黄烂叶病等。半知菌亚门有葡萄孢霉、木霉、青霉、曲霉、镰刀菌、交链孢等，如灰霉病、青绿霉病、酸腐病、褐腐病、炭疽病、焦腐病、黑斑病等。2.1.2主要造成叶用蔬菜的腐烂。症状有组织坏死、萎蔫和畸形。引起蔬菜采后腐烂的细菌主要是：软腐病杆菌引起蔬菜软腐病，黑胫病杆菌引起马铃薯黑胫病和叶菜黑腐病，边缘假单胞杆菌引起芹菜、莴苣和甘蓝腐烂，枯草芽孢杆菌在30～40℃下引起番茄软腐，多黏芽孢杆菌在37℃下引起马铃薯、洋葱和黄瓜腐烂。2.2病菌的侵染过程2.2.1采前侵染有许多病原菌在田间或生长期就侵入果实，长期潜伏在内，并不表现症状，直到果实成熟采收和环境条件适合时才发病，如洋葱灰霉病菌是在田间入侵洋葱叶内，随着采收自上而下进入鳞茎，贮藏期间大量发病。主要是加强采前田间管理，清除病源，减少侵染。2.2.2采后侵染许多病菌的生活周期在田间完成，采前以孢子形式存在于果面，采后环境条件适宜时孢子萌发，通过伤口或皮孔直接侵入，迅速发病，引起果实腐烂。如采后通过伤口或皮孔直接侵染果实的草莓灰霉病菌。2.2.3伤口侵染大多数蔬菜贮藏期间的病害都与各种伤害紧密相关，新鲜伤口的营养和湿度为病菌孢子的萌发和入侵提供了有利条件。冷害的冻伤，昆虫的虫伤，采收时的机械伤，以及贮运过程中的各种碰伤、擦伤等都是病菌入侵的门户。青霉属、根霉属、葡萄孢霉属、地霉属和欧氏杆菌属都是从伤口入侵，焦腐病菌主要从果蒂细胞受损处入侵，冻伤则加速各种腐烂病的发生。2.2.4直接侵染有的病菌可从果实表面的皮孔直接入侵，或分泌毒素，破坏果皮组织，引起果实腐烂。如甜菜的黑腐病菌、草莓的灰霉病菌等都可通过接触传染，在贮藏期间迅速蔓延。3.微生物防病的机理及条件3.1.作用机理果蔬采后病害生物防治拮抗机理主要有抗生、竞争、寄生及诱导抗性等[7~9]3.1通过拮抗微生物分泌抗菌素来抑制病原菌。如枯草芽孢杆菌分泌伊枯草菌素;洋葱假单胞杆菌产生吡咯烷酮类抗菌素;木霉产生吡喃酮等[10]。能够产生抗菌素的微生物主要是细菌,且抗菌素多种多样,不仅同一种细菌可以产生多种抗菌素,而且一种抗菌素也可由多种细菌产生。自1945年Johnson等报道枯草芽孢杆菌产生拮抗物质以来,人们已从枯草芽孢杆菌的不同菌株中分离出几十种抗菌物质,这些抗菌物质是一类从简单分子到复杂化合物,即从杆菌肽、大环脂到类似噬菌体颗粒等不同成份组成的物质,也有一部分低分子量抗菌素、蛋白性抗菌物质。利用微生物(拮抗菌)防病的基本条件是拮抗菌必须抢先占据病原菌的侵染部位,并快速繁殖成为主导菌。大部分果蔬的采后腐烂是由伤口侵染的病原菌引起的,目前,果蔬采后病害的微生物防治研究主要集中在筛选能够抵抗由伤口侵染的病原菌的拮抗菌。病原菌孢子从产品表面伤口侵入的过程很快(一般在24h之内),因此,拮抗菌在伤口部位的快速繁殖和生长非常关键。一般而言,筛选出的拮抗菌需要具备下列基本特点:(1)能在产品表面和伤口快速繁殖成主导菌;(2)在产品表面伤口上快速生长;(3)能够充分利用伤口部位的低水平养分;(4)能适应比较广泛的温度、湿度和pH值的生存环境;(5)在病原菌的侵染部位比病原菌更快地繁殖和生长。关于拮抗菌筛选方面,Wilson等设计了一种优选酵母类拮抗菌的方法。这种方法主要是将洗涤果蔬表面的水滴入果蔬的伤口,再接种病原菌孢子。培养数天后,从没有发生病原菌感染的伤口分离拮抗菌,并根据Droby等的方法进行拮抗菌培养、分离纯化和抗菌试验。研究结果表明,许多酵母菌能在果蔬伤口或干燥的植物表面快速繁殖成主导菌,并向体外分泌多糖物质,这些物质不仅具有加强酵母菌的生存能力,同时还有抵制病原菌侵染的作用。这些酵母类拮抗菌一般能在低水平的营养条件下快速繁殖,而且对普通化学杀菌剂的敏感性较小。尽管这些酵母菌抵抗病原菌侵染的机理尚不明确,但比较肯定的是它们的拮抗作用并不依赖于抗生物质。3.1.2指物理位点、生态位点的抢占以及营养物质和氧气的竞争。在果蔬采后病害生物防治中,竞争作用尤为重要,由于引起果蔬采后病害的病原菌都是非专化性的死体营养菌,其孢子萌发及致病活动需要大量的外源养分,通过与病原真菌竞争果实表面的营养物质及侵染位点,从而降低果蔬表面病原真菌数量。已报道的众多酵母菌和类酵母菌主要以此作为生物防治基础,酵母菌菌体繁殖速度快,可迅速扩大种群数量,占据病原真菌的侵染位点,阻止病原菌的侵入。3.1.3以吸附生长、缠绕、侵入、消解等形式抑制病原菌。如拮抗酵母菌分泌胞外水解酶如几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶,将真菌细胞壁的主要成分几丁质和β-1,3-葡聚糖分别降解为几丁质单糖、二糖和寡糖,从而破坏病原菌细胞骨架,表现出明显的抗真菌活性[11];木霉菌通过侵入或穿透寄主菌丝细胞,产生几丁质酶、葡聚糖酶以及蛋白酶、酶等一系列水解酶类,以此消解病原菌的细胞壁。3.1.4诱导植物抗性是生物防治的一个重要方面。植物在遭到病原物或非病原物诱导时,常常通过木质素、胼胝体和羟脯氨酸糖的沉积、植物抗菌素的积累、蛋白质酶抑制剂和溶菌酶(几丁质酶和脱乙酰几丁质酶等)的合成来增强细胞壁的抗性,这些过程涉及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)与超氧化物歧化酶(SOD)等酶的活性。拮抗菌诱导植物抗性在G-细菌如假单胞菌和真菌已有很多报道[12],芽孢杆菌诱导植物抗性作用的报道相对较少,但已经证明诱导植物抗性也是其重要的生防机制之一。[13~15]3.2酵母类抗菌剂防病机制方面的研究现状尽管有关拮抗菌抗病原菌侵染的机理尚不明确,但已有越来越多的研究结果表明酵母菌能够以明显的优势在果蔬创伤部位繁殖和生长,并向体外分泌抗菌物质,而且还能刺激和提高果蔬组织的抗病能力。3.2.1拮抗菌和病原菌联合培养试验结果表明,拮抗菌抑制病原菌的作用存在着营养竞争的机制,具体表现为:(1)拮抗菌能抑制病原菌的孢子萌发和生长;(2)抑制病原菌的效果与拮抗菌繁殖体的密度显著相关;(3)外加养分,可以使受到抑制的病原菌部分或完全复活。US-7酵母菌抵抗病原菌的效果与其吸收养分的能力有着十分重要联系[16]为了抑制病原菌的侵染,拮抗菌必须在病原菌到达以前或到达以后的很短时间内占据侵染部位。季也蒙毕赤酵母、变黄罗伦隐球酵母、出芽短梗霉、假丝酵母、掷孢酵母都能够在果蔬伤口部位快速繁殖,其繁殖速度明显快于病原菌,从而造成病原菌失去了繁殖和生长的有效空间。3.在果蔬采后病害的微生物防治研究中,有关拮抗菌寄生于病原菌营养繁殖体的报道很少。Wisniewski等发现,季也蒙毕赤酵母细胞似乎寄生于灰霉病菌的菌丝体内,但只是简单地附着在青霉菌的菌丝体上。在这些酵母细胞的外围还包裹着一层基质。加入蛋白质变性物质或抑制微生物的呼吸作用,就会解离酵母细胞与病原菌之间的连结。因此,在酵母细胞表面和周围的基质中可能存在着粘连蛋白质。与病原菌菌丝体连结的季也蒙毕赤酵母菌能够向体外分泌降解病原菌细胞壁的
-1-3-葡聚糖酶。当这些酵母菌与灰霉病菌的菌丝体分离后就会发现,灰霉病菌菌丝体上原先与酵母菌连结的部位出现坏死和部分细胞壁降解的区域。酵母细胞分泌
-1-3-葡聚糖酶的能力取决于这些酵母细胞与病原菌菌丝体的紧密结合。动力学研究表明,酵母细胞与病原菌菌丝体和植物组织的紧密结合有利于
-1-3-葡聚糖酶的产生和分泌。进一步研究表明,US-7酵母细胞分泌的
-1-3-葡聚糖酶的分子量为4.5×105,其适宜pH值范围为4.0～5.0,适宜的温度为50℃。在更广泛的pH值范围(3.0～6.0),该酶活性保持在80%的水平。50mmol/L的葡萄糖并不影响酶的活性,当葡萄糖浓度提高到0.5mol/L和1.4mol/L时,酶活性则分别降低了35%和64%。[17~18]3.2.Wisniewski等在研究拮抗菌-病原菌互作时发现,在果实伤口部位生长的酵母细胞外围有大量的新生物质。体外试验结果显示,这种物质对某些果蔬采后病原菌的孢子萌发和芽管伸长均具有较强的抑制作用,明显控制了青霉菌在葡萄柚创伤部位的侵染和由此而引发的腐烂。这些结果表明,酵母细胞分泌的胞外物质可能参与了拮抗菌-病原菌之间的互作。2.4诱导果蔬组织的抗病性为了研究拮抗菌对采后果蔬抗病性的影响,Droby等将US-7酵母培养液接种于葡萄柚、柚、葡萄、胡萝卜的伤口表面,这些组织的乙烯产生量明显提高(酵母细胞本身并不产生乙烯)。进一步研究发现,US-7酵母细胞向体外分泌的物质能够刺激葡萄柚组织块产生乙烯,说明这种物质可能起着乙烯合成诱导物的作用。内源或外源乙烯的增加则可提高组织抵抗青霉菌侵染的能力。US-7酵母还能诱导柠檬产生植物抗毒素-金雀花素(C20H20O10)。US-7酵母诱导果蔬组织产生乙烯和金雀花素,从而提高了组织对病原菌的抵抗能力。ElGhaouth等还发现,清酒假丝酵母能够诱导合成壳聚糖酶,使苹果组织细胞壁形成乳状突起,从而提高了组织抵抗病原菌侵染的能力。4、微生物防治发展趋势目前已有一些公司成功地研制出用于防治果蔬采后病害的微生物抗菌剂,如As-pireTM生物抗菌剂(美国Ecogen公司)、Biosave111和Biosave110(美国EcoScience公司),这两类酵母类微生物抗菌剂主要用于控制柑桔类和仁果类果实的采后腐烂。尽管有不少报道指出某些微生物抗菌剂的效果与化学杀菌剂相当,但是在实际应用中常常会发现其效果并不稳定。造成这种现象的原因尚不十分明确,但肯定与抗菌剂的制备工艺、使用方法、环境卫生和果蔬产品的生理状况等有着密切的关系。微生物抗菌剂的使用方法直接关系到其防病的效果。喷、淋方法比较适合于微生物抗菌剂的使用,也便于微生物抗菌剂与低剂量化学药剂或其它添加剂的结合使用。保证微生物抗菌剂能够正常发挥功效的一个极为重要的条件是完善的卫生管理体系。处理车间、用具、用水、操作人员和果蔬本身的清洁均有利于微生物抗菌剂发挥作用。5.结论防病的效果是决定微生物防病技术能否成功应用的关键因素,强化微生物抗菌剂功效的措施也就自然成为生物防病研究的重要课题。McLaughin等证实,在季也蒙毕赤酵母细胞培养液中加入钙盐能提高这种酵母菌的防病效果,可降低该菌的使用剂量。也有试验表明,2-脱氧-D-葡萄糖能够提高掷孢酵母抑制苹果青霉菌的效果,许多食品添加剂和乳酸链球菌肽也被证实能强化微生物抗菌剂的防病作用。酵母类拮抗菌的共同特点是在果蔬创伤部位快速繁殖成为主导菌,因此,这些酵母菌可以作为载体将降解病原菌细胞壁的酶或其它抗菌蛋白质直接定位于病原菌侵染的部位。这种防病机制的实际效果在很大程度上取决于载体菌中抗菌蛋白质(壳聚糖酶和葡聚糖酶等)编码基因的表达水平。因此,采用分子生物技术提高拮抗菌产生和分泌特定抗菌蛋白质的潜力很大。将微生物抗菌剂与其它物理和化学处理相结合则不失为一种强化微生物防病效果的策略。采用这种综合措施将有可能达到常规化学杀菌剂的防病效果。愈伤和热处理、紫外线、动植物的提取物、改变O2和CO2的浓度、适宜低温等辅助处理措施均可能提高拮抗菌防治果蔬采后病害的功效。不少试验表明,微生物抗菌剂在果蔬采前处理能够提高其采后处理的效果。采前拮抗菌处理能够调节果蔬表面附生微生物的种群和数量,从而控制伤口部位的主导菌种。参考文献[1]葛毅强,张维一.果蔬采后病害的生物防治[J],世界农业,1997,7.[2]鲍瑞峰,秦丹.果蔬采后病害生物防治的研究进展[J],热点论坛,2009,3.[3]余晓红,汪志君.我国蔬菜采后商品化处理技术的研究与发展[J].中国果菜,2002,(04).[4]田世平,范青.控制果蔬采后病害的生物学技术[J],植物学通报2000,17(3):211~217[5]王迪轩.蔬菜采后病害危害及防止措施[J].保鲜加工,2010,2[6]朱子华,盛恒彬,梅象信,赵金锁,周德根.果实采后病害种类[J].河南林业科技,2004,(04).[7]黄健,曾顺德,张迎君.果蔬采后病害生物防治研究进展[J],西南园艺,2005,33:23～25.[8]王迪轩.\o"蔬菜采后病害危害及防止措施相似度93%"蔬菜采后病害危害及防止措施[J].蔬菜,2010,(02)[9]黄运凤,刘国凌.拮抗菌制剂在果蔬采后病害防治中的应用研究进展[J].贵州农业科学,2010,(05).[10]张维一,毕阳.果蔬采后病害与控制[M].北京:中国农业出版社,1996.[11]陈三风,李季伦.几丁质酶研究历史和发展前景[J].微生物学通报,1993,20(3):156～160.[12]LoonLC,BakkerHM,PieterseCMJ.Systemicresistanceinducedbyrhizospherebacteria[J].Ann.Rev.Phytopathol.,1998,36:453～483.[13]TangWH.Advancesinbiologicalcontrolofplantdiseases:proceedinoftheinternationalworkshoponbiologicalcontrolofplantdiseases[C].Beijing:ChinaAgriculturalUniversityPress,1996.[14]牛伟,牛宇,耿海峰.水果采后病害生防菌研究进展[J].内蒙古农业科技,2010,(05).[15]田世平,产祝龙.诱导抗性在果蔬采后病害防治中的研究与应用(英文)[J].植物病理学报,2004,(05).[16]茅林春.果蔬采后病害微生物防治的研究进展[J],浙江农业科学,2001,1:01~04[17]黄运凤,刘国凌.拮抗菌制剂在果蔬采后病害防治中的应用研究进展[J].贵州农业科学,2010,(05).[18]于帅,刘天明,魏渱.拮抗酵母菌对果蔬采后病害生物防治的研究进展[J].食品工业科技,2010,(09).[19]秦国政,田世平,刘海波.HYPERLINK"/kns50/detail.aspx?filename=ZWXT2002030