荧光定量PCR实验技术干货课件

荧光定量PCR技术及数据处理分析项目部荧光定量PCR技术及数据处理分析项目部内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程荧光定量PCR仪生工荧光定量产品选择指南2内容概要荧光定量PCR的原理22荧光定量PCR原理－－定义实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测3荧光定量PCR原理－－定义实时定量PCR技术：33荧光定量PCR原理－－标记方法4SYBRGreenI4TaqManProbe分子信标荧光定量PCR原理－－标记方法4SYBRGreenI4T4SYBRGreenI染料法－－SYBRGreenI5SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI5SYBRGreenI染料法－－SYBRGreenI5SYBRGreenI染料法－－作用机理66SYBRGreenI染料法－－作用机理666SYBRGreenI染料法－－融解曲线7将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱7SYBRGreenI染料法－－融解曲线7将温度与荧光强7SYBRGreenI染料法－－融解曲线8融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光：定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光：定量不准确8SYBRGreenI染料法－－融解曲线8融解曲线分析，8Taqman探针法－－原理95′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)，MGB为不发光的荧光基团探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针，R与Q分开，发荧光。

9Taqman探针法－－原理95′端标记有报告基团(Repo9Taqman探针法－－工作机理10热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRR10Taqman探针法－－工作机理10热变性引物和探针与模板退10Taqman探针法－－PCR体系的建立引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃,<30bp,5’不能有G,G可能会淬灭荧光素引物尽量靠近探针,扩增片段<400bp,引物Tm为59-60℃反应参数的确定：一般为：94℃，10-20S

60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通过温度梯度优化退火温度优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：100-900nM探针浓度：50-300nM其他与常规PCR相同1111Taqman探针法－－PCR体系的建立引物、探针的设计：111实时荧光定量PCR分类－－分子信标12标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂12实时荧光定量PCR分类－－分子信标12标记荧光的发夹探针环12实时荧光定量PCR分类－－分子信标13FRET13实时荧光定量PCR分类－－分子信标13FRET1313几种荧光定量PCR方法的应用比较1414几种荧光定量PCR方法的应用比较141414荧光定量PCR原理－－常用名词概念扩增曲线荧光阈值Ct值1515荧光定量PCR原理－－常用名词概念扩增曲线151515荧光定量PCR原理－－扩增曲线16Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期荧光基团荧光检测元件16荧光定量PCR原理－－扩增曲线16Cycle（循环数）Rn（16荧光定量PCR原理－－荧光阈值17Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置:大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold17荧光定量PCR原理－－荧光阈值17Cycle（循环数）Rn（17荧光定量PCR原理－－Ct值18Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Ctvalue18荧光定量PCR原理－－Ct值18Cycle（循环数）Rn（荧18荧光定量PCR原理－－Ct值的重现性19横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性19荧光定量PCR原理－－Ct值的重现性19横轴：PCR反映循环19荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理20理想的PCR反应Xn＝X02n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0

：起始模板数量n：扩增循环数20荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理20理想的PCR反20荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理21非理想的PCR反应Xn＝X0

（1＋En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0

：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率21荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理21非理想的PCR21荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理22在扩增产物达到荧光阈值时XCt＝X0*（1＋En）Ct＝M

（1）整理方程式（2）：方程式（1）两边同取对数得：XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为MLog2M＝Log2X0

*（1＋En）Ct

（2）Log2X0

=Log

2M

-CtLog2（1＋En）22荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理22在扩增产物达到22荧光定量PCR原理－－Ct值与起始模板量的关系23CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。23荧光定量PCR原理－－Ct值与起始模板量的关系23Cycle23荧光定量PCR原理－－荧光定量反应性的确认24线性关系、扩增效率确认相关系数（R2）：大于0.98标准曲线斜率：-3－-3.5PCR扩增效率（E）：0.9-1.2检测灵敏度确认35Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增Notemplatecontrol确认35Cycles内无引物二聚体产生24荧光定量PCR原理－－荧光定量反应性的确认24线性关系、扩增24荧光定量PCR技术的主要应用定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差异显示结果验证等2525荧光定量PCR技术的主要应用定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，25荧光定量PCR的解析方法绝对定量解析方法相对定量解析方法2626荧光定量PCR的解析方法262626绝对定量的定义27Sample25Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量27绝对定量的定义27Sample25Log（起始浓度）与循环数27绝对定量分析几要素28一个目的基因

——即需要确定其量值的核酸序列。一组标准样本

——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。重复反应孔–——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。标记方法的选择——SYBRGreenI法或Taqman探针法均可。实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。28绝对定量分析几要素28一个目的基因——即需要确定其量值的核28绝对定量质粒标准品的制备29PCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因质粒目的基因基因组DNA质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用29绝对定量质粒标准品的制备29PCR目的基因克隆目的基因目的基29质粒标准品稀释方法30倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v30质粒标准品稀释方法30倍比梯度稀释方法：3030绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量31方法：检测毕赤酵母的A基因标准品：质粒标准品浓度为5个浓度；3个重复；设阴性空白对照实验步骤：提取ADNA；

设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取毕赤酵母的A的精确copy数。31绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量31方法：检测毕赤31绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量3232绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量323232绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量33扩增效率（E）计算

E=10-1/斜率

-1=10-1/-3.481

-1

=1.983-1=0.938标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.481x+40.123R2=0.9996

相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.8-1.2,越接近1，越理想。33绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量33扩增效率（E）33绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量34未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：18.45=-3.481X+40.123QuantityUnknown=106.226

=1682674copiesX=18.45-40.123-3.481=6.22634绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量34未知样品拷贝数34相对定量的必要性35SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同实际目的基因表达量分析35相对定量的必要性35SampleBSampleA目的基因35相对定量分析方法36比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！36相对定量分析方法363636相对定量分析几要素37一个参照样本一个或一个以上的未知样本一个目的基因管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量重复反应孔——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性标记方法的选择——SYBRGreen法或探针法均可实验结果显示——扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）一组标准样本（有些分析方法不需要）37相对定量分析几要素37一个参照样本3737相对定量分析－－管家基因筛选38管家基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因，如：GAPDH、Actin、18SrRNA等筛选方法根据文献提供通过具体实验筛选0123456Sample1Sample2Sample3Sample4实验组实验值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O38相对定量分析－－管家基因筛选38管家基因0123456Sa38相对定量分析－－两种常用的分析方法39双标准曲线法2-△△Ct法39相对定量分析－－两种常用的分析方法393939相对定量分析－－双标曲线法40通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。公式：相对值=校正值=目的基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值对照样品的校正值40相对定量分析－－双标曲线法40通过标准曲线对对照样品、待测样40相对定量分析－－双标曲线法41优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一实验数据41相对定量分析－－双标曲线法41优点：分析简单，实验优化相对简41相对定量分析－－2－△△Ct法42假设目标序列与内参序列扩增效率相同：或最后用任一待测样本q的XN

除以对照样本（calibrator，cb）的XN

得到：

对于一个少于150bp的扩增片断而言，如果Mg2+浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：XT是目标基因达到设定的阈值时的分子数RT是内参基因达到设定的阈值时的分子数42相对定量分析－－2－△△Ct法42假设目标序列与内参序列扩增42相对定量分析－－2－△△Ct法43公式：F=2－优点：无需作标准曲线缺点：假定扩增效率为100%；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；实验条件优化较为复杂。应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一

待测组目的基因平均Ct值待测组内参基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组内参基因平均Ct值－－－43相对定量分析－－2－△△Ct法43公式：F=2－优点：无需43相对定量分析－－2－△△Ct法44实验数据：2-△△Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%

△Ct（处理前）＝15－13＝2△Ct（处理后）＝18－20=－2

△△Ct=△Ct（处理后）－△Ct（处理前）＝－2－2＝－4比率（处理后/处理前）＝2－△△Ct＝2－（－4）＝16所以Jun基因在处理后表达水平是处理前的16倍修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正为：E－△△Ct，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为1.95－△△Ct44相对定量分析－－2－△△Ct法44实验数据：2-△△Ct44荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项45样品制备定量体系配备引物设计反应条件优化浓度确定技能要求环境要求误差控制数据分析仪器介绍RT上机反应体系优化试剂选择分析方法45荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项45样品制45荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项46样品制备环境要求定量体系配备数据分析RT上机浓度确定无RNase环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具纯度高、完整性好的RNA分光光度计检测电泳检测46荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项46样品制46荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项47样品制备试剂选择定量体系配备数据分析RT上机反应体系优化AMVM-MLV高效，全长的cDNA下游反应数确定反转录体积引物的选择47荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项47样品制47荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项48样品制备误差控制定量体系配备数据分析RT上机浓度确定引物设计环境要求使用mix降低系统误差设置重复（≥3次）设置空白和阴性对照均一的反应液和模板混合物制作标准曲线设定浓度区间GC％：50－60％Tm：50－65℃单个碱基重复＜4个无二级结构扩增长度：100－200bp核酸制备区反应液制备区48荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项48样品制48荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项49样品制备定量体系配备数据分析RT上机反应体系优化反应条件优化标准品待测样本阳性对照阴性对照退火温度优化：梯度PCR延伸时间：产物长度决定反应体积＞5ul，推荐20－50ul引物浓度优化，模板量优化Mg2＋调节，酶活调节扩增效率：90％－110％重复性：std＜0.2标准曲线：R＞0.99或R2＞0.9849荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项49样品制49荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项50样品制备定量体系配备数据分析RT上机自配购买即用型RCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO-RADOpticonseriesABI-7seriesBioer－Linegeneseries分装控制内参控制机器校正控制可靠，准确的数据技能要求误差控制仪器介绍试剂选择50荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项50样品制50荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项51样品制备定量体系配备数据分析RT上机仪器介绍分析方法平滑曲线，重复性好，灵敏度高相对定量：2－△△Ct法绝对定量：标准曲线法51荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项51样品制51荧光定量PCR实验技术干货课件52荧光定量PCR技术及数据处理分析项目部荧光定量PCR技术及数据处理分析项目部内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程荧光定量PCR仪生工荧光定量产品选择指南54内容概要荧光定量PCR的原理254荧光定量PCR原理－－定义实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测55荧光定量PCR原理－－定义实时定量PCR技术：355荧光定量PCR原理－－标记方法56SYBRGreenI56TaqManProbe分子信标荧光定量PCR原理－－标记方法4SYBRGreenI4T56SYBRGreenI染料法－－SYBRGreenI57SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI57SYBRGreenI染料法－－SYBRGreenI57SYBRGreenI染料法－－作用机理5858SYBRGreenI染料法－－作用机理6658SYBRGreenI染料法－－融解曲线59将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱59SYBRGreenI染料法－－融解曲线7将温度与荧光强59SYBRGreenI染料法－－融解曲线60融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光：定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光：定量不准确60SYBRGreenI染料法－－融解曲线8融解曲线分析，60Taqman探针法－－原理615′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)，MGB为不发光的荧光基团探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针，R与Q分开，发荧光。

61Taqman探针法－－原理95′端标记有报告基团(Repo61Taqman探针法－－工作机理62热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRR62Taqman探针法－－工作机理10热变性引物和探针与模板退62Taqman探针法－－PCR体系的建立引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃,<30bp,5’不能有G,G可能会淬灭荧光素引物尽量靠近探针,扩增片段<400bp,引物Tm为59-60℃反应参数的确定：一般为：94℃，10-20S

60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通过温度梯度优化退火温度优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：100-900nM探针浓度：50-300nM其他与常规PCR相同6363Taqman探针法－－PCR体系的建立引物、探针的设计：163实时荧光定量PCR分类－－分子信标64标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂64实时荧光定量PCR分类－－分子信标12标记荧光的发夹探针环64实时荧光定量PCR分类－－分子信标65FRET65实时荧光定量PCR分类－－分子信标13FRET1365几种荧光定量PCR方法的应用比较6666几种荧光定量PCR方法的应用比较141466荧光定量PCR原理－－常用名词概念扩增曲线荧光阈值Ct值6767荧光定量PCR原理－－常用名词概念扩增曲线151567荧光定量PCR原理－－扩增曲线68Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期荧光基团荧光检测元件68荧光定量PCR原理－－扩增曲线16Cycle（循环数）Rn（68荧光定量PCR原理－－荧光阈值69Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置:大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold69荧光定量PCR原理－－荧光阈值17Cycle（循环数）Rn（69荧光定量PCR原理－－Ct值70Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Ctvalue70荧光定量PCR原理－－Ct值18Cycle（循环数）Rn（荧70荧光定量PCR原理－－Ct值的重现性71横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性71荧光定量PCR原理－－Ct值的重现性19横轴：PCR反映循环71荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理72理想的PCR反应Xn＝X02n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0

：起始模板数量n：扩增循环数72荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理20理想的PCR反72荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理73非理想的PCR反应Xn＝X0

（1＋En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0

：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率73荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理21非理想的PCR73荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理74在扩增产物达到荧光阈值时XCt＝X0*（1＋En）Ct＝M

（1）整理方程式（2）：方程式（1）两边同取对数得：XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为MLog2M＝Log2X0

*（1＋En）Ct

（2）Log2X0

=Log

2M

-CtLog2（1＋En）74荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理22在扩增产物达到74荧光定量PCR原理－－Ct值与起始模板量的关系75CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。75荧光定量PCR原理－－Ct值与起始模板量的关系23Cycle75荧光定量PCR原理－－荧光定量反应性的确认76线性关系、扩增效率确认相关系数（R2）：大于0.98标准曲线斜率：-3－-3.5PCR扩增效率（E）：0.9-1.2检测灵敏度确认35Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增Notemplatecontrol确认35Cycles内无引物二聚体产生76荧光定量PCR原理－－荧光定量反应性的确认24线性关系、扩增76荧光定量PCR技术的主要应用定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差异显示结果验证等7777荧光定量PCR技术的主要应用定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，77荧光定量PCR的解析方法绝对定量解析方法相对定量解析方法7878荧光定量PCR的解析方法262678绝对定量的定义79Sample25Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量79绝对定量的定义27Sample25Log（起始浓度）与循环数79绝对定量分析几要素80一个目的基因

——即需要确定其量值的核酸序列。一组标准样本

——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。重复反应孔–——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。标记方法的选择——SYBRGreenI法或Taqman探针法均可。实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。80绝对定量分析几要素28一个目的基因——即需要确定其量值的核80绝对定量质粒标准品的制备81PCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因质粒目的基因基因组DNA质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用81绝对定量质粒标准品的制备29PCR目的基因克隆目的基因目的基81质粒标准品稀释方法82倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v82质粒标准品稀释方法30倍比梯度稀释方法：3082绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量83方法：检测毕赤酵母的A基因标准品：质粒标准品浓度为5个浓度；3个重复；设阴性空白对照实验步骤：提取ADNA；

设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取毕赤酵母的A的精确copy数。83绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量31方法：检测毕赤83绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量8484绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量323284绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量85扩增效率（E）计算

E=10-1/斜率

-1=10-1/-3.481

-1

=1.983-1=0.938标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.481x+40.123R2=0.9996

相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.8-1.2,越接近1，越理想。85绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量33扩增效率（E）85绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量86未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：18.45=-3.481X+40.123QuantityUnknown=106.226

=1682674copiesX=18.45-40.123-3.481=6.22686绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量34未知样品拷贝数86相对定量的必要性87SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同实际目的基因表达量分析87相对定量的必要性35SampleBSampleA目的基因87相对定量分析方法88比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！88相对定量分析方法363688相对定量分析几要素89一个参照样本一个或一个以上的未知样本一个目的基因管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量重复反应孔——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性标记方法的选择——SYBRGreen法或探针法均可实验结果显示——扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）一组标准样本（有些分析方法不需要）89相对定量分析几要素37一个参照样本3789相对定量分析－－管家基因筛选90管家基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因，如：GAPDH、Actin、18SrRNA等筛选方法根据文献提供通过具体实验筛选0123456Sample1Sample2Sample3Sample4实验组实验值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

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O90相对定量分析－－管家基因筛选38管家基因0123456Sa90相对定量分析－－两种常用的分析方法91双标准曲线法2-△△Ct法91相对定量分析－－两种常用的分析方法393991相对定量分析－－双标曲线法92通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。公式：相对值=校正值=目的基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值对照样品的校正值92相对定量分析－－双标曲线法40通过标准曲线对对照样品、待测样92相对定量分析－－双标曲线法93优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一实验数据93相对定量分析－－双标曲线法41优点：分析简单，实验优化相对简93相对定量分析－－2－△△Ct法94假设目标序列与内参序列扩增效率相同：或最后用任一待测样本q的XN

除以对照样本（calibrator，cb）的XN

得到：

对于一个少于150bp的扩增片断而言，如果Mg2+浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：XT是目标基因达到设定的阈值时的分子数RT是内参基因达到设定的阈值时的分子数94相对定量分析－－2－△△Ct法42假设目标序列与内参序列扩增94相对定量分析－－2－△△Ct法95公式：F=2－优点：无需作标准曲线缺点：假定扩增效率为100%；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；实验条件优化较为复杂。应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一

待测组目的基因平均Ct值待测组内参基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组内参基因平均Ct值－－－95相对定量分析－－2－△△Ct法43公式：F=2－优点：无需95相对定量分析－－2－△△Ct法96实验数据：2-△△Ct