基因工程载体3

质粒载体载体噬菌体载体

动物病毒载体大肠杆菌质粒载体pBR322

单链DNAM13载体

SV40载体

乳头瘤病毒载体昆虫杆状病毒载体柯斯(COS)载体

λ噬菌体载体

枯草杆菌质粒载体pNC3酵母菌质粒载体2μ

农杆菌Ti质粒载体Ti一基因工程的基本元件

------载体四、E.coli质粒载体

1.pBR322

是基因工程中最重要的一个人工质粒,有万能质粒之美称.①pBR322的构建复制子:松弛型选择标记:Amp、Tet筛选形式:抗性插入失活单一切点:24个③物理图谱②pBR322的特性pBR322plasmidF.BolivarR.L.RodriguezBacterialResistancepBR322酶切图谱2.pUC系统美国加利福尼亚大学的科学家J.Messing和J.Vieria于1987年首先构建来自pBR322质粒的复制起点氨苄青霉素的抗性基因大肠杆菌β-半乳糖酶基因的启动子及其编码的α-肽链基因（lacZ’）位于lacZ’基因内的一段MCS区段2.pUC系统X-gal溴氯吲哚+β-半乳糖苷-----蓝白斑筛选插入片段无酶活性白斑未插入片段有酶活性蓝斑β-半乳糖苷酶3.TA载体经TaqDNA聚合酶扩增后的PCR产物末端都带有单个A酵母菌质粒载体食品级微生物适合于真核基因表达基因产物外分泌七、酵母菌质粒载体

多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为2μ质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主复制功能区域（ARS片段）。整合型、复制型、附加型和稳定型等类型。

①含有E.coli质粒的复制起始序列。②含有酵母的筛选标记（如LEU2）③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。2.酵母菌质粒载体的特点1.酵母菌质粒载体的类型TypeNameDescriptionbacterialoriginColE1ColE1(pUC-type)originofreplicationpromoterGal1-10promoterGal1-10yeastpromoterselectablemarkerampRampicillinresistancegeneselectablemarkerchlRchloramphenicolresistancegeneLOSTinrecombined(withinsert)formselectablemarkerURA3URA3auxotrophyselectablemarker(yeast)yeastcentromereCEN4yeastcentromericsequenceyeastoriginARS1ARS1yeastoriginofreplication④酵母菌菌稳定型型质粒载载体着丝粒粒第二节节噬噬菌体体载体体一、λ噬菌体体载体体1.λ噬菌体体结构构特点点:①线性性双链链DNA分子②可在在E.coli中大量量繁殖殖③具非非必需需区(约1/3长度度）④两端端具12个个核苷苷酸单单链互互补粘粘性末末端λ噬菌体体线性性DNA分子的的粘性性末端端及其其环化化作用用（a）具有有互补补单链链末端端（粘粘性末末端））的λDNA分子。。（b）当进进入宿宿主细细胞后后，通通过粘粘性末末端之之间的的碱基基配对对作用用实现现的线线性分分子的的环化化作用用，由由此形形成的的双链链区叫叫做cos位点GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACGcos5’-P5’-P3’3’粘性末端环化作用（a）（b）2、λ噬菌体体的缺缺陷与与改造造λ噬菌体体的缺缺陷：：⑴酶酶切点点太多多5个BamH1位点，，6个BglⅠ位点，，5个EcoRⅠⅠ位点。。⑵野野生型型只能能接纳纳一定定长度度的DNA。λ噬菌体体的75-105%，只能能接纳纳49kb××5%=2.45kb的DNA。λ噬菌体体的改改造：：⑴切切去非非必须须区段段，在在切去去的同同时，，加载载目的的基因因（15-23Kb）；⑵去去除过过多的的酶切切位点点，每每种酶酶只留留1-2个切口口；⑶增增加选选择标标记基基因（（selectablemarker）；⑷建立λDNA的体外包装装。主要外壳蛋蛋白质是基基因E的产物头部前体连环DNA基因A的产物在cos位点切割噬噬菌体DNA包含在外壳壳中的基因因D的产物基因W和FII的产物组装装蛋白质加加完整的尾尾部噬菌体的包包装过程sup-细菌头部基因（（琥珀突突变型）尾部基因（（琥珀突突变型）转录复制蛋蛋白质质合成组装尾部所所需要的组组分“无头部”的提取物组装头部所所需要的组组分“无尾部”的提取物温育完整的噬菌菌体转录复制蛋蛋白质质合成T4噬菌体的体体外包装λDNA的体外包装装体外包装的的重组DNA比裸露的DNA导入受体细细胞的效率率高100-10000倍4.凯伦噬菌体体载体克隆隆过程5.λ噬菌体载体体优点:用途:主要用于建建立真核生生物的基因因文库①感染高效效:比质粒粒高百倍②容容量量大大:可可达达15Kb(不得得超超过过原原来来长长度度的的105%,不不得得短短于于原原来来长长度度的的75%)③易操操作作,易易保保藏藏二、、柯柯斯斯(COS)载体体(cosmid)1.柯柯斯斯载载体体的的组组成成带有有抗抗药药性性标标记记带有有质质粒粒的的复复制制起起始始点点带有有多多个个限限制制酶酶的的单单一一切切点点带有有λ噬菌菌体体粘粘性性末末端端片片段段由质质粒粒和和λ粘性性末末端端““尾尾巴巴””两两部部分分组组成成。。2.柯斯斯载载体体的的特特点点3.cosmid载体的优优点能象λDNA一样体外外包装，，并高效效导入受受体细胞胞可以装载载比质粒粒或λDNA大得多的的外源DNA片段cos区1.7kb+质粒部分分外源DNA由于携带带质粒的的选择标标记，便便于筛选选由于质粒粒上的多多种单一一酶切位位点，便便于克隆隆。利用柯斯斯载体载载体进行行基因克克隆的一一般程序序三、M13噬菌体克克隆载体体1.M13的特性:环状,单链链DNA,6.407Kb2.M13噬菌体作为载载体优越性单链DNA噬菌体的复制制，是以双链链环形的DNA为媒介的，这这种复制形式式的DNA简称RFDNA；不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠肠杆菌；单链DNA噬菌体颗粒的的大小，是受受其DNA的大小制约的的，不存在包包装限制问题题；可产生含外源源片断的单链链DNA分子。2.M13载体的构建五、噬菌体展展示载体其基本原理是是将外源DNA片段插入噬菌菌体编码蛋白白基因PⅢ中，使外源DNA片段对应的表表达产物融合合在噬菌体的的外壳蛋白中中形成融合蛋蛋白，呈现在在噬菌体表面面。质粒λ噬菌体柯斯质粒单链噬菌体克隆DNA大片段±*++-构建基因组文库-++-构建DNA文库+---常规的亚克隆化+---构建新型的DNA结构+---序列分析+--+单链探针---+外源基因在大肠杆菌中的表达+---*

外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低

四种常用载体体的比较9、静夜四无邻邻，荒居旧业业贫。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黄叶叶树，灯下下白头人。。。06:03:1106:03:1106:0312/23/20226:03:11AM11、以我独独沈久，，愧君相相见频。。。12月-2206:03:1106:03Dec-2223-Dec-2212、故人江江海别，，几度隔隔山川。。。06:03:1106:03:1106:03Friday,December23,202213、乍见翻疑梦梦，相悲各问问年。。12月月-2212月月-2206:03:1106:03:11December23,202214、他乡生白发发，旧国见青青山。。23十二月月20226:03:11上午午06:03:1112月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。十二二月月226:03上上午午12月月-2206:03December23,202216、行行动动出出成成果果，，工工作作出出财财富富。。。。2022/12/236:03:1106:03:1123December202217、做前，能能够环视四四周；做时时，你只能能或者最好好沿着以脚脚为起点的的射线向前前。。6:03:11上上午6:03上上午06:03:1112月-229、没有有失败败，只只有暂暂时停停止成成功！！。12月月-2212月月-22Friday,December23,202210、很很多多事事情情努努力力了了未未必必有有结结果果，，但但是是不不努努力力却却什什么么改改变变也也没没有有。。。。06:03:1106:03:1106:0312/23/20226:03:11AM11、成成功功就就是是日日复复一一日日那那一一点点点点小小小小努努力力的的积积累累。。。。12月月-2206:03:1106:03Dec-2223-Dec-2212、世世间间成成事事，，不不求求其其绝绝对对圆圆满满，，留留一一份份不不足足，，可可得得无无限限完完美美。。。。06:03:1106:03:1106:03Friday,December23,202213、不知知香积积寺，，数里里入云云峰。。。12月月-2212月月-2206:03:1106:03:11December23,202214、意志志坚强强的人人能把把世界界放在在手中中像泥泥块一一样任任意揉揉捏。。23十十二二月20226:03:11上上午06:03:1112月月-2215、楚塞三三湘接，，荆门九九派通。。。。十二月226:03上午午12月-2206:03December23,202216、少少年年十十五五二二十十时时，，步步行行夺夺得得胡胡马马骑骑。。。。2022/12/236:03:1106:03:1123December202217、空空山山新新雨雨后后，，天天气气晚晚来来秋秋。。。。6:03:11上上午午6:03上上午午06:03:1112月月-229、杨柳散和风风，青山澹吾吾虑。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、阅读一切好好书如同和过过去最杰出的的人谈话。06:03:1206:03:1206:0312/23/20226:03:12AM11、越是没有本本领的就越加加自命不凡。。12月-2206:03:1206:03Dec-2223-Dec-2212、越是是无能能的人人，越越喜欢欢挑剔剔别人