基因工程第章 DNA重组的操作

Review第三部分目的基因的分离目的序列已知：一般采用PCR技术或分子杂交技术分离克隆目的基因目的序列未知：差异表达序列无差异表达的目的序列，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法、序列克隆法一、目的基因的功能克隆根据蛋白质的基本生化特性这一功能信息，在获知基因的功能后克隆其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库，然后从文库中筛选目的基因(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从cDNA表达文库中筛选相应克隆。二、序列克隆法根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因采用核酸探针杂交筛选或用PCR技术进行分离三、差别杂交法适用范围：组织特异性表达或特定发育阶段表达的基因受生长因子调节的基因经特殊处理诱导表达的基因应用前提：基因在两种不同的细胞群体中的差异性表达（一个细胞群体中正常表达，另一个细胞群体中目的基因不表达）。基本过程制备两种细胞群体的的mRNA提取物以两种总mRNA或cDNA为探针以表达目的基因的细胞群体构建cDNA文库有目的基因表达的mRNA探针，重组体菌落阳性反应目的基因不表达的mRNA探针，除目的基因之外，其余菌落都为阳性反应比较底片，对照原板，可挑选出含选目的基因的菌落cDNA文库母板目的基因有表达目的基因无表达无有无有说明含目的基因说明含目的基因四、减法杂交技术又称差减杂交、扣除杂交、减数杂交、消减杂交本质：尽量去除两种样品中普遍共同存在的基因序列，从而使目的基因序列得到有效的富集，从而提高基因筛选分离的敏感性两种策略：mRNA减法杂交基因组减法杂交mRNA减法杂交提取表达目的基因的细胞mRNA，反转录成cDNA提取不表达目的基因的细胞mRNA过量杂交两种组织中均表达的基因产物形成cDNA/mRNA杂交分子特异mRNA反转录的cDNA片段仍保持单链减数杂交技术分离差异表达基因DNA/RNA杂交分子可结合在羟基磷灰石柱上，而游离的单链cDNA则过柱流出。回收的cDNA转变为双链cDNA后克隆倒适当的载体中，就成为一个减数文库。五、mRNA差别显显示技术又称为差别别显示反转转录PCR（DDRT-PCR）目的序列未未知，1992年由由美国哈佛佛大学医学学分校Dena-Farber研究所所的两位科科学家Liang和和Pardee首次次提出的，，并运用这这种方法来来分离一对对培养的哺哺乳动物细细胞中差别别表达的基基因。至今今，运用mRNA差差别显示技技术分离、、鉴定的差差别表达基基因大约有有300多多个。3’端锚锚定引物锚定引物的的通式是oligo(dT)12MN，其中中M为A、、C、G中中的任意一一种，N为为A、C、、G或T中中的任意一一种，所以以共有12种种oligo(dT)12MN引物，，用这12种引物分分别对同一一总RNA样品进行行cDNA合成，即进行12次不同同的反转录录反应，每每一种3’’端锚定定引物，都都能够把总总mRNA群体的1／12分分子反转录录成mRNA-cDNA杂交交分子。这样可以将将整个mRNA群体体在cDNA水平上上，分成大大致相等但但序列结构构不同的12份亚群群体。这一一过程叫做做差异显示反反转录，即DDRT。5’端随机机引物另外，还需需要另外一一种由10个核核苷酸组成成的5’端端随机引物物。这种5’’随机引物物可以同特特定细胞类类型的总mRNA群群体中的一一部分分子子发生杂交交作用，而而且杂交部部位是随机机地分布在在距每条新新合成的cDNA链链3’端的的不同位置置上。用3’端端锚定引物物和5’’随机引物物组成的引引物对，以以mRNA/cDNA为模板板进行PCR扩增，，然后经过过2～3h的变性聚聚丙烯酰胺胺凝胶电泳泳，可以显显示出在100～500bp之间的DNA条带带20种5’端随机机引物12种3’端锚定定引物240组引引物，进行行PCRPCR过程程中加入放放射性标记记变型聚丙烯烯酰氨凝胶胶电泳放射自显影影显示差异异表达条带带对差异表达达条带进行行割胶回收收并制备成成探针，从从文库中筛筛选差别显示分分析基本流流程基本程序提取两种细细胞的总mRNA,反转录后后成为2种种cDNA以一定的引引物作随机机聚合酶链链反应通过扩增产产物的电泳泳分析,分分离出不同同样品间的的差异条带带将差异DNA做成探探针在cDNA文库或基基因组文库库中筛选基基因并作功功能分析优点：几乎可检测测细胞表达达的所有基基因可同时比较较多种细胞胞类型可同时展现现所有差异异用量少，操操作简单，，快速高效效缺点：12种锚定定引物和20种随机机引物，240次PCR聚丙烯酰胺胺凝胶电泳泳分离片段段小于500bp有些差别条条带成簇出出现，造成成假阳性缺乏定量分分析手段，，判断差异异条带有难难度第六章DNA重组组的操作第一节受受体细胞胞易于重组DNA分子子的导入能使重组DNA分子子稳定存在在于细胞中中便于重组体体的筛选遗传稳定性性高安全性高有利于外源源基因的高高效分泌表表达在遗传密码码的应用上上无偏倚性性具有较好的的转译后加加工机制有较高的应应用价值1、原核生物细细胞是较为理想想的受体细细胞大多原核生生物没有坚坚硬的细胞胞壁没有核膜，，有利于外外源片断重重组基因组简单单，便于对对外源基因因进行遗传传分析多为单细胞胞生物，繁繁殖迅速，，过程简单单缺陷：以原核生物物表达真核核生物基因因存在问题题，很多真真核生物基基因不能在在E.coli中表达具生生物活性的的功能蛋白白。缺乏乏真真核核生生物物蛋蛋白白质质折折叠叠复复性性系系统统缺乏蛋蛋白质质加工工系统统原核生生物内内源蛋蛋白易易降解解空间间构象象不正正确的的异源源蛋白白，造造成表表达产产物不不稳定定常用受受体菌菌：大肠杆杆菌人人胰岛岛素、、生长长素、、干扰扰素等等枯草杆杆菌人人ββ干扰扰素、、白细细胞介介素乙肝病病毒核核心抗抗原等等蓝藻易易于于表达达植物物基因因2、真真菌细细胞低等真真核生生物酵母菌菌：以以芽殖殖或裂裂殖方方式进进行无无性繁繁殖的的单细细胞真真核微微生物物，易易于表表达外外源真真核基基因基因结结构最最为简简单的的真核核生物物之一一具有真真核生生物蛋蛋白翻翻译后后修饰饰加工工系统统不含有有特异异性病病毒，，不产产生毒毒素培养简简单可将外外源基基因表表达产产物分分泌至至胞外外3、植植物细细胞坚硬的的细胞胞壁纤维素素酶处处理－－原生生质体体摄取外外源片片断全能性性：在在合适适的培培养条条件下下，一一个分分离的的活细细胞可可分化化成植植株。。水稻，棉花花，玉米，，马铃薯，，烟草等4、动物细细胞早期：生殖殖细胞、受受精卵细胞胞或胚细胞胞现在：体细细胞培养动物：猪猪、羊、牛牛、鱼、鼠鼠、猴等生产天然状状态的复杂杂蛋白质动物疫苗动物品种的的遗传改良良人类疾病的的基因治疗疗第二节重重组体体导入受体体细胞2.1重组质粒DNA转化化大肠杆菌菌转化（transformation）定义转化微生物物的种类感受态细胞胞P139转化过程供体（donor）：提供DNA的生生物受体（recipientorhost）：获得DNA的生生物1.定义转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片断断而获得后后者部分遗遗传性状的的现象。转化子（transformant）：通过转化方式式而形成的杂杂种后代。2.转化微生生物的种类首次发现转转化现象肺肺炎炎链球菌（（Griffith,1928）嗜血杆菌属属、芽孢杆杆菌属、奈奈瑟氏球菌菌属、根瘤瘤菌属、葡葡萄球菌属属、假单胞胞菌属、黄黄单胞菌属属等。3.感受态（competence）感受态：指指受体细胞胞最易接受受外源DNA片断并并能实现转转化的一种种生理状态态。感受态是细细菌的一种种遗传特性性，而且也也受生长阶阶段、培养养条件的影影响。肺炎链球菌菌对对数生长后后期芽孢杆菌属属指指数期末和和稳定期大肠杆菌刚刚进入对对数期DH5α菌菌株的OD600为为0.5时,细胞胞密度在5×107个/ml左左右大肠杆菌革兰氏阴性性菌细胞表面的的结构和组组成与革兰兰氏阳性菌菌不同转化因子的的吸收较为为困难人工制备感感受态细胞胞4.转化化过程大肠杆菌的的转化方法法：Ca2＋诱导大肠杆杆菌转化法法电穿孔转化化法三亲本杂交交接合转化化大肠杆菌菌1、Ca2＋诱导大肠杆杆菌转化法法培养生命活动旺旺盛的菌体体菌种分纯活活化，扩大大培养，处处于对数生生长期沉淀菌体冰水浴中预预冷10分分钟，4℃离心心化合物处理理含CaCl2无菌预冷缓冲液液处理DNA分子子转化感受受态细胞制备感受态态细胞的注注意事项1.细胞胞生长状态态和密度:不要用经过过多次转接接或储于４４℃的培养养菌，最好好从－70℃℃或－－20℃℃甘油保保存的菌菌种中直接转转接用于于制备感感受态细细胞的菌菌液。细胞生长长密度以以刚进入入对数生长长期时为好，，可通过过监测培培养液的的OD600来来控制制。DH5αα菌株的的OD600为为0.5时,细胞密密度在5×107个/ml左右(不同的的菌株情情况有所所不同)，这时时比较合合适。密密度过高高或不足足均会影影响转化化效率。。2.质质粒的质质量和浓浓度:用于转化化的质粒粒DNA应主要要是超螺螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率率与外源源DNA的浓度度在一定定范围内内成正比比,但当当加入的的外源DNA的的量过多多或体积积过大时时,转化化效率就就会降低低。1ng的的cccDNA即可使使50μμl的的感受态态细胞达达到饱和和。一般般情况下下,DNA溶液液的体积积不应超超过感受受态细胞胞体积的的5％。3.试试剂的质质量:所用的试试剂,如如CaCl2等等均需需是最高高纯度的的(GR.或AR.)，并用用超纯水水配制，，最好分分装保存存于干燥燥的冷暗暗处。4.防防止杂菌菌和杂DNA的的污染：：整个操作作过程均均应在无菌条件件下进行行，所用器器皿，如如离心管管，tip头等等最好是是新的，，并经高高压灭菌菌处理，，所有有的的试试剂剂都都要要灭灭菌菌，且且注注意意防防止止被被其其它它试试剂剂、、DNA酶酶或或杂杂DNA所所污污染染，，否否则则均均会会影影响响转转化化效效率率或或杂杂DNA的的转转入入，，为为以以后后的的筛筛选选、、鉴鉴定定带带来来不不必必要要的的麻麻烦烦。。感受受态态细细胞胞的的制制备备1、、挑挑取取平平板板上上的的大大肠肠杆杆菌菌单单菌菌落落接接种种于于2mLLB液液体体培培养养基基中中，，37℃℃振振荡荡培培养养过过夜夜2、、按按1％％的的接接种种量量接接种种于于3mL新新鲜鲜LB培培养养液液，，37℃℃剧剧烈烈振振荡荡培培养养至至OD600为0.4-0.6(可可见见雾雾状状)3、、倒倒至至1.5mL的的eppendorf管管中中,4℃℃下下12,000rpm离离心心1min，，倒倒出出培培养养液液，，用用无无菌菌滤滤纸纸尽尽量量吸吸干干4、、加加入入1mL预预冷冷的的无无菌菌0.1mol··L-1CaCl2溶液液涡涡旋旋，，4℃℃下下12,000rpm离离心心30秒秒,尽尽量量去去除除上上清清5、、沉沉淀淀以以50-100μμL预预冷冷的的0.1mol··L-1CaCl2重悬悬，，4℃℃保保存存备备用用，，7d内内可可用用。。细胞胞的的转转化化2ul重重组组DNA50ul感感受受态态细细胞胞混混匀匀＋↓冰浴浴30min42℃℃热热激激90～～120S↓↓冰浴浴2min复苏苏：：加加入入450ul液液态态LB培培养养基基，，37℃℃轻轻缓缓振振荡荡培培养养（（150rpm）），，1.5～～2h↓→取30～～50ul，，涂涂布布在在含含相相应应抗抗生生素素的的培培养养基基上上，，平平板板培培养养挑取取单单菌菌落落，，于于含含相相应应抗抗生生素素的的液液态态培培养养基基培培养养后后，，取取一一定定量量提提取取质质粒粒，，进进行行鉴鉴定定（（酶酶切切、、杂杂交交、、测测序序等等））↑CaCl2的诱诱导导原原因因：：在0℃℃的的CaCl2低渗渗溶溶液液中中，，细细菌菌细细胞胞发发生生膨膨胀胀，，Ca2＋使细胞膜膜磷脂层层形成液液晶结构构，促使使细胞外外膜与内内膜间隙隙中部分分核酸酶酶解离，，诱导形形成感受受态Ca2＋能与加入入的DNA分子子结合，，形成抗抗脱氧核核糖核酸酸酶的羟羟基－磷磷酸钙复复合物，，黏附在在胞膜的的外表面面；42℃热热激处理理，细胞胞膜的液液晶结构构发生扰扰动，出出现间隙隙。提高转化化效率的的因素：：MgCl2与CaCl2共同处理理二甲基亚亚枫（DMSO）、、二硫苏苏糖醇（（DTT）提高100～1000倍，易易污染RbCl、MnCl2、LiCl和KCl等等与CaCl2多盐处理理对照处理理：DNA对对照处理理：无菌水代代替感受受态细胞胞，检验验DNA溶液感受态细细胞对照照处理：：NTE缓缓冲液代代替DNA溶液液，检验验感受态态细胞感受态细细胞有效效性对照照处理：：加入已知知的容易易转化的的质粒DNA原因：转转化化处理过过程中，，可能感感染杂菌菌，导致假阳阳性2、电穿穿孔转化化法（P140）基本原理理：利用高高压电脉脉冲作用用，在大大肠杆菌菌细胞膜膜上进行行电穿孔孔，形成成可逆的的瞬间通道道，促进外外源DNA的有有效吸收收。影响因素素：电场强度度，电脉脉冲时间间，外源源DNA浓度菌体制备备冷却，离离心，洗洗涤（降降低离子子强度））10％甘甘油重悬悬细胞，，-70℃贮贮存低温下（（0－4℃））进行电电穿孔转转化3、三亲亲本杂交交接合转转化大肠肠杆菌根据非接接合质粒粒的迁移作用用而建立，，目前常常用的载载体多是是在非接接合型质质粒或缺缺少了接接合转移移基因的的接合型型质粒的的基础上上而构建建的。待转化的的受体菌菌含有要转转化的重重组质粒粒的供体体菌含有广泛泛宿主的的辅助质质粒的辅辅助菌（（如：辅助菌株株E.coli(pRK2013)）4、转化化率：DNA分分子转化化受体菌菌获得转转化子的的效率以转化子子数与用用于转化化处理的的DNA分子数数或质量量的比率率表示以转化子子数与用用于转化化处理的的受体细细胞数的的比率表表示P150影响转化化率的因因素：重组DNA分子质量量较小，，亲和性性强，双双螺旋闭闭合结构构受体细胞胞受体细胞胞的选择择非常重重要转化手段段电穿孔法法>Ca诱导法法>三亲亲本杂交交法2.2重组λDNA分分子转导导大肠杆杆菌转染：将重组λDNA分子直接导入受体体细胞的的过程。。转导：通过λ噬噬菌体颗粒感染宿主主细胞的途途径把外外源DNA分子子转移到到受体细细胞内的的过程。。P142转化:1392.3重重组DNA分分子导入入植物细细胞(P144)（1）农农杆菌介介导的Ti质粒粒载体转转化法革兰氏阴阴性菌作用机制制：将待转移移的目的的基因组组入农杆杆菌中的的Ti质质粒载体体农杆菌识识别敏感感植物，，将Ti质粒的的T-DNA转转移到植植物细胞胞内部选择合适的外外植体根据受体细胞胞的转化能力力来决定农杆菌的接种种操作（接种到损伤伤切面，使农农杆菌与外植植体共培养）洗菌并筛选培培养（无菌水清洗洗共培养后的的外植体，无无菌滤纸吸干干后转移到筛筛选培养基上上，杀死或抑抑制附着于表表面的农杆菌菌）农杆菌介导外外源基因转化化植物的基本本程序：创伤植株感染染法（植株接种共转转化法）共培养感染法法叶盘转化法植物愈伤组织织共培养转化化法植物悬浮细胞胞共培养转化化法原生质体共培培养转化法常用方法：创伤植株感染染法

（植株接种共转转化法）在整体植株上上造成创伤农杆菌接种在在创伤表面或或针头注射农农杆菌农杆菌以天然然的感染过程程在植株体内内