头孢菌素类课件

Analysisofantibiotics第十六章抗生素类药物的分析Analysisofantibiotics第十六章第一节概述第二节β-内酰胺类第三节氨基糖苷类第四节四环素类第五节高分子杂质检查第一节概述第二节β-内酰胺类第三节氨基糖2第一节概述

生物在生命活动产生的，在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称1、化学纯度较低3、稳定性差：活泼基团常为活性中心2、活性组分易发生变异：菌株、发酵条件的改变同系物多异构体多降解物多二、特点一、定义（antibiotics）第一节概述生物在生命活动产生的，在低微浓度下即可对3β–内酰胺类：青霉素类、头孢菌素类氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素、依替米星四环素类：四环素、金霉素、土霉素大环内酯类：红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素多烯大环类：制霉菌素、两性霉素B多肽类：多黏菌素、放线菌素三、分类β–内酰胺类：青霉素类、头孢菌素类三、分类4四、质量分析鉴别检查含量/效价测定理化方法微生物法水分pH值异常毒性热原细菌内毒素降压物质微生物法

理化方法：准确、专属、操作简便；但与临床疗效有偏差四、质量分析鉴别检查含量/效价测定理化方法微5微生物法定义：系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。方法：管碟法与浊度法。特点：与临床疗效吻合，灵敏，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大。微生物法定义：系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制61、管碟法1、管碟法72、浊度法利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后的细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。2、浊度法利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作8五、活性表示方法以效价单位表示(U，μg)指每ml或每mg样品中含有某种抗生素的有效成分的多少。例如：1mg青霉素钠=1670U1mg庆大霉素=590U五、活性表示方法以效价单位表示(U，μg)9第二节结构性质含量测定鉴别杂质检查β-内酰胺类药物的分析第二节结构含量测定鉴杂质检查β-内酰胺类药物的分析106-aminopenicillanicacid,简称6-APA青霉素类7-aminocephalosporanicacid,简称7-ACA头孢菌素类氢化噻唑环氢化噻嗪环＊＊＊＊6-氨基青霉烷酸7-氨基头孢菌烷酸一、结构＊12346-aminopenicillanicacid,青霉素类11青霉素(苄青霉素)(penicillins)氨苄西林阿莫西林青霉素类青霉素(苄青霉素)(penicillins)氨苄西林阿莫12头孢氨苄头孢羟氨苄头孢菌素类头孢氨苄头孢羟氨苄头孢菌素类13头孢羟氨苄头孢噻吩钠头孢菌素类头孢羟氨苄头孢噻吩钠头孢菌素类141、酸性:游离羧基，pKa2.5-2.8，酸性较强。碱金属盐水溶性好，有机碱盐难溶于水。2、旋光性:手性C﹡﹡﹡﹡﹡二、性质1、酸性:游离羧基，pKa2.5-2.8，酸性较强。2153、UV青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构260nm4、β–内酰胺环不稳定性：含水量、纯度青霉素类氧化剂、金属离子、温度酸、碱、青霉素酶降解失效头孢菌素类酸、碱、胺类β–内酰胺酶降解失效3、UV青霉素类：苯环取代基260nm4、β–内酰胺环不稳定16青霉素的降解反应青霉素青霉噻唑酸H2O/OHˉ青霉素酶青霉酸H2OpH2100℃α–青霉噻唑酰基羟胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2青霉素的降解反应青霉素青霉噻唑酸H2O/OHˉ青霉素酶青霉酸17鉴别Identification(一)、色谱法（HPLC、TLC）(二)、光谱法（IR、UV）(三)、呈色反应

(四)、各种盐的反应三、鉴别鉴别(一)、色谱法（HPLC、TLC）(二)、光谱法（18(三)呈色反应1）羟肟酸铁反应——β–内酰胺环β–内酰胺类NH2OH·HClNaOH羟肟酸Fe3+H+显色（红、棕、褐）(三)呈色反应1）羟肟酸铁反应——β–内酰胺环β–内酰胺类N192）茚三酮反应——α-氨基

茚三酮Δ

蓝紫色2）茚三酮反应——α-氨基茚三酮蓝紫色203）双缩脲反应——β–内酰胺类碱性酒石酸铜紫色3）双缩脲反应——β–内酰胺类碱性酒石酸铜紫色214）变色酸-硫酸反应H2SO4Δ

HCHO变色酸（缩合）显色5）重氮苯磺酸反应——酚羟基（偶合）4）变色酸-硫酸反应H2SO4HCHO变色酸显色5）重氮苯磺227）硫酸-甲醛反应(BP)青霉素钾和青霉素钠呈红棕色(四)焰色反应——K+、Na+7）硫酸-甲醛反应(BP)青霉素钾和青霉素钠呈红棕色(四)23杂质检查PurityTest(一)、聚合物(二)、有关物质与异构体(三)、吸光度

(五)、结晶性三、杂质检查

(四)、有机溶剂杂质检查(一)、聚合物(二)、有关物质与异构体(三)24（一）、聚合物头孢他啶中聚合物测定葡聚糖凝胶G-10为填充剂；流动相A为含3.5%硫酸铵的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，流动相B为水；流速为0.8ml/min；检测波长为254nm。以流动相A为流动相，用0.1mg/ml蓝色葡聚糖2000溶液进样200l进行测定，理论板数应不低于900，拖尾因子在0.75～1.5。两种流动相系统中蓝色葡聚糖的保留时间比应在0.93～1.07之间。对照品溶液以流动相B为流动相，重复进样200l，峰面积值的相对标准差应小于5.0%。1）色谱条件与系统适用性试验（一）、聚合物头孢他啶中聚合物测定葡聚糖凝胶G252）溶液的制备样品溶液进样200l，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液200l注入液相色谱仪，以流动相B为流动相，记录色谱图3）测定对照品溶液：100g/ml的头孢他啶溶液。样品溶液：20mg/ml的头孢他啶样品溶液。4）结果判断按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%2）溶液的制备样品溶液进样200l，以流动相A为26萄聚糖凝胶立体网状结构图原理——“分子筛”萄聚糖凝胶原理——“分子筛”27头孢菌素类课件28（二）、有关物质与异构体头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查1）色谱条件与系统适用性试验：ODS分析柱；0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:׃38）为流动相，流速1ml/min；检测波长278nm。要求头孢呋辛酯A、B异构体之间，头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯△3-异构体之间的分离度应大于1.5；理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算，应不低于1500（二）、有关物质与异构体头孢呋辛酯中有关物292）异构体对照溶液的配制头孢呋辛酯0.2mg/ml溶液60℃1小时头孢呋辛酯△3异构体溶液头孢呋辛酯E异构体溶液头孢呋辛酯头孢呋辛酯E异构体流动相流动相紫外光照射＞24h2）异构体对照溶液的配制头孢呋辛酯60℃头孢呋辛酯△3异构体303）有关物质和异构体的检查供试品溶液：0.25mg/ml的样品溶液。对照溶液：2.5g/ml的样品溶液。测定：取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果判断：供试品溶液如显杂质峰①E异构体峰面积不得大于对照溶液主峰面积之和(1.0%)②△3-异构体峰面积不得大于1.5倍(1.5%)③其余单个杂质峰面积的和不得大于3倍(3.0%)。④供试品溶液中任何小于对照品溶液主峰面积之和0.05倍的峰可忽略不计3）有关物质和异构体的检查供试品溶液：0.25mg/ml的样3140020600302010时间(min)峰高(mAU)65432113.95411.9192.401供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.48～0.55。BA△3-EE40020600302010时间(min)峰高(mAU)6532头孢菌素类课件33（三）、UV（四）、有机溶剂（五）、结晶性第一法(偏光显微镜法)第二法(X射线粉末衍射法)青霉素钾样品280nmA<0.10（三）、UV（四）、有机溶剂34含量测定Assay(一)、碘量法(二)、汞量法(三)、酸碱滴定法

(五)、HPLC法四、含量测定

(四)、羟肟酸比色法含量测定(一)、碘量法(二)、汞量法(三)、酸碱滴定法(五35阿莫西林克拉维酸钾片1、色谱条件与系统适用性试验色谱条件:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂以磷酸盐缓冲液-甲醇(95:5)为流动相流速为0.7ml/min检测波长为220nm。系统适用性:阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5阿莫西林克拉维酸钾片1、色谱条件与系统适用性试验系统适用性:362、测定法(外标法)

本品10片精密称定精密称取适量溶解，定容滤过续滤液供试品溶液阿莫西林0.8mg

/ml克拉维酸0.8mg/ml混合对照品溶液取10l注入液相色谱仪，记录色谱图。分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。2、测定法(外标法)本品10片精密精密称取适量溶37头孢菌素类课件38复习题（一）、选择题1、与化学药品相比，不是抗生素特点的选项是A.化学纯度较低B.同系物、异构体、降解物多C.活性组分易发生变异D.稳定性差E、操作步骤多复习题（一）、选择题1、与化学药品相比，不是抗生素特点的选项392、以下选项中不是生物学法测定抗生素效价的特点的是

A、测定结果直观B、方法灵敏度较低，检品用量多

C、适用范围广D、误差大E、操作步骤多2、以下选项中不是生物学法测定抗生素效价的特点的是

A、测定40A.6-氨基青霉烷酸B.7-氨基头孢菌烷酸C.7-氨基青霉烷酸D.6-氨基头孢菌烷酸E.以上都不是3、青霉素的母核是A.6-氨基青霉烷酸3、青霉素的母核是41A.6-氨基青霉烷酸B.7-氨基头孢菌烷酸C.7-氨基青霉烷酸D.6-氨基头孢菌烷酸4、头菌孢素的母核是A.6-氨基青霉烷酸4、头菌孢素的母核是425、青霉素和头孢菌素都属于哪类抗生素A氨基糖苷类Bβ-内酰胺抗生素类C四环素类D喹诺酮类E大环内酯类5、青霉素和头孢菌素都属于哪类抗生素A氨基糖苷类436、β-内酰胺抗生素类药物分子结构中最不稳定的部分是（

）A.噻唑环B.噻嗪环C.内酰胺环D.芳环.E以上都不对6、β-内酰胺抗生素类药物分子结构中最不稳定的部分是（

447、头孢菌素类的母核的简称为（

）A、6-APA

B、6-ACA

C、7-APA

D、7-ACAE、7-ASA7、头孢菌素类的母核的简称为（

）A、6-AP458、青霉素分子中含几个手性碳（

）。A、1

个

B、2个

C、3

个

D、4个

E、0个

8、青霉素分子中含几个手性碳（

）。A、1

个

469、头孢菌素分子中所含手性碳原子的数目为（）。A、1

个

B、2个

C、3个

D、4个

E、0个9、头孢菌素分子中所含手性碳原子的数目为（）。A、1

4710、β-内酰胺类抗生素的紫外吸收是由于结构中（）A、6－APAB、6-APA的共轭结构侧链C、羰基D、β-内酰胺环E、氢化噻唑环10、β-内酰胺类抗生素的紫外吸收是由于结构中（4811、无旋光性的药物是A、四环素B、青霉素C、盐酸麻黄碱D、乙酰水杨酸E、葡萄糖11、无旋光性的药物是A、四环素49A含有手性碳，具有旋光性B分子中的环状部分无紫外吸收，但其侧链部分有紫外吸收C遇硫酸-甲醛试剂有呈色反应可供鉴别D具有碱性，可与无机酸形成盐E.以上都不是12、青霉素不具有下列哪类性质（）12、青霉素不具有下列哪类性质（）5013、β-内酰胺类抗生素药物具有的性质是A、氢化噻唑环的羟基的酸性B、β-内酰胺环的不稳定C、手性碳原子D、B+CE、A+B+C13、β-内酰胺类抗生素药物具有的性质是A、氢化噻唑环的羟基5114、青霉素具有下列哪类性质（）A、含有手性碳，具有旋光性B、分子中的环状部分有强紫外吸收C、具有碱性，不能与无机酸形成盐D、β-内酰胺为一稳定环E、以上都不对14、青霉素具有下列哪类性质（）A、含有手性碳，具有5215、β-内酰胺类的鉴别反应

A硫酸-硝酸显色反应

B变色酸硫酸显色反应

C羟肟酸铁反应

D还原碘的反应

E还原酒石酸铜的反应15、β-内酰胺类的鉴别反应

A硫酸-硝酸显色反应

B5316、以下药物不发生羟肟酸铁呈色反应的是A.阿莫西林B.青霉素C.四环素D.头孢氨苄E.以上都不对16、以下药物不发生羟肟酸铁呈色反应的是A.阿莫西林5417、青霉素的鉴别方法不包括有（）A红外吸收光谱B紫外吸收光谱C羟肟酸铁反应D与硫酸-甲醛试剂呈色反应E重氮化—偶合反应17、青霉素的鉴别方法不包括有（）A红外吸收光谱5518、青霉素和头孢菌素具有—CONH—结构，可利用下列哪些反应进行鉴别（）A、坂口反应B、印三酮反应C、三氯化铁反应D、双缩尿反应18、青霉素和头孢菌素具有—CONH—结构，可利用下列哪些反56（二）、填空题1、抗生素的效价测定主要分为------和--------两大类2、青霉素的分子结构中的母核为------------（二）、填空题1、抗生素的效价测定主要分为------和--57第三节结构性质含量测定鉴别杂质检查氨基糖苷类药物的分析第三节结构含量测定鉴杂质检查氨基糖苷类药物的分析58

氨基环醇+氨基糖→苷链霉素(Streptomycin)一、结构氨基环醇+氨基糖→苷链霉素(Streptomyc59巴龙霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺脱氧链霉胺巴龙胺D－核糖巴龙霉糖巴龙二糖胺巴龙霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺脱氧链霉胺60庆大霉素(gentamycin)绛红糖胺(紫素胺)2-脱氧链霉胺加洛糖胺(N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺)庆大霉素(gentamycin)绛红糖胺(紫素胺)2-脱氧611）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐2）溶解度（氨基、羟基）：水溶性3）旋光性（糖）：多个手性碳4）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解二、性质1）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐二、性质621、茚三酮反应——α-氨基、羟基胺类茚三酮Δ

蓝紫色链霉素庆大霉素三、鉴别1、茚三酮反应——α-氨基、羟基胺类茚三酮蓝紫色链霉素三、鉴632、Molisch试验红紫色羟甲基糠醛

五碳糖或六碳糖结构蓝紫色2、Molisch试验红紫色羟甲基糠醛五碳糖或六643、N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色3、N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）乙酰65乙酰丙酮OH-对二甲氨基苯甲醛H+樱桃红色乙酰丙酮OH-对二甲氨基苯甲醛H+樱桃红色664、麦芽酚反应H+5、坂口反应——链霉胍特有反应链霉素OH-水解8-羟基喹啉NaOBr或α-萘酚链霉胍橙红色链霉糖特有反应4、麦芽酚反应H+5、坂口反应——链霉胍特有反应链霉素OH-67坂口反应麦芽酚反应N-甲基葡萄糖胺反应坂口反应麦芽酚反应N-甲基葡萄687、色谱法6、硫酸盐反应8、光谱法TLCHPLCUVIR7、色谱法6、硫酸盐反应8、光谱法TLCHPLCUV691、链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）的检查来源：发酵中产生方法：TLC中的对照品法2、硫酸奈替米星中西索米星的检查(TLC)4、庆大霉素C组分的测定四、杂质检查3、硫酸盐测定——EDTA滴定与HPLC

BP(2005)——HPLC-ECDCh.P——HPLC-ELSDUSP-------HPLC-UV1、链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）的检查来源：发酵中产生方701）色谱条件填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：水-冰醋酸-甲醇(25:5:70)配制的0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液检测波长：330nm

系统适用性试验：理论板数：按C2组分峰计算应不低于2000。分离度：C2a

峰和C2峰的分离度应符合要求。

1）色谱条件系统适用性试验：712)测定法

A、0.65mg/ml的样品溶液，精密量取10.0ml，置量瓶中，加异丙醇2ml与邻苯二醛试液1.6ml，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，冷却，滤过，取续滤液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图B、庆大霉素标准品，同法测定。C组分的保留时间依次为：C1、C1a、C2a、C2。量取C1、C1a、C2a、C2的峰面积。3）结果C1应为25％～50％，C1a应为10％～35％，C2a＋C2应为25～50％

。

2)测定法3）结果72庆大霉素无紫外吸收，需衍生化处理后再进行HPLC测定。λmax=330nm庆大霉素无紫外吸收，需衍生化处理后再进行HPLC测定。λma734）讨论1、柱效：以C2峰计算，理论板数应不低于2000，在此柱效下各组分之间才能达到规定的分离度。为此色谱柱做适当选择。2、流动相：流动相极性适当控制，极性过强，出峰快，分离不佳。C1峰与衍生试剂等杂质峰难分析;极性过弱，出峰太慢。实验表明，C2峰的保留时间控制在20min～30min较为适宜。3、衍生化试剂与衍生物的稳定性：配制后不能久置，生成的衍生物不稳定。一般避光保存可使用三天。4、离子对试剂浓度影响：离子对试剂浓度对庆大霉素OPA衍生物保留值有影响。4）讨论1、柱效：以C2峰计算，理论板数应不低于2000，在74微生物检定法HPLC法五、含量测定微生物检定法五、含量测定75HPLC法HPLC-蒸发光散射法测定硫酸依替米星含量

1、色谱条件和系统适用性试验：固定相：C18流动相：0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（84：16）检测器：蒸发光散射检测器

依替米星和奈替米星混合对照溶液进样：分离度＞1.2重复性（C2b）：RSD＞2.0%HPLC-蒸发光散射法测定硫酸依替米星含量1、色谱条76HPLC蒸发光散射法测定硫酸依替米星含量HPLC蒸发光散射法测定硫酸依替米星含量772、测定：依替米星对照溶液：1.0mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml。样品溶液：含依替米星约0.5mg/ml的溶液。取对照溶液20ul，进入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积对数值和浓度对数值计算回归方程，r＜0.99。取样品溶液：同法测定，计算依替米星含量。2、测定：依替米星对照溶液：1.0mg/ml、0.25m78复习题（一）、选择题1、硫酸庆大霉素含量（效价）测定方法应采用

A.微生物检定法B.四氮唑比色法C.汞量法D.酸性染料比色法E.柯柏反应比色法复习题（一）、选择题1、硫酸庆大霉素含量（效价）测定792、庆大霉素无紫外吸收，美国药典采用HPLC法测定C组分时采用什么方法检出

A、三氯化铁显色法B、邻苯二醛衍生化法C、硫醇汞盐法

D、柱后衍生化法E、荧胺衍生化法2、庆大霉素无紫外吸收，美国药典采用HPLC法测定C组分时采803、下列有关庆大霉素叙述正确的是（）A、在紫外区无吸收B、无茚三酮反应C、有麦芽酚反应D、庆大霉素是由庆大霉素C1、C2构成的复合物E、在230nm处有紫外吸收3、下列有关庆大霉素叙述正确的是（）A、在紫外区无吸815、庆大霉素C组分的测定采用紫外检测器是利用AC组分的紫外吸收性质BC组分受紫外光激发荧光C邻苯二醛衍生化后具紫外吸收DC组分与流动相作用具紫外吸收EC组分分离过程后具紫外吸收5、庆大霉素C组分的测定采用紫外检测器是利用AC组分的826、下列反应属于链霉素特征鉴别反应的是（）A、茚三酮反应B、麦芽酚反应C、有N-甲基葡萄糖胺反应D、硫酸-硝酸呈色反应E、三氯化铁反应6、下列反应属于链霉素特征鉴别反应的是（）A、茚三838、下列反应属于链霉素特有鉴别反应的（）A、茚三酮反应B、麦芽酚反应C、坂口反应D、硫酸-硝酸呈色反应E、三氯化铁反应8、下列反应属于链霉素特有鉴别反应的（）A、茚三酮反84A、链霉素的碱性溶液加8—羟基喹啉、次溴酸钠试液，即显橙红色B、链霉素的碱性溶液置水浴加热，加硫酸铁铵产生紫红色

C、中性红在青霉素V钾的碱性溶液中显橙色，加青霉素酶，溶液颜色变为红色

D、维生素B1在碱性溶液中被铁氰化钾氧化，转溶于正丁醇中，显蓝色荧光

E、庆大霉素与茚三酮反应，显蓝紫色

9、麦芽酚反应

10、硫色素反应A、链霉素的碱性溶液加8—羟基喹啉、次溴酸钠试液，即显橙红色8511、坂口反应为下列哪一药物特有的鉴别反应（）。A.庆大霉素

B.链霉素C.青霉素

D.四环素E大环内酯类12、链霉胍的特有反应是（

）。A.茚三酮反应

B.N-甲基葡萄糖胺反应C.麦芽酚反应

D.坂口反应.E三氯化铁反应11、坂口反应为下列哪一药物特有的鉴别反应（）。12、链霉胍8613、链霉素特有反应是（

）。A.茚三酮反应

B.N-甲基葡萄糖胺反应C.麦芽酚反应

D.坂口反应.E三氯化铁反应14、不是链霉素的鉴别方法为A、坂口（Sakaguchi）反应B、麦芽酚（Maltol）反应C、三氯化铁反应D、茚三酮反应E、N-甲基葡萄糖胺反应13、链霉素特有反应是（

）。14、不是链霉素的鉴8715、以下是庆大霉素的鉴别反应A茚三酮试剂显蓝紫色

B三氯化铁试剂显红棕色C羟肟酸铁反应显红色D碱性苦味酸试剂显红色EKober反应，显桃红色15、以下是庆大霉素的鉴别反应A茚三酮试剂显蓝紫色

B三8816、具有氨基糖苷结构的药物是A、链霉素B、青霉素钠C、头孢羟氨苄D、盐酸美他环素E、罗红霉素

16、具有氨基糖苷结构的药物是89第四节结构性质含量测定鉴别杂质检查四环素类药物的分析第四节结构含量测定鉴杂质检查四环素类药物的分析90ABCD123456789101112一、化学结构ABCD123456789101112一、化学结构91与酸、碱均可成盐，临床多用盐酸盐强酸或强碱中溶解度↑

2、旋光性二、性质1、两性：-OH→酸性N(CH3)2→碱性与酸、碱均可成盐，临床多用盐酸盐2、旋光性二、性质1924、不稳定性3、UV和荧光

抗生素及其降解产物紫外照射下产生荧光4、不稳定性3、UV和荧光抗生素及其降解产物紫外照射下93AApH2.0~6.0土霉素、多西环素不易发生差向异构化：氢键。四环素（金霉素）差向四环素（差向金霉素）A.差向异构化AApH2.0~6.0土霉素、多西环素不易发生差向异构化：氢94B.酸性脱水降解λmax=445nmλmax=435nmDDDCBBCBCB.酸性脱水降解λmax=445nmλmax=43595C.碱性脱水降解C.碱性脱水降解961、HPLC2、TLC(正相分配薄层色谱)EDTA→克服痕量金属造成的拖尾现象3、IR4、UV5、显色法浓硫酸三氯化铁三、鉴别1、HPLC2、TLC(正相分配薄层色谱)EDTA→克服痕97200nm300nm400nmTC1.有关物质——HPLC2.杂质吸光度——UV268nm355nm四、杂质检查五、含量测定盐酸四环素-HPLC200nm300nm400nmTC1.有关物质——HPLC298第五节、高分子杂质的检查生产过程贮存过程使用不当内源性(药物自身聚合物)外源性(蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物)发酵过程二、分类一、高分子杂质定义系对药品中分子量大于药物本身的杂质的总称控制重点第五节、高分子杂质的检查生产过程内源性(药物自身聚合物)外991.基本结构青霉素族多肽（青霉素噻唑多肽）聚合物母核参于反应侧链参于反应头孢菌素族与母核有关的N型聚合反应侧链参与反应的L型聚合反应1.基本结构青霉素族多肽（青霉素噻唑多肽）聚合物母核参于反应1002.特点（1）生产工艺产生杂质：发酵中产生的任何蛋白及蛋白碎片均可带入产品中，相同的蛋白或蛋白碎片上可以结合不同数目的药物分子，形成青霉素噻唑多肽类杂质。（2）降解作用：有不同聚合度和不同机理聚合反应形成的聚合物，聚合物发生不同程度的降解作用。（3）以异构体存在样品：同聚和异聚反应可同时发生。（4）高分子杂质的种类、数量与生产工艺密切相关（溶媒结晶、喷雾干燥）2.特点（1）生产工艺产生杂质：发酵中产生的任何蛋白及蛋白碎1013、杂质控制方法反相高效液相、离子交换色谱和凝胶色谱。葡聚糖凝胶SephadexC－10自身对照外标法3、杂质控制方法反相高效液相、离子交换色谱和凝胶色谱。自身对1021、四环素具有的性质是：复习题一、选择题A.氧化性

B.仅有碱性C.仅有酸性

D.酸碱两性E以上都不对1、四环素具有的性质是：复习题一、选择题A.氧化性

103

2、四环素在弱酸性条件下的降解产物是A.差向四环素B.脱水四环素C.异四环素D.去甲四环素E.去甲氧四环素2、四环素在弱酸性条件下的降解产物是A.差向四环素104ThankYou!AddyourcompanysloganThankYou!AddyourcompanyslAnalysisofantibiotics第十六章抗生素类药物的分析Analysisofantibiotics第十六章第一节概述第二节β-内酰胺类第三节氨基糖苷类第四节四环素类第五节高分子杂质检查第一节概述第二节β-内酰胺类第三节氨基糖107第一节概述

生物在生命活动产生的，在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称1、化学纯度较低3、稳定性差：活泼基团常为活性中心2、活性组分易发生变异：菌株、发酵条件的改变同系物多异构体多降解物多二、特点一、定义（antibiotics）第一节概述生物在生命活动产生的，在低微浓度下即可对108β–内酰胺类：青霉素类、头孢菌素类氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素、依替米星四环素类：四环素、金霉素、土霉素大环内酯类：红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素多烯大环类：制霉菌素、两性霉素B多肽类：多黏菌素、放线菌素三、分类β–内酰胺类：青霉素类、头孢菌素类三、分类109四、质量分析鉴别检查含量/效价测定理化方法微生物法水分pH值异常毒性热原细菌内毒素降压物质微生物法

理化方法：准确、专属、操作简便；但与临床疗效有偏差四、质量分析鉴别检查含量/效价测定理化方法微110微生物法定义：系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。方法：管碟法与浊度法。特点：与临床疗效吻合，灵敏，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大。微生物法定义：系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制1111、管碟法1、管碟法1122、浊度法利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后的细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。2、浊度法利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作113五、活性表示方法以效价单位表示(U，μg)指每ml或每mg样品中含有某种抗生素的有效成分的多少。例如：1mg青霉素钠=1670U1mg庆大霉素=590U五、活性表示方法以效价单位表示(U，μg)114第二节结构性质含量测定鉴别杂质检查β-内酰胺类药物的分析第二节结构含量测定鉴杂质检查β-内酰胺类药物的分析1156-aminopenicillanicacid,简称6-APA青霉素类7-aminocephalosporanicacid,简称7-ACA头孢菌素类氢化噻唑环氢化噻嗪环＊＊＊＊6-氨基青霉烷酸7-氨基头孢菌烷酸一、结构＊12346-aminopenicillanicacid,青霉素类116青霉素(苄青霉素)(penicillins)氨苄西林阿莫西林青霉素类青霉素(苄青霉素)(penicillins)氨苄西林阿莫117头孢氨苄头孢羟氨苄头孢菌素类头孢氨苄头孢羟氨苄头孢菌素类118头孢羟氨苄头孢噻吩钠头孢菌素类头孢羟氨苄头孢噻吩钠头孢菌素类1191、酸性:游离羧基，pKa2.5-2.8，酸性较强。碱金属盐水溶性好，有机碱盐难溶于水。2、旋光性:手性C﹡﹡﹡﹡﹡二、性质1、酸性:游离羧基，pKa2.5-2.8，酸性较强。21203、UV青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构260nm4、β–内酰胺环不稳定性：含水量、纯度青霉素类氧化剂、金属离子、温度酸、碱、青霉素酶降解失效头孢菌素类酸、碱、胺类β–内酰胺酶降解失效3、UV青霉素类：苯环取代基260nm4、β–内酰胺环不稳定121青霉素的降解反应青霉素青霉噻唑酸H2O/OHˉ青霉素酶青霉酸H2OpH2100℃α–青霉噻唑酰基羟胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2青霉素的降解反应青霉素青霉噻唑酸H2O/OHˉ青霉素酶青霉酸122鉴别Identification(一)、色谱法（HPLC、TLC）(二)、光谱法（IR、UV）(三)、呈色反应

(四)、各种盐的反应三、鉴别鉴别(一)、色谱法（HPLC、TLC）(二)、光谱法（123(三)呈色反应1）羟肟酸铁反应——β–内酰胺环β–内酰胺类NH2OH·HClNaOH羟肟酸Fe3+H+显色（红、棕、褐）(三)呈色反应1）羟肟酸铁反应——β–内酰胺环β–内酰胺类N1242）茚三酮反应——α-氨基

茚三酮Δ

蓝紫色2）茚三酮反应——α-氨基茚三酮蓝紫色1253）双缩脲反应——β–内酰胺类碱性酒石酸铜紫色3）双缩脲反应——β–内酰胺类碱性酒石酸铜紫色1264）变色酸-硫酸反应H2SO4Δ

HCHO变色酸（缩合）显色5）重氮苯磺酸反应——酚羟基（偶合）4）变色酸-硫酸反应H2SO4HCHO变色酸显色5）重氮苯磺1277）硫酸-甲醛反应(BP)青霉素钾和青霉素钠呈红棕色(四)焰色反应——K+、Na+7）硫酸-甲醛反应(BP)青霉素钾和青霉素钠呈红棕色(四)128杂质检查PurityTest(一)、聚合物(二)、有关物质与异构体(三)、吸光度

(五)、结晶性三、杂质检查

(四)、有机溶剂杂质检查(一)、聚合物(二)、有关物质与异构体(三)129（一）、聚合物头孢他啶中聚合物测定葡聚糖凝胶G-10为填充剂；流动相A为含3.5%硫酸铵的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，流动相B为水；流速为0.8ml/min；检测波长为254nm。以流动相A为流动相，用0.1mg/ml蓝色葡聚糖2000溶液进样200l进行测定，理论板数应不低于900，拖尾因子在0.75～1.5。两种流动相系统中蓝色葡聚糖的保留时间比应在0.93～1.07之间。对照品溶液以流动相B为流动相，重复进样200l，峰面积值的相对标准差应小于5.0%。1）色谱条件与系统适用性试验（一）、聚合物头孢他啶中聚合物测定葡聚糖凝胶G1302）溶液的制备样品溶液进样200l，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液200l注入液相色谱仪，以流动相B为流动相，记录色谱图3）测定对照品溶液：100g/ml的头孢他啶溶液。样品溶液：20mg/ml的头孢他啶样品溶液。4）结果判断按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%2）溶液的制备样品溶液进样200l，以流动相A为131萄聚糖凝胶立体网状结构图原理——“分子筛”萄聚糖凝胶原理——“分子筛”132头孢菌素类课件133（二）、有关物质与异构体头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查1）色谱条件与系统适用性试验：ODS分析柱；0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:׃38）为流动相，流速1ml/min；检测波长278nm。要求头孢呋辛酯A、B异构体之间，头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯△3-异构体之间的分离度应大于1.5；理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算，应不低于1500（二）、有关物质与异构体头孢呋辛酯中有关物1342）异构体对照溶液的配制头孢呋辛酯0.2mg/ml溶液60℃1小时头孢呋辛酯△3异构体溶液头孢呋辛酯E异构体溶液头孢呋辛酯头孢呋辛酯E异构体流动相流动相紫外光照射＞24h2）异构体对照溶液的配制头孢呋辛酯60℃头孢呋辛酯△3异构体1353）有关物质和异构体的检查供试品溶液：0.25mg/ml的样品溶液。对照溶液：2.5g/ml的样品溶液。测定：取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果判断：供试品溶液如显杂质峰①E异构体峰面积不得大于对照溶液主峰面积之和(1.0%)②△3-异构体峰面积不得大于1.5倍(1.5%)③其余单个杂质峰面积的和不得大于3倍(3.0%)。④供试品溶液中任何小于对照品溶液主峰面积之和0.05倍的峰可忽略不计3）有关物质和异构体的检查供试品溶液：0.25mg/ml的样13640020600302010时间(min)峰高(mAU)65432113.95411.9192.401供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.48～0.55。BA△3-EE40020600302010时间(min)峰高(mAU)65137头孢菌素类课件138（三）、UV（四）、有机溶剂（五）、结晶性第一法(偏光显微镜法)第二法(X射线粉末衍射法)青霉素钾样品280nmA<0.10（三）、UV（四）、有机溶剂139含量测定Assay(一)、碘量法(二)、汞量法(三)、酸碱滴定法

(五)、HPLC法四、含量测定

(四)、羟肟酸比色法含量测定(一)、碘量法(二)、汞量法(三)、酸碱滴定法(五140阿莫西林克拉维酸钾片1、色谱条件与系统适用性试验色谱条件:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂以磷酸盐缓冲液-甲醇(95:5)为流动相流速为0.7ml/min检测波长为220nm。系统适用性:阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5阿莫西林克拉维酸钾片1、色谱条件与系统适用性试验系统适用性:1412、测定法(外标法)

本品10片精密称定精密称取适量溶解，定容滤过续滤液供试品溶液阿莫西林0.8mg

/ml克拉维酸0.8mg/ml混合对照品溶液取10l注入液相色谱仪，记录色谱图。分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。2、测定法(外标法)本品10片精密精密称取适量溶142头孢菌素类课件143复习题（一）、选择题1、与化学药品相比，不是抗生素特点的选项是A.化学纯度较低B.同系物、异构体、降解物多C.活性组分易发生变异D.稳定性差E、操作步骤多复习题（一）、选择题1、与化学药品相比，不是抗生素特点的选项1442、以下选项中不是生物学法测定抗生素效价的特点的是

A、测定结果直观B、方法灵敏度较低，检品用量多

C、适用范围广D、误差大E、操作步骤多2、以下选项中不是生物学法测定抗生素效价的特点的是

A、测定145A.6-氨基青霉烷酸B.7-氨基头孢菌烷酸C.7-氨基青霉烷酸D.6-氨基头孢菌烷酸E.以上都不是3、青霉素的母核是A.6-氨基青霉烷酸3、青霉素的母核是146A.6-氨基青霉烷酸B.7-氨基头孢菌烷酸C.7-氨基青霉烷酸D.6-氨基头孢菌烷酸4、头菌孢素的母核是A.6-氨基青霉烷酸4、头菌孢素的母核是1475、青霉素和头孢菌素都属于哪类抗生素A氨基糖苷类Bβ-内酰胺抗生素类C四环素类D喹诺酮类E大环内酯类5、青霉素和头孢菌素都属于哪类抗生素A氨基糖苷类1486、β-内酰胺抗生素类药物分子结构中最不稳定的部分是（

）A.噻唑环B.噻嗪环C.内酰胺环D.芳环.E以上都不对6、β-内酰胺抗生素类药物分子结构中最不稳定的部分是（

1497、头孢菌素类的母核的简称为（

）A、6-APA

B、6-ACA

C、7-APA

D、7-ACAE、7-ASA7、头孢菌素类的母核的简称为（

）A、6-AP1508、青霉素分子中含几个手性碳（

）。A、1

个

B、2个

C、3

个

D、4个

E、0个

8、青霉素分子中含几个手性碳（

）。A、1

个

1519、头孢菌素分子中所含手性碳原子的数目为（）。A、1

个

B、2个

C、3个

D、4个

E、0个9、头孢菌素分子中所含手性碳原子的数目为（）。A、1

15210、β-内酰胺类抗生素的紫外吸收是由于结构中（）A、6－APAB、6-APA的共轭结构侧链C、羰基D、β-内酰胺环E、氢化噻唑环10、β-内酰胺类抗生素的紫外吸收是由于结构中（15311、无旋光性的药物是A、四环素B、青霉素C、盐酸麻黄碱D、乙酰水杨酸E、葡萄糖11、无旋光性的药物是A、四环素154A含有手性碳，具有旋光性B分子中的环状部分无紫外吸收，但其侧链部分有紫外吸收C遇硫酸-甲醛试剂有呈色反应可供鉴别D具有碱性，可与无机酸形成盐E.以上都不是12、青霉素不具有下列哪类性质（）12、青霉素不具有下列哪类性质（）15513、β-内酰胺类抗生素药物具有的性质是A、氢化噻唑环的羟基的酸性B、β-内酰胺环的不稳定C、手性碳原子D、B+CE、A+B+C13、β-内酰胺类抗生素药物具有的性质是A、氢化噻唑环的羟基15614、青霉素具有下列哪类性质（）A、含有手性碳，具有旋光性B、分子中的环状部分有强紫外吸收C、具有碱性，不能与无机酸形成盐D、β-内酰胺为一稳定环E、以上都不对14、青霉素具有下列哪类性质（）A、含有手性碳，具有15715、β-内酰胺类的鉴别反应

A硫酸-硝酸显色反应

B变色酸硫酸显色反应

C羟肟酸铁反应

D还原碘的反应

E还原酒石酸铜的反应15、β-内酰胺类的鉴别反应

A硫酸-硝酸显色反应

B15816、以下药物不发生羟肟酸铁呈色反应的是A.阿莫西林B.青霉素C.四环素D.头孢氨苄E.以上都不对16、以下药物不发生羟肟酸铁呈色反应的是A.阿莫西林15917、青霉素的鉴别方法不包括有（）A红外吸收光谱B紫外吸收光谱C羟肟酸铁反应D与硫酸-甲醛试剂呈色反应E重氮化—偶合反应17、青霉素的鉴别方法不包括有（）A红外吸收光谱16018、青霉素和头孢菌素具有—CONH—结构，可利用下列哪些反应进行鉴别（）A、坂口反应B、印三酮反应C、三氯化铁反应D、双缩尿反应18、青霉素和头孢菌素具有—CONH—结构，可利用下列哪些反161（二）、填空题1、抗生素的效价测定主要分为------和--------两大类2、青霉素的分子结构中的母核为------------（二）、填空题1、抗生素的效价测定主要分为------和--162第三节结构性质含量测定鉴别杂质检查氨基糖苷类药物的分析第三节结构含量测定鉴杂质检查氨基糖苷类药物的分析163

氨基环醇+氨基糖→苷链霉素(Streptomycin)一、结构氨基环醇+氨基糖→苷链霉素(Streptomyc164巴龙霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺脱氧链霉胺巴龙胺D－核糖巴龙霉糖巴龙二糖胺巴龙霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺脱氧链霉胺165庆大霉素(gentamycin)绛红糖胺(紫素胺)2-脱氧链霉胺加洛糖胺(N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺)庆大霉素(gentamycin)绛红糖胺(紫素胺)2-脱氧1661）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐2）溶解度（氨基、羟基）：水溶性3）旋光性（糖）：多个手性碳4）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解二、性质1）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐二、性质1671、茚三酮反应——α-氨基、羟基胺类茚三酮Δ

蓝紫色链霉素庆大霉素三、鉴别1、茚三酮反应——α-氨基、羟基胺类茚三酮蓝紫色链霉素三、鉴1682、Molisch试验红紫色羟甲基糠醛

五碳糖或六碳糖结构蓝紫色2、Molisch试验红紫色羟甲基糠醛五碳糖或六1693、N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色3、N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）乙酰170乙酰丙酮OH-对二甲氨基苯甲醛H+樱桃红色乙酰丙酮OH-对二甲氨基苯甲醛H+樱桃红色1714、麦芽酚反应H+5、坂口反应——链霉胍特有反应链霉素OH-水解8-羟基喹啉NaOBr或α-萘酚链霉胍橙红色链霉糖特有反应4、麦芽酚反应H+5、坂口反应——链霉胍特有反应链霉素OH-172坂口反应麦芽酚反应N-甲基葡萄糖胺反应坂口反应麦芽酚反应N-甲基葡萄1737、色谱法6、硫酸盐反应8、光谱法TLCHPLCUVIR7、色谱法6、硫酸盐反应8、光谱法TLCHPLCUV1741、链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）的检查来源：发酵中产生方法：TLC中的对照品法2、硫酸奈替米星中西索米星的检查(TLC)4、庆大霉素C组分的测定四、杂质检查3、硫酸盐测定——EDTA滴定与HPLC

BP(2005)——HPLC-ECDCh.P——HPLC-ELSDUSP-------HPLC-UV1、链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）的检查来源：发酵中产生方1751）色谱条件填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：水-冰醋酸-甲醇(25:5:70)配制的0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液检测波长：330nm

系统适用性试验：理论板数：按C2组分峰计算应不低于2000。分离度：C2a

峰和C2峰的分离度应符合要求。

1）色谱条件系统适用性试验：1762)测定法

A、0.65mg/ml的样品溶液，精密量取10.0ml，置量瓶中，加异丙醇2ml与邻苯二醛试液1.6ml，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，冷却，滤过，取续滤液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图B、庆大霉素标准品，同法测定。C组分的保留时间依次为：C1、C1a、C2a、C2。量取C1、C1a、C2a、C2的峰面积。3）结果C1应为25％～50％，C1a应为10％～35％，C2a＋C2应为25～50％

。

2)测定法3）结果177庆大霉素无紫外吸收，需衍生化处理后再进行HPLC测定。λmax=330nm庆大霉素无紫外吸收，需衍生化处理后再进行HPLC测定。λma1784）讨论1、柱效：以C2峰计算，理论板数应不低于2000，在此柱效下各组分之间才能达到规定的分离度。为此色谱柱做适当选择。2、流动相：流动相极性适当控制，极性过强，出峰快，分离不佳。C1峰与衍生试剂等杂质峰难分析;极性过弱，出峰太慢。实验表明，C2峰的保留时间控制在20min～30min较为适宜。3、衍生化试剂与衍生物的稳定性：配制后不能久置，生成的衍生物不稳定。一般避光保存可使用三天。4、离子对试剂浓度影响：离子对试剂浓度对庆大霉素OPA衍生物保留值有影响。4）讨论1、柱效：以C2峰计算，理论板数应不低于2000，在179微生物检定法HPLC法五、含量测定微生物检定法五、含量测定180HPLC法HPLC-蒸发光散射法测定硫酸依替米星含量

1、色谱条件和系统适用性试验：固定相：C18流动相：0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（84：16）检测器：蒸发光散射检测器

依替米星和奈替米星混合对照溶液进样：分离度＞1.2重复性（C2b）：RSD＞2.0%HPLC-蒸发光散射法测定硫酸依替米星含量1、色谱条181HPLC蒸发光散射法测定硫酸依替米星含量HPLC蒸发光散射法测定硫酸依替米星含量1822、测定：依替米星对照溶液：1.0mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml。样品溶液：含依替米星约0.5mg/ml的溶液。取对照溶液20ul，进入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积对数值和浓度对数值计算回归方程，r＜0.99。取样品溶液：同法测定，计算依替米星含量。2、测定：依替米星对照溶液：1.0mg/ml、0.25m183复习题（一）、选择题1、硫酸庆大霉素含量（效价）测定方法应采用

A.微生物检定法B.四氮唑比色法C.汞量法D.酸性染料比色法E.柯柏反应比色法复习题（一）、选择题1、硫酸庆大霉素含量（效价）测定1842、庆大霉素无紫外吸收，美国药典采用HPLC法测定C组分时采用什么方法检出

A、三氯化铁显色法B、邻苯二醛衍生化法C、硫醇汞盐法

D、柱后衍生化法E、荧胺衍生化法2、庆大霉素无紫外吸收，美国药典采用HPLC法测定C组分时采1853、下列有关庆大霉素叙述正确的是（）A、在紫外区无吸收B、无茚三酮反应C、有麦芽酚反应D、庆大霉素是由庆大霉素C1、C2构成的复合物E、在230nm处有紫外吸收3、下列有关庆大霉素叙述正确的是（）A、在紫外区无吸1865、庆大霉素C组分的测定采用紫外检测器是利用AC组分的紫外吸收性质BC组分受紫外光激发荧光C邻苯二醛衍生化后具紫外吸收DC组分与流动相作用具紫外吸收EC组分分离过程后具紫外吸收5、庆大霉素C组分的测定采用紫外检测器是利用AC组分的1876、下列反应属于链霉素特征鉴别反应的是（）A、茚三酮反应B、麦芽酚反应C、有N-甲基葡萄糖胺反应D、硫酸-硝酸呈色反应E、三氯化铁反应6、下列反应属于链霉素特征鉴别反应的是（）A、茚三1888、下列反应属于链霉素特有鉴别反应的（）A、茚三酮反应B、麦芽酚反应C、坂口反应D、硫酸-硝酸呈色反应E、三氯化铁反应8、下列反应属于链霉素特有鉴别反应的（）