基因结构与表达的基本策略

1基因结构与表达分析的基本策略StrategyforStructureandExpressionAnalysesofGenes分子生物学系22分子生物学的三大核心技术DNA序列分析—DNA测序，1977聚合酶链式反应—DNA扩增，1985DNA重组技术—基因克隆，19733一、DNA序列分析二、核酸分子杂交三、聚合酶链式反应四、基因芯片和微阵列五、Western免疫印迹主要内容4（一）双脱氧末端终止法

(Sanger,1977)一、DNA序列分析（二）DNA自动化序列分析（三）化学降解法(Gilbert,1977)5FrederickSanger1918～

WalterGilbert1932～

TheNobelPrizeinChemistry1980PaulBerg1926～6DNA测序技术基础：高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）技术，可分离差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段。

7(一）双脱氧末端终止法

（dideoxychaintermination）8ATP、dATP和ddATP的结构ATPAOHOHHHdATPddATPNTP:核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP的合称；dNTP:脱氧核苷三磷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP；ddNTP:ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP；9掺入N个核苷酸DNA合成反应模式图10DNA单链模板引物掺入ddNTP延伸的新合成链

末端终止111.双脱氧氧末端端终止止法原原理DNA合成反反应中中，ddNTP不存在在3′-OH末端，故不不能与与下一一个核核苷酸酸的5′-磷酸基基团形成3′，5′-磷酸二二酯键键，导导致DNA新链的的延伸伸提前前终止止于ddNTP。12ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPAGCT5′T4711GAATGA3′ACGCT132.DNA测序主要步步骤14A反应管G反应管G反应管T反应管C反应管T反应管1516GATC17●变性聚丙烯烯酰胺凝胶胶电泳●单链链DNA模板的制备备●DNA模板与测序序引物退火火●掺入入法标记反反应●延伸伸-终止反应●放射射自显影●阅读读测序结果果测序序步步骤骤18（二二））DNA测序序自自动动化化原原理理采用用4种不不同同的的荧荧光光分分别别标标记记4种ddNTP终止止反反应应产产物物，，替替代代放放射射性性同同位位素素标标记记是是实实现现DNA测序序自自动动化化的的基基础础。。19ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5′TGAATGA3′ACGCT2021表示示一一个个SNP位点点，，该该位位点点出出现现了了双双峰峰，，对对应应的的核核苷苷酸酸分分别别为为C和T,因此此该该位位点点为为CT杂合合型型，，如如果果该该位位点点只只有有一一个个峰峰C或者者T，则则该该位位点点基基因因型型为为CC或TT纯合合型型22DNA自动动测测序序步步骤骤4种不不同同荧荧光光染染料料标标记记终终止止物物ddNTPsSanger测序序反反应应反应应产产物物同一一泳道道电电泳泳分分离离激光激激发不不同大大小DNA片段上上的荧荧光分分子，，发射射出四四种不不同波波长的的荧光光荧光信信号采采集、、计算算机分分析与与DNA自动排排序23DyelabeleddideoxyterminatorsonABI3730capillaries24

与末端终止法不同，化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础上。

（三）化学降解法25

将待测DNA片段3′或5′端进行同位素标记，标记的DNA片段分成五个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种（类）碱基处断裂。电泳分离5组DNA混合物，放射自显影检测末端标记的DNA链的电泳区带位置。化学降解法原理26化学降降解G反应模模式图图硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet27最新测测序技技术454技术(Roche)焦磷酸酸测序序（Pyrosequencing）Solexa测序技技术(Illumina)SOLiD技术(ABI)连接法法测序序28举例：：Solexa测序HiSeq200029Solexa测序：：在一一个反反应中中同时时加入入4种核苷苷的标标签，，采用用边合合成边边测序序（SBS－sequencingbysynthesis）。完成人人类基基因组组草图图不同同测序序仪的的比较较图30二、核酸分分子杂杂交（NucleicAcidHybridization）（一））Southern印迹杂杂交：：检测测DNA(Southernblothybridization)SouthernEM,1975（二二））Northern印迹迹杂杂交交：：检检测测RNA(Northernblothybridization)StarkGR，197731核酸酸分分子子杂杂交交原原理理标记记的的单链链核核酸酸探探针针与待待检检测测的的靶靶单单链链DNA或RNA局部部互互补补结结合合形形成成杂杂交交双双链链。。应用用：：核酸酸靶靶DNA或RNA序列列的的定定性性与与定定量量分分析析。。323333印迹迹技技术术利用用各各种种物物理理方方法法使使电电泳泳胶胶中中的的生生物物大大分分子子转转移移到到NC等各种膜上上，使之成成为固相化化分子。这一技术类类似于用吸吸墨纸吸收收纸张上的的墨迹，因因此称之为为“blotting”,译为印迹技技术。3434探针技术用放射性核核素、生物物素或荧光光染料标记记其末端或或全链的已已知序列的的多聚核苷苷酸链被称称为“探针”。探针可以与与固定在NC膜上的核苷苷酸结合，，判断是否否有同源的的核酸分子子存在。35Southern印迹杂交原原理将电泳分离离的待测DNA片段结合到到一定的固固相支持物物上，然后后与存在于于液相中标标记的核酸酸探针进行行杂交的过过程。（一）Southern印迹杂交应用：DNA（基因组DNA）分子的定定性或定量分析。361.制备基因组组DNA2.用限制性内内切核酸酶酶消化基因因组DNA3.琼脂糖凝胶胶电泳分离离DNA酶切片段4.凝胶预处理理（如强碱，，DNA双链变为单单链）5.Southern印迹转移6.标记核酸探探针、探针针与DNA片段杂交7.杂交结果显显示Southern印迹杂交基基本过程37Southern印迹杂交示示意图38将电泳分离离的待测DNA片段结合到到一定的固固相支持物物上，然后后与存在于于液相中标标记的核酸酸探针进行行杂交的过过程。3940地中海贫血血的Southernblot基因诊断（1）仅一条染染色体上的的一个α基因缺失或或缺陷，则则α链的合成部部分受抑制制，称为α+地贫；（2）每条染色色体上的2个α基因均缺失失或缺陷，，称为α0地贫；(3)αα1、α2序列基本一一致；基因不同同程度的缺缺失可引起起不同类型型的地中海贫血血。α1α2αααα+α+α+ααα0α+α0α0α041BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe地中中海海贫贫血血的的直直接接基基因因诊诊断断42αα/αααααα/α-ααα/--αα-//--正常缺缺1缺2缺3缺414kb10kb43（二）Northern印迹杂交交(Northernblothyb指将RNA变性及电电泳分离离后，并并转移到到固相支支持物上上，用杂杂交反应应来鉴定定其中特特定mRNA分子的含含量及其其大小。。用于mRNA进行定性性和定量量分析。。44RNA琼脂糖凝凝胶电泳泳3kb0.4kbNt36382604623Northernblothybridization28S18S应用举例例45GAPDH0d2d4d6d8dNorthernblot杂交分析析mRNA的表达靶mRNA3-磷酸甘油油醛脱氢氢酶4646三、其他他杂交技技术1.斑点杂交交(dotblothybridization）将RNA或DNA变性后直直接点样样于硝酸酸纤维素素膜或尼尼龙膜上上，用于于基因组组中特定定基因及及其表达达的定性性及定量量研究。。47472.原位杂交交

（insituhybridization）用标记的的核酸探探针与组组织切片片或细胞胞中的待待测核酸酸互补序序列杂交交，可对对核酸进进行定性性、定位位和相对对定量分分析。483．核酸酶酶S1保护分析析法(nucleaseS1protectionassay）单链DNA探针与待测RNA形成DNA/RNA杂交双链链，加入入核酸酶酶S1专一性地地降解未未形成杂杂交体的的DNA或RNA单链，DNA/RNA杂交双链链则受到到保护而而不被降降解。494．RNA酶保护分分析法（RNaseprotectionassay，RPA）50RPA基本程序序：●待测RNA的分离●体外转录录标记RNA探针●待测RNA与探针RNA进行液相相杂交●RNA酶消化●不同大小小杂交片片段凝胶胶电泳分分离51三、聚合合酶链式式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)（一）PCR技术原理理（二）耐耐热DNA聚合酶（三）PCR引物及设设计原则则（四）PCR条件的优优化（五）PCR改进技术术（六）其其它PCR技术52聚合酶链链式反应应(PCR):（一）PCR技术原理理

Mullis

K.

1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。

TheNobelPrizeinChemistry199353ThereplicationofDNA54原理：PCR是模拟天天然DNA复制过程程，利用用DNA聚合酶催催化一对对引物间间特异DNA片段合成成的体外外扩增技技术。其其主要要热循环环过程为为：变性性、退火火、延伸伸三个步步骤。551.PCR循环由三步步组成：①变性（denaturation）②退火（annealing）③延伸（extension）高温合适温度合适温度5657582.PCR扩增终产物物大小:介于两条退退火引物5′末端之间的的双链DNA片段。循环一59循环二60循环三61一对引物：：正向和反反向

限制制了PCR扩增的片段段的范围5/——5/—3/3/—5/——5/—3/3/—625′CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGCAGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCGAGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCG3′GGTCCAGTACTACTACCCGTAGAACATGGTGCGCAGGTT3.引物设计实实例63Y=A（1+E）nY:扩增产物的的量A:最初靶DNA分子数E:PCR扩增效率n:循环次数3.PCR产量当E＝100％,A=1时Y=2n>>2n(引物延伸产产物的量））64（二）平台台期与平台台效应1.平台效应（plateaueffect）：PCR经过一定数数量的循环环后，DNA片段不再呈呈指数累积积，而是进进入线性增增长期或静静止期，即平台效应应。影响因素：：①引物物及dNTP底物浓度降降低。②酶与与模板比例例下降。65PCR平台效应66（二）耐热热DNA聚合酶TaqDNA聚合酶（实现了PCR自动化）从嗜热水生生菌thermusaquaticsYT-1株中直接分分离出来。。●95℃的半衰期:40min●最适温度:72℃～80℃●催化反应速率:150～300核苷酸/秒/酶分子6768TaqDNA聚合酶特性性：●5′→3′′聚合酶活性性；●5′→3′′外切酶活性性；●较弱弱的非模板板依赖性；；●缺乏乏3′→5′′外切酶活性性。69PCRthermalcycler70PCR产物的琼脂糖凝胶电电泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkerPCR产物71无机离子及及抑制剂的的影响TaqDNA聚合酶的活活性对Mg2+浓度和单价价离子（K+或NH4+）的性质和和浓度较敏敏感。最适Mg2+浓度：2mmol/LK+浓度：50mmol/L72几种高保保真的耐耐热DNA聚合酶1.TthDNA聚合酶2.VentDNA聚合酶3.PfuDNA聚合酶73（三）PCR引物设计计原则引物的化化学本质质是什么么？单链寡核核苷酸DNA或RNA片段。DNA复制引物物：单链链RNA片段PCR引物：单单链链DNA片段74PCR引物设计计原则：1.引物与模模板的序序列要完完全互补补2.引物与引引物之间间避免形形成稳定定的二聚聚体或发发夹结构构3.引物不能能在模板板的非目目的位点点引发DNA聚合反应应(错配)755′CACTGAACGTAGGCCT3′3′GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5′特异扩增增5′CACTGAACGTAGGCCT3′′3′GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5′′错误误引引发发1.引物物与与模模板板的的序序列列要要紧紧密密互互补补2.引物物不不能能在在模模板板的的非非目目的的位位点点引引发发DNA聚合合反反应应(错配配)76引物物之之间间应应避避免免3′′端互互补补3.引物物与与引引物物之之间间避避免免形形成成稳稳定定的的二二聚聚体体或或发发夹夹结结构构77引物物自自身身不不应应形形成成发发夹夹结结构构784.其它它原原则则:①引物物长长度度:10～30nt②碱基基分分布布:A、T、G、C随机机分分布布③G+C含量：40～60%Tm=4(G+C)+2(A+T)④引物3′末端碱基：最好选T、C、G，不选A避免出现3个以上的连连续碱基，，如GGG或CCC⑤引物5′末端碱碱基可可不与与模板板DNA互补791A260oligoDNA≈33μμgN:引物碱基数数X：合成成的oligoDNAA260单位Y：引物物的pmol数106Y（pmol）=X·33××───330.NX=───××105N2.引物用用量计计算80模板引物TaqDNA聚合酶酶dNTPMg2+退火变性延伸PCR反应81（四））PCR条件的的优化化1.TaqDNA聚合酶酶浓度度：1.0～2.5U/100μμl反应液液2.dNTP浓度：：20～200μμmol/L3.Mg2+浓度：：0.5～2.5mmol/L4.引物浓浓度：：0.1～0.5μμmol/L82（五））PCR改进技技术1.RT-PCR(reversetranscriptionPCR)以mRNA为模板板逆转转录合合成cDNA，再以以此cDNA为模板板进行行PCR反应。83RT-PCR原理84逆转录录酶①AMV（avianmyeloblastosisvirus）酶活性性最适适温度度42℃℃②MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）：最最适温温度37℃℃852.定量RT-PCR（QRT-PCR）半定定量量RT-PCR以样样本本mRNA为模模板板逆逆转转录录合合成成cDNA，在在不不同同引引物物对对引引导导下下共共同同PCR扩增增“看看家家””基基因因和目的的基基因因cDNA。86①选择择内内对对照照基基因因组织织中中普普遍遍表表达达、、表表达达量量比比较较恒恒定定的的““看看家家””基基因因mRNA。如如GAPDH和β-actinmRNA等。。②半定定量量标标准准计算算PCR产物物：：靶cDNA/GAPDHcDNA87③KPNA2在在正正常常生生理理状状态态东东方方田田鼠鼠和和小小鼠鼠体体内内表表达达分分析析88893.实时时荧荧光光定定量量RT-PCRReal-timefluorescentquaPCR扩增指指数期期内极极小的的扩增增效率率改变变会极极大地地影响响产量量。应用：：用于基因因DNA拷贝数数和mRNA表达定定量分分析。。90①荧光染染料9192每形成成一个个DNA双链，，就有有一定定数量量的染染料结结合上上去，，染料料一结结合就就产生生荧光光信号号，信号强强度与与DNA分子总总数目目成正正比。93②TaqManProbe一种水水解式式荧光光标记记探针针。寡寡核苷苷酸探探针的5′端标记记一个个荧光光报告告基团团（reporter），3′端标记记一个个荧光淬灭基团（quencher）。94每产生生一条条DNA链，就就切断断一条条探针针，每每切断断一条95。③分子信标探探针（MolecularBeaconProbe）该探针具有有发夹结构构，5′端标记荧光光报告基团团，3′端标记淬灭灭基团。96探针与靶序序列杂交结结合，报告告荧光染料料与淬灭染染料分离，，发出荧光光。97④实时荧光光定量PCR计算原理PCR扩增效率的的差异使相相同的样品品最终产量量有很大差差异9899CT或Tc或Ct值：临界点循环环（Thresholdcycle），即从基基线到指数数增长的拐拐点所对应应的循环数数100101●传染病诊断断、监测与与疗效预后后评估：●揭示疾病发发病机制102⑤荧光定量PCR仪带有激发光光源和荧光光信号检测测系统的PCR仪，配有电电脑系统及及分析软件件。103（六）其它它PCR技术1.反向PCR（inversePCR）原理1042.Alu-PCR1053.原位PCR(in-situPCR)4.巢式PCR（nestedPCR）5.不对称PCR（asymmetricPCR）106DNAChipandMicroarray四、基因芯片和和微阵列●基因芯片上上的阵列是是由有规则则排列的cDNA或寡核苷酸酸等样本所所组成的。。107宏阵列(Macroarray)高密度微阵列(Microarray)举例：HPV诊断芯片108DNA微阵列：●寡核苷苷酸微阵列列（oligomicroarray）●cDNA微阵列（cDNAmicroarray）在一微小的的基片（硅硅片等）表表面集成了了大量分子子识别探针针，能够平平行分析大大量基因转转录表达，，因此又被被称为cDNA芯片。109DNA芯片（cDNA芯片）主要技术流程：样品荧光标记及芯片制备杂交反应及过程控制杂交信号检测信号分析与解读110CBACy5-标记cDNACy3-标记cDNACBACBACBACBACBACBA样品1样品2Cy5/Cy3荧光标记RNA提取竞争性杂交交显示基因表达量量差异二种样品竞争性杂交示意图基因表达谱芯片的原理111DNA芯片技术的的主要应用用基因组分析析及发现新新的基因基因表达的的研究DNA序列分析基因诊断和和基因药物物设计112五、Western免疫印迹Westernblotting原理与核酸酸分子杂交交相似，只只是以偶联联标记物的的抗体分子作为探探针，检测测转移到固固相支持物物上的蛋白质分子。113Western免疫印迹信信号检测原原理114蛋白质样品品制备SDS分离蛋白质转膜膜Westernblot程序115抗体与抗原原杂交信号检测分分析116谢谢大家！！9、静夜四无邻邻，荒居旧业业贫。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黄叶树树，灯下白头头人。。06:10:1606:10:1606:1012/23/20226:10:16AM11、以我我独沈沈久，，愧君君相见见频。。。12月月-2206:10:1606:10Dec-2223-Dec-2212、故人江海别别，几度隔山山川。。06:10:1606:10:1606:10Friday,December23,202213、乍见翻疑梦梦，相悲各问问年。。12月-2212月-2206:10:1606:10:16December23,202214、他乡生白白发，旧国国见青山。。。23十二二月20226:10:17上上午06:10:1712月-2215、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。十二月226:10上上午12月-2206:10December23,202216、行动出出成果，，工作出出财富。。。2022/12/236:10:1706:10:1723December202217、做前，，能够环环视四周周；做时时，你只只能或者者最好沿沿着以脚脚为起点点的射线线向前。。。6:10:17上午午6:10上午午06:10:1712月-229、没有失败，，只有暂时停停止成功！。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、很多事情努努力了未必有有结果，但是是不努力却什什么改变也没没有。。06:10:1706:10:1706:1012/23/20226:10:17AM11、成功就是日日复一日那一一点点小小努努力的积累。。。12月-2206:10:1706:10Dec-2223-Dec-2212、世间成事，，不求其绝对对圆满，留一一份不足，可可得无限完美美。。06:10:1706:10:1706:10Friday