人腺癌细胞株A549中HIF-1α对生存素的影响,肿瘤学论文

人腺癌细胞株A549中HIF-1α对生存素的影响,肿瘤学论文缺氧是实体瘤生长微环境的显着特征。肿瘤细胞在缺氧环境下发生一系列适应性变化，而缺氧诱导因子是缺氧条件下哺乳动物对缺氧反响的主要调节因子。Semenza等于1992年在缺氧诱导的细胞核抽提物中发现了氧敏亚基〔HIF-1〕和表核亚基〔HIF-1〕，华而不实HIF-1是主要的活性单位。缺氧时，HIF-1表示出增加并移入核内与HIF-1结合，构成有活性的异二聚体HIF-1，与靶基因的启动子或加强子内的一个或多个缺氧反响元件〔hypoxiaresponseelement，HRE〕结合，促进肿瘤血管系生成和肿瘤细胞的增殖。生存素是当前公认的癌基因，文献报道缺氧时HRE与生存素启动子结合，导致生存素的表示出增加。研究发现缺氧诱导的生存素表示出依靠和非依靠HIF-1途径。本研究前期实验证实，非小细胞肺癌〔NSCLC〕组织中生存素蛋白和HIF-1蛋白高表示出且两者表示出呈正相关，靶向HIF-1的短发夹RNA〔shorthairpinRNA，shRNA〕可明显下调生存素表示出。本研究通过凝胶电泳迁移率实验〔EMSA〕验证人腺癌细胞株A549中HIF-1能否与生存素启动子上潜在位点相结合，证实HIF-1结合位点的存在；miRNA干扰技术沉默HIF-1的表示出，进一步论证其对生存素的影响及对A549细胞株生物学特性的影响，为肺癌的发病机制提供实验根据。材料与方式方法1.主要试剂与材料：A549细胞购自上海中科院细胞库；EMSA试剂盒〔美国Promega公司，批号：237021〕；放射性P标记的ATP〔-32P[ATP]〕购自北京市福瑞生物工程公司；G25葡聚糖凝胶购自上海医药工业研究院；核蛋白提取试剂盒〔美国Thermo公司，批号：78833〕；鼠抗人生存素抗体〔美国SantaCruz公司，批号：SC374616〕，兔抗人HIF-1抗体〔北京博奥森生物公司，批号：bs-0737R〕，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG〔北京中杉金桥生物公司，批号：83228〕﹑兔抗鼠IgG〔美国SantaCruz公司，批号：sc66931〕；总RNA提取试剂盒〔德国Qiagen公司，批号：74104〕；逆转录试剂盒〔美国Promega公司，批号：253082〕，PCR扩增试剂盒〔加拿大MBIFermentas公司，批号：K1621〕；生存素探针、所有的引物由上海生工合成；F-12培养基和胎牛血清〔美国Hyclone公司，批号F03039〕；六水氯化钴〔CoCl2，上海国药公司〕；Transwell小室〔美国Corning公司〕；Annexin-VAPC和PI〔美国eBioscience公司〕；CCK-8〔细胞计数试剂盒〕〔碧云天生物技术研究所〕；杀稻瘟菌素〔blasticidin〕，含有pcDNA6.2-GW/EmGFP针对HIF-1〔基因号NM001530〕的miRNA4组干扰质粒及阴性对照组、含有内参的miRNA质粒，Lipofectamine〔脂质体〕TM2000转染试剂盒〔美国Invitrogen公司，批号11668-019〕。2.细胞培养及乏氧的处理：A549细胞以含10%胎牛血清的F-12培养液，于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。将化学缺氧剂CoCl2150mol/ml参加培养液中，模拟肿瘤内部的缺氧微环境。3.EMSA检测生存素核心启动子区上的HIF-1位点：根据核蛋白提取试剂盒讲明书提取A549细胞中核蛋白并定量。用-32P标记探针合成双链后纯化，EMSA电泳，室温下显影、定影。实验分组如下：阴性对照反响〔只要标记好的探针〕、结合反响〔含有核蛋白和标记好的探针〕、探针冷竞争反响〔含有核蛋白、未标记的探针和标记好的探针〕、突变探针的冷竞争反响〔含有核蛋白、未标记的突变探针和标记好的探针〕和超迁移〔Super-shift〕反响〔含有核蛋白、目的蛋白特异抗体和标记好的探针〕。各探针如下：探针1：生存素启动子〔－26～－9bp〕上链序列5-GAGGGCGTGCGCTCCCGA-3，下链序列3-CTCCCGCACGCGAGGGCT-5，探针2：生存素启动子〔－144～－127bp〕上链序列5-GTCGCTGGGTGCACCGCG-3，下链序列3-CAGCGACCCACGTGGCGC-5，探针1突变的序列：上链序列5-GAGGGCAGCGCTCCCGA-3，下链序列3-CTCCCGTCGCGAGGGCT-5，探针2突变的序列：上链序列5-GTCGCTGGAGCACCGCG-3，下链序列3-CAGCGACCTCGTGGCGC-5，HIF-1通用双链寡聚核苷酸序列〔EMSA试剂盒提供〕：上链序列5-TCTGTACGTGACCACACTCACCTC-3，下链序列3-AGACATGCACTGGTGTGAGTGGAG-5。4.HIF-1稳定沉默A549细胞的建立：转染前1d取对数生长期的A549细胞接种于6孔板中，每孔参加2ml含2105个细胞但不含抗生素的培养液，转染时细胞的融合度到达90%～95%。实验分组：未处理组、miRNA1～4转染组及miRNA阴性、-肌动蛋白miRNA对照组。转染实验步骤根据Lipofectinamine〔脂质体〕TM2000讲明书进行，质粒〔g〕∶脂质体〔l〕＝1∶1，经blasticidin10g/ml，3～4周挑选后挑出单克隆细胞扩大培养。5.RT-PCR检测HIF-1、生存素的mRNA表示出：转染后各组细胞根据德国Qiagen公司RNA提取试剂盒讲明书提取总RNA，然后按RT-PCR试剂盒讲明将RNA逆转录为cDNA，以此为模板进行PCR。RT-PCR引物序列、扩增长度及反响条件分别如下：HIF-1上游引物：5-AGCCAGACGATCATGCAGCTACTA3，下游：5-TGTGGTAATCCACTTTCATCCATTG-3，产物长度167bp。PCR三步反响：94℃、30s，59.2℃、30s，72℃、30s，35个循环；生存素上游引物5-AGGTCATCTCGGCTGTTCCTG-3，下游引物5-TCATCCTCACTGCGGCTGTC-3，产物长度147bp；94℃、30s，63.9℃、30s，72℃、30s；30个循环，内参GAPDH上游引物：5-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，下游引物：5-AGCAGAGGGGGCAGAGATGAT-3，长度375bp；95℃、30s，63℃、45s，72℃、60s，30个循环。美国伯乐Bio-Rad凝胶成像仪下观察结果并拍照分析。6.Westernblot检测HIF-1和生存素蛋白的表示出：提取各组细胞的核蛋白，二喹啉甲酸〔Bicinchoninincacid，BCA〕法测定蛋白浓度，每组样本各取蛋白60g，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转法将蛋白转到聚偏二氟乙烯膜上，经5%脱脂奶粉封闭1h〔室温〕后，分别参加一抗兔抗人HIF-1〔1∶300〕、鼠抗人生存素抗体〔1∶200〕，4℃过夜，参加辣根过氧化物酶标记的二抗〔1∶10000〕室温孵育1h，化学发光法显色，以-肌动蛋白〔工作浓度1∶500〕为内参照。用QuantityOne软件分析条带的吸光度。7.细胞增殖检测：经RT-PCR及Westernblot挑选出干扰效果最佳的HIF-1-miRNA细胞，将HIF-1miRNA、HIF-1阴性及未处理的A549各组细胞接种2103/孔于96孔板，每组设6个复孔，分别在5%CO2培养箱中常规培养及参加CoCl2150mol/ml模拟缺氧培养24h、48h及72h，每孔参加10lCCK837℃孵育1h，在酶标仪上450nm处测定各孔吸光度值。8.细胞凋亡检测：各组细胞2105/ml接种于6孔板，在5%CO2培养箱中和参加CoCl2150mol/ml分别培养24h﹑48h及72h后收集细胞，1500r/min离心3min，离心半径100mm，PBS洗涤2次，用1BindingBuffer〔结合缓冲液〕195l重悬细胞，参加Annexin-VAPC〔Ca2＋依靠性磷脂结合蛋白〕及碘化丙啶〔PI〕各5l，4℃避光室温孵育15min，流式细胞仪检测，CellQuest软件分析。9.细胞的迁移力：取处于对数生长的各组A549细胞消化、离心和计数，用无血清的F-12培养液调整细胞密度为5105/ml。在Transwell小室下层均参加500lF-12培养液〔含10%FBS〕，小室上层常氧组参加100l细胞悬液，缺氧组上层参加含CoCl2150mol/L的100l细胞悬液，每组细胞3个复孔，重复3次。放置在37℃，5%CO2培养箱中培养24h后取出，用棉签轻轻擦去膜上层的细胞，膜下层用甲醇固定30min，Giemsa〔吉姆萨〕染色10min，PBS冲洗2遍，倒置显微镜下选取10个视野〔400〕进行细胞计数。10.统计学分析：采用SPSS16.0统计学软件，计量资料以均数标准差〔xs〕表示，组间比拟采用单因素方差分析和t检验，两两比拟采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。结果1.EMSA验证HIF-1与生存素结合位点：生存素启动子序列－26～－9bp为探针与核蛋白作用，自显影后出现DNA-核蛋白复合物滞后条带，此条带可被未标记的探针竞争消除；用含有HIF-1的通用辨别DNA片段为探针时，产生了与生存素启动子序列－26～－9bp为探针时相近的DNA-核蛋白复合物。表示清楚HIF-1与生存素启动子序列－26～－9bp结合，生存素启动子上－19～－16bp位点是HIF-1的结合位点〔图1〕。2.稳转细胞的鉴定：A549细胞分别转染HIF-1miRNA1～4，miRNA-阴性、miRNA--肌动蛋白对照质粒，挑取细胞单克隆进行扩增培养后在荧光显微镜下可见绿色荧光〔GFP〕，表示清楚真核重组质粒稳转成功。3.挑选HIF-1miRNA载体：转染HIF-1miRNA3、4实验组〔0.3130.051，0.4150.051〕的A549细胞HIF-1mRNA的表示出低于未处理组〔1.0420.036〕和阴性对照组〔1.0300.004〕，差异有统计学意义〔F＝436.433，P＜0.0.5〕，因而选择转染HIF-1miRNA-3的细胞株作为后续增殖、凋亡和迁移的实验组，同时检测干扰HIF-1后生存素mRNA的表示出，发现生存素mRNA也相应降低，以miRNA3〔mRNA吸光度值为0.0600.008〕效果最佳，差异具有统计学意义〔F＝0.002，P＜0.01〕〔图2，3〕。用Westernblot法检测A549细胞中的HIF-1和生存素蛋白水平变化，显示HIF-1miRNA3组的HIF-1〔0.5590.051〕和生存素蛋白〔0.0510.003〕表示出明显低于未处理组〔1.4520.146和0.1940.007〕和miRNA阴性组〔1.2490.012和0.1730.005〕，差异有统计学意义〔F＝53.525，331.646，P＜0.05〕〔图4〕。4.HIF-1miRNA在缺氧条件下的表示出：HIF-1沉默组HIF-1〔0.6040.040〕和生存素mRNA〔0.3940.018〕表示出明显减低，各组和常氧条件下相比，HIF-1和生存素mRNA表示出明显增高，差异有统计学意义〔t值分别为7.809，－28.936，P＜0.01〕。QuantityOne定量分析HIF-1沉默组HIF-1和生存素蛋白表示出明显低于常氧条件下，且各组的蛋白水平明显高于常氧〔t值分别为13.523和－14.202〕，差异有统计学意义〔P＜0.01〕〔图5〕。5.HIF-1miRNA对细胞增殖、凋亡和迁移的影响：〔1〕常氧和缺氧条件下HIF-1miRNA对A549细胞增殖的影响：HIF-1沉默组与未处理组、阴性对照组比拟，A549细胞生长遭到抑制，但差异没有统计学意义〔F＝2.426，0.151，0.542，P＞0.05〕。缺氧24h后HIF-1沉默组与各组比拟，细胞生长明显遭到抑制，差异具有统计学意义〔F＝8.048，5.699，34.087，P均＜0.05〕，而对照组间无统计学意义〔表1，2〕。〔2〕常氧和缺氧条件下HIF-1miRNA对A549细胞凋亡的影响：常氧条件下HIF-1沉默组平均凋亡率46.2%〔这是通过流式细胞仪软件测每个门内的比率，指的是细胞计数百分比〕与各对照组比拟〔未处理组44.6%，阴性组44.3%〕，无统计学差异〔F＝2.009，P＞0.05〕；模拟缺氧培养48h后实验组平均凋亡率为62.2%，与各对照组比拟凋亡明显增加，差异具有统计学意义〔F＝26.359，P＜0.01〕，而未处理组平均凋亡率为51.4%，阴性组平均凋亡率为54.5%，两两比拟差异没有统计学意义〔t＝－0.077，P＞0.05〕。〔3〕常氧和缺氧条件下HIF-1miRNA对A549细胞迁移力的变化：常氧和缺氧条件下干扰HIF-1后细胞迁移数明显减少，分别为306〔F＝21.924，P＜0.05〕和754〔F＝170.827，P＜0.01〕，和对照组〔12117〕比拟差异有统计学意义，且缺氧状态下细胞的迁移数明显多于常氧状态下的细胞数〔t＝－2.988，P＜0.01〕。讨论肺癌是当今全球发病率最高的恶性肿瘤，病死率居癌症首位，70%～80%的肺癌患者确诊时已属于晚期，5年生存率仅有16%。因此说明肺癌中高表示出且特异性强的异常基因的功能及相应的调控机制，揭示肺癌发病机制，寻求新的治疗措施成为肿瘤学家的共鸣。缺氧是实体瘤中普遍存在的现象，也是肺癌等实体瘤生长微环境的显着特征。在这种实体瘤适应缺氧的转录调节中，HIF-1起着重要作用，它通过调节一系列基因来维持氧和营养的供应，促进肿瘤的生存和生长。文献报道，在乳腺癌和直肠癌细胞中HIF-1和生存素有很强的相关性，我们前期也证实在NSCLC中HIF-1对生存素表示出存在上调作用且具有肿瘤特异性。生存素是凋亡抑制蛋白〔inhibitorofapoptosisproteins〕家族的成员之一，除了抑制凋亡和保卫细胞的存活外，亦介入血管构成，甚至对肿瘤的浸润、转移和耐药也有作用。很多癌症患者体内生存素水平升高决定了其对放化疗反响的不敏感及预后不良，都与缺氧有关。缺氧下肿瘤特异性的生存素表示出增加，和生存素启动子的缺氧反响原件〔HREs〕结合导致生存素进一步增加。Peng等报道乳腺癌中survivin通过HIF-1上调EGF处理的癌细胞而过表示出；转染HIF-1小干扰RNA〔siRNA〕至直肠癌LS174T细胞后，抑制HIF-1后导致生存素的表示出下降，显示HIF-1对生存素表示出可能有调节作用。本研究通过EMSA证实生存素启动子－19～－16bp区存在HIF-1结合位点，并证实HIF-1对生存素启动子具有正向调控作用。miRNA不仅具有调节细胞增生、分化和活性的功能，还介入生命经过中一系列重要进程。相对于siRNA而言，miRNA在转录后沉默基因的表示出更强。为进一步探明HIF-1对生存素的转录调控机制，用miRNA抑制HIF-1的表示出，观察对生存素转录和翻译的影响。结果显示，在常氧和缺氧条件下，生存素的转录和蛋白水平的表示出均明显减低，进一步证实HIF-1在转录水平调控生存素，生存素可能是HIF-1下游的靶基因。抑制HIF-1表示出，细胞在CoCl2〔氯化钴〕模拟缺氧处理后，生长遭到抑制，且出现凋亡；而在常氧下未出现这种现象。尽管在抑制HIF-1的乳腺癌细胞小鼠移植瘤模型中，移植瘤生长明显减慢；本研究结果显示，仅在缺氧条件下沉默HIF-1才能抑制细胞增殖，促使细胞凋亡，可能是体外和体内肿瘤细胞生长微环境不同。在迁移实验中，用miRNA沉默HIF-1后，无论在常氧还是缺氧条件下，肿瘤细胞的迁移明显遭到抑制，这与增殖和凋亡结果不同，且在缺氧状态下迁移细胞数更多。在乳腺癌中上调HIF-1信号通路伴随着微转移灶的分子信号上调，Krishanlnachary等利用HIF-1特异的siRNA抑制人结肠癌细胞相关基因表示出，降低由于缺氧和HIF-1过表示出导致的肿瘤细胞侵袭转移能力。近期报道HIF-1可促进肿瘤细胞的迁移，牡荆黄素〔一种HIF-1抑制剂〕能够显着抑制大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞的迁移。我们的结果与这些相关报道相吻合，表示清楚HIF-1在肿瘤细胞的迁移中起着核心作用，它过表示出促进癌细胞的转移，与其加强肿瘤细胞游走能力有关，但与缺氧关联不大。揣测活化细胞迁移的相关基因是通过依靠HIF-1的机制。这一切能否与生存素关联，并与肺癌易于早期出现局部浸润和远处转移有关，尚待进一步研究。参考文献[1]SemenzaGL,WangGL.Anuclearfactorinducedbyhypoxiaviadenovoproteinsynthesisbindstothehumanerythropoietingeneenhanceratasiterequiredfortranscriptionalactivation[J].MolCellBiol,1992,12(12):5447-5454.[2]ComerfordKM,WallaceTJ,KarhausenJ,etal.Hypoxia-induciblefactor-1-dependentregulationofthemulti-drugresistance(MDR1)gene[J].CancerRes,2002,62(12):3387-3394.[3]YangL,CaoZ,LiF,etal.Tumorspecificgeneexpressionusingthesurvivinpromoterisfurtherincreasedbyhypoxia[J].GeneTher,2004,11(15):1215-1223.[4]MesriM,Morales-RuizM,AckermannEJ,etal.Suppressionofvascularendothelialgrowthfactor-mediatedendothelialcellprotectionbysurvivintargeting[J].AmJPathol,2001,158(5):1757-1765.[5]ConwayEM,ZwertsF,VanEygenV,etal.Survivin-dependentangiogenesisinischemicbrain:molecularmechanismsofhypoxia-inducedup-regulation[J].AmJPathol,2003,163(3):935-946.[6]ChenYQ,ZhaoCL,LiW.Effectofhypoxia-induciblefactor-1ontranscriptionofsurvivininnon-smallcelllungcancer[J].JExpClinCancerRes,2018,28:29.[7]JemalA,SiegelR,WardE,etal.CancerStatistics,2018[J].CACancerJClin,2018,59(4):225-249.[8]PengXH,KarnaP,CaoZ,etal.Cross-talkbetweenepidermalgrowthfactorreceptorandhypoxia-induciblefactor-1asignalpathwaysincreasesresistancetoapoptosisbyup-regulatingsurvivingeneexpression[J].JBiolChem,2006,281(36):25903-25914.[9]FanLF,DongWG,JiangCQ,etal.Roleofhypoxia-induciblefactor-1andsurvivinincolorectalcarcinomaprogression[J].IntJColorectalDis,2008,23(11):1057-1064.[10]WoelfleU,CloosJ,SauterG,etal.Molecularsignatureassociatedwithbonemarrowmicrometastasisinhumanbreastcancer[J].CancerRes,2003,63(180):5679-5684.[11]YangL,CaoZ,LiF,etal.Tumorspecificgeneexpressionusingthesurvivinpromoterisfurthe