动物细胞工程概述全

第九章动物细胞工程动物细胞工程第一节动物细胞工程概述一、动物细胞工程发展简史二、动物细胞工程的主要领域及意义三、动物细胞特性四、动物细胞培养的环境与营养要求一、动物细胞工程发展简史

（一）融合现象的发现（二）动物组织细胞培养技术的建立（三）细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生（四）动物克隆技术的建立

（一）融合现象的发现19世纪30年代，Muller,Schwann,Virchow等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核细胞现象，但当时并没有引起人们的关注，认为这只是一种特殊现象。

1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象的存在，1855年～1858年，科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。至此，自然界中广泛存在着多核细胞的事实，才被生命科学工作者接受。1859年，A.Barli在研究黏虫的生活史时发现，某些黏虫存在着由单个细胞核融合形成多核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的。

（二）动物组织细胞培养技术的建立

1839年Schwann和Schleiden提出细胞学说时指出：“每一个细胞应该可以独立生活和发展，假如具有的条件正如它存在于有机体内一样。”1859年，法国解剖学家Vnlpian最早尝试将蛙胚尾部组织切下，放到普通水中“培养”，结果观察到了组织的生长和分化现象1880年，德国学者Arnold首次发现白细胞在淋巴液或血清中能够分裂1885年，Roux发现鸡神经板细胞在生理盐水中培养能存活数月，并创用了“外植培养”和“组织培养”一词1889年，Ljunggren将人体皮肤保存在腹水中几天至几周后再做移植手术获得成功

1907年，美国胚胎学家R.Harrison将蛙的胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这片组织在体外不但存活了若干星期，而且还从细胞中长出了轴突(神经纤维)细胞，解决了当时关于轴突起源的争论，并表明了利用体外存活的组织进行实验研究的可能性。他的工作被认为是动物细胞培养开始的标志Carrel(1911)发现了鸡胚浸出液对于某些细胞的生长具有很强的促进效应，还把无菌技术引入了组织培养技术中。作为他的技术标志是，他在不含抗菌素的培养条件下使鸡胚心脏细胞维持生存了34年，先后继代3400次，证明动物细胞有可能在体外无限地生长。1914年，Thomson创立了另一条完全不同的体外组织培养途径－器官培养法，即器官培养技术。1940年，Earle建立了可以无限传代的一个C3H小鼠的结缔组织细胞系－L系。二是1951年，Gay建立了第一个人体细胞系－人体宫颈癌Hela细胞系（三）细胞融合技术的建立

和杂交瘤技术的诞生

1958年,Okada发现紫外灭活的仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。由于仙台病毒能稳定地诱发细胞融合而引起了许多科学家的兴趣，60年代，Harris(1965)诱导不同的动物体细胞融合获得成功并能存活下来。Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷型，利用HAT选择性培养基能使亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞，并能不断地增殖，从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。使这一技术在此后广泛地应用于遗传学、病毒学、免疫学、细胞学等多种学科的研究工作中。

1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。这一技术的诞生把细胞融合技术从实验阶段推向了应用研究阶段，促进了动物细胞工程的蓬勃发展。（四）动物克隆技术的建立

1891，Heape等人首次报道了家兔胚胎移植成功的结果，他们把安哥拉家兔胚胎移植给比利时兔，得到了4只安哥拉家兔。本世纪30年代以后，先后在羊、猪、牛等动物的胚胎移植上获得成功。经过几十年的不断完善和充实，已成为一项比较成熟的繁殖生物学技术。首例克隆动物成功的报道是在1962年，英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有1％的重组卵发育成为成熟蛙。这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径，其贡献在于：实验证明了完全分化的肠细胞仍然具有未分化细胞的全部遗传信息，并能在一定的条件下发育成动物个体，从而证明了动物细胞仍然具有全能性；初步建立了体细胞核移植的实验体系，证明在体细胞核转至胚胎发育方向的早期，卵细胞质对体细胞核的发育功能起着关键性的调节作用，其作用因子可能是细胞质中的mRNA与有关的蛋白质。

1997年2月，英国科学家Wilmut等在世界权威杂志《Nature》上首例报道了世界第一只克隆羊的诞生。它的贡献在于：实验证明了哺乳动物高度分化的细胞同样含有全套遗传信息，亦能在一定条件下发育成动物个体，进一步证明了动物细胞的全能性。

多利诞生的技术路线：

取6岁供体羊乳腺细胞—

血清饥饿培养使细胞处于G0期经GnRH处理取卵细胞—

移去卵细胞的细胞核将培养的乳腺细胞的核移植到去核的卵细胞中重组细胞植入第一受体羊输卵管中培养至胚泡期(桑椹胚)桑椹胚再移植入第二受体羊子宫内发育至分娩。二、动物细胞工程的主要领域及意义（一）单克隆抗体与现代医学（二）动物胚胎工程与畜牧业（三）动物细胞规模化培养与现代医药业（四）动物克隆的有益应用（一）单克隆抗体技术单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myelomacell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridomacell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridomatechnology)。

单克隆抗体的应用单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病诊断，以提高疾病诊断的准确性利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成本，同时也增加了疫苗的安全性。单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜在技术。单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不断发展。

（二）胚胎工程与畜牧业利用胚胎技术可以以工厂形式大批量生产优质胚胎，从而可以降低胚胎成本，扩大移植胚的来源，使农畜动物胚胎移植的推广应用成为可能。体外受精可以准确地确定受精的时间和胚胎发育阶段，因此，利用体外受精技术进行核移植、性别控制和基因导入，可望工厂化生产遗传性稳定、生产性能优良的家畜，以加快农畜良种化。

（三）物细胞规模化培养与现代医药类型产物人疫苗小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗源、疱症、某些癌症动物疫苗口蹄疫、鸡痘病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、犬瘟、草鱼出血病酶尿激酶、细胞色素P450、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶原激活剂激素促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒膜促性腺激素、促黄体激素免疫调节因子干扰素、白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白细胞介素（四）动物克隆的有益应用

动物克隆技术至少在以下几个方面具有广阔的应用前景：保存优良的动物品种；拯救濒临灭绝的珍惜动物；利用克隆动物工厂生产蛋白质药物，发展新型的医药工业；利用克隆技术生产人体器官，扩大器官移植所需的器官来源。三、动物细胞特性1.动物细胞与植物细胞比较2.动物细胞在活体内的特性3.培养条件下动物细胞的生长特性4.培养条件下动物细胞生理特性1动物细胞与植物细胞比较2动物细胞在活体内的特性

·动物细胞在胚胎期即已高度分化，而且这种分化是不可逆转的，

·

活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类：

第一类是能保持继续分裂能力的细胞；

第二类细胞群是永久失去分裂能力的细胞；

第三类是静止细胞群，即所谓的G0细胞。

3培养条件下动物细胞的生长特性

离体培养的动物细胞可分为（1）贴壁依赖型(anchorage-dependent)（2）贴壁非依赖型(anchorage-independent)（3）间性贴壁细胞（1）贴壁依赖型简称贴壁细胞，包括成纤维细胞型和上皮细胞型成纤维细胞型，这种细胞与体内成纤维细胞形态相似，胞内呈梭型或不规则三角形，中央有圆形核胞质向外2～3个长短不同的突起。除真正的成纤维细胞外，心肌、平滑肌细胞培养时均属这一类型。上皮细胞型细胞培养时呈不规则的三角形，中央有圆形核，生长时常彼此紧密相连成单层细胞片，如皮肤的表皮细胞、肝细胞、胰脏细胞和肺泡上皮细胞的培养细胞（2）非贴壁依赖型也称悬浮型，这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液中悬浮生长，来源于血液、淋巴组织的细胞、许多肿瘤细胞等均属于此类，细胞一般呈圆形。（3）兼性贴壁细胞动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞等。四、培养条件下动物细胞生理特性1.动物细胞的分裂周期较长一般为12～48小时，他不仅随细胞种属的不同而有差异，即使同一种属不同部位的细胞所需的时间也不同各类细胞分裂周期时间表2.接触抑制现象除少数悬浮细胞外，大多数正常二倍体细胞都需要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸长后才能增殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片，即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称为接触抑制。3.有限细胞系和永久细胞系大多数细胞继代培养后会转化为两类一类是有限细胞系：有限细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，经过有限世代后细胞将逐渐死亡。另一类是无限（永久细胞系）永久细胞系初代培养物开始传代培养后的细胞，即称之为细胞系，已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（infinitecellline）。4.动物细胞的环境敏感性动物细胞与植物细胞相比，其培养难度要大一些，其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护动物细胞与植物细胞相比对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因素都会影响动物细胞的存活。动物细胞培养对营养条件的要求也十分复杂5.动物细胞培养的环境与营养要求

动物细胞培养的营养要求动物细胞培养的环境要求5（1）（2）PH动物细胞培养适宜的一般在7.2~7.4，低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。培养细胞对PH值的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求较严格，而永久细胞则对PH有较强的忍耐性。

（3）溶氧与气体环境

一般在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或培养后期对溶氧水平要求增加，如果供氧不足将导致细胞缺氧而死亡。除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和二氧化碳的平衡。

（4）渗透压动物培养的渗透压包括两方面：一是培养基的渗透压维持二是细胞体内的渗透压维持动物细胞培养时渗透压的