分子生物学实验

实验一.质粒提取与琼脂糖电泳目的掌握质粒的提取方法及原理；琼脂糖凝胶电泳及观察评判方法。原理质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。在pH12.0-12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。硅基质树脂在高盐状态下，特异性吸附DNA，而在低盐状态下，DNA被洗脱下来。带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。三、实验材料、仪器、试剂（1）菌种：大肠杆菌DH5α（2）分子生物学试剂10mg/ml溴化乙锭（EB）:按10mg/ml浓度将EB溶于去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。50×TAE电泳缓冲液:24.2gTris5.71g冰乙酸10ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝40%（W/V）蔗糖水溶液1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE电泳缓冲液中，溶化后加入5μl10mg/mlEB贮存液，使凝胶中EB终浓度达到0.5mg/ml。(4)细菌培养基含抗生素的LB培养液酵母提取物5g蛋白胨10gNaCl10g琼脂15～20g水1000mL，必要时，调整至pH7.4～7.6将上述培养基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。灭菌后的LB培养基可室温保存，使用前加入相应抗生素。含抗生素的LB培养基应放入4OC冰箱内暂存。含抗生素的LB琼脂平板LB培养基中加15g琼脂，以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。待培养基温度降至40-42OC，加入相应抗生素，摇动培养基，使抗生素与培养基充分混匀。将培养基倒入细菌培养皿，凝固后倒置。6小时后放入4OC冰箱备用。（5）PromegaEastepTM质粒小提试剂盒（6）其它准备物品 1mL、100μL、10μL加样器及其枪头、盒子；灭菌的1.5mLeppendorf管；试管及试管塞：小型离心机；无水乙醇。四、实验步骤（一）大肠杆菌的制备从新鲜LB琼脂平板（含抗生素）上挑出单个菌落接种于5mlLB培养液中（含相同的抗生素），于37°C摇床培养过夜（12-16小时）。（二）大肠杆菌的裂解1.将1-5ml(高拷贝数的质粒)或10ml（低拷贝数的质粒）的细菌培养物于10,000×g离心5分钟。弃去上清液，并吸去剩余培养液。2.加入250μl细胞悬浮液，震荡或吹打以充分混匀细胞。充分混匀细胞非常关键。如果悬浮的细胞不在离心管中，则将其转移至1.5ml无菌离心管中。注意：以下操作步骤不要震荡以避免切断染色体DNA。3.加入250μl细胞裂解液，颠倒离心管4次以充分混匀（不要震荡）。室温孵育细胞悬浮液至澄清，孵育时间大约需要1-5分钟。注意：在加入碱性蛋白酶溶液（第4步）之前观察裂解液是否变为澄清非常重要。但孵育时间不要超过5分钟。4.加入10μl碱性蛋白酶溶液并颠倒离心管4次以充分混匀。于室温孵育5分钟。碱性蛋白酶能够灭活核酸酶及其它在细菌裂解过程中释放出的能够影响分离质粒质量的蛋白。碱性蛋白酶孵育时间不要超过5分钟，否则质粒DNA会出现缺口。5.加入350μl中和溶液并迅速颠倒离心管4次以充分混匀（不要震荡）。6.于室温将细胞裂解液以最大速度（约14,000×g）离心10分钟。取澄清裂解液进行以下步骤的质粒DNA的分离及纯化。(三)质粒DNA的纯化7．准备好微量纯化柱和收集管。一个样品需要一个微量纯化柱和一个收集管，将微量纯化柱插入收集管中。8．用移液枪将澄清裂解液（大约850μl）转移到准备好的微量纯化柱中，避免碰到沉淀物。注意：如果转移过程中不小心带入了白色沉淀物，需将微量纯化柱中的内含物重新转移到一个无菌1.5ml离心管中并以最大速度离心5-10分钟。再将离心后的上清液转移至先前使用的微量纯化柱中。微量纯化柱可以重复使用，但仅限于同一样品。9．于室温，14000×g离心1分钟，将微量纯化柱从收集管上移开，弃去收集管中的液体后重新装回到收集管上。10．加入750μl柱清洗液（已加95%乙醇）。11．于室温，14000×g离心1分钟，清空收集管。12．加入250μl柱清洗液重复清洗步聚（已加95%乙醇）。13．于室温，14000×g离心2分钟。14．从收集管上取下微量纯化柱并转移至无菌1.5ml离心管中。操作时需小心，在转移微量纯化柱到离心管中时切勿带入清洗液。如果微量纯化柱上粘有柱清洗液，则需要重新以最大速度离心1分钟，以甩掉柱清洗液后再转移到离心管中。15．加入100μl无核酸酶水，于室温，14000×g离心1分钟。不加缓冲液的DNA水溶液可保存在—20°C或更低的温度下。如果需要将DNA保存于TE缓冲液中，则在100μlDNA中加入11μl10×TE缓冲液，加了TE缓冲液中的DNA保存在4°C是稳定的。（四）琼脂糖凝胶电泳1．将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；2．调整好梳子的高度；3．称取0.24g琼脂糖于30ml1×TAE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50oC时加入核酸染料，倒入制胶板中；4．凝胶凝固后，小心拔去梳子；5．将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，6．将电泳样品与6Xloadingbuffer混合后将样品依次加入加样孔中；打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；7．电泳完成后切断电源，取出凝胶，置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。五、结果分析电泳检测可看到几条带?提取EGFP质粒的纯度分析。六、思考与分析1．提取质粒分子量如何确定?能通过与核酸分子量Marker比较确定质粒分子量吗?为什么?2．质粒提取过程中各试剂的主要作用。感受态细胞的制备和转化一．目的掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞的方法掌握质粒转化的技术方法二．原理体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道，促进细胞吸收DNA复合物。在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。三、实验材料、仪器、试剂（1）菌种：DH5a（2）分子生物学试剂0.1MCaCl250%甘油(3)细菌培养基含抗生素的LB培养液酵母提取物5g蛋白胨10gNaCl10g水1000mLpH7.4～7.6（4）其它准备物品 1mL、100μL、10μL加样器及其枪头、盒子；灭菌的1.5mLeppendorf管；试管及试管塞：小型离心机；摇床；细菌培养箱。四、实验步骤（一）大肠杆菌DH5a感受态的制备前夜接种受体菌（DH5a），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；取1ml过夜培养物转接于100mlLB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm），摇至细菌OD为0.4-0.6；将0.1MCaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作吸取培养好的菌液至50ml离心管中，在冰上冷却30分钟；4℃下3000g冷冻离心10分钟；弃去上清，加入10ml预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；4℃下3000g冷冻离心10分钟；弃去上清，加入1ml预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加0.5ml50%甘油超低温冷冻贮存备用（－70℃）（二）质粒的转化制备选择性培养基平板：在融化的250mlLB固体培养基中加入适量抗生素，混匀后倒入灭菌培养皿中；制备好的感受态细胞，放在冰上融化；每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，以商品化感受态细胞为阳性对照，感受态中不加质粒DNA为阴性对照；DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置3分钟；复苏：每管加400mlLB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；布皿：取适当体积均匀涂布于含有抗生素的LB平板；培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到白色菌落。五、结果分析菌落计数；观察菌落大小，均一性。六、思考与分析1．影响感受态效率的因素是什么？2．质粒转化后，37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏的目的是什么？多聚酶链式反应（PCR）一．目的掌握PCR扩增原理及方法；巩固琼脂糖凝胶电泳及观察评判方法。二．原理 PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸３个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA®单链DNA，94℃。退火：引物＋单链DNA®杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70℃左右，TaqDNA聚合酶以４种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物３’末端为起点的5三、实验材料、仪器、试剂（1）基因：HIV-1P24（2）分子生物学试剂酶类：TaqDNA聚合酶，25mmol/LMgCl2，10×PCRBuffer，dNTPs。核酸Marker：DL2000DNAMarker（3）所用溶液的配制50×TAE电泳缓冲液:24.2gTris5.71g冰乙酸10ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝40%（W/V）蔗糖水溶液1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE电泳缓冲液中，溶化后加入5μl10mg/mlEB贮存液，使凝胶中EB终浓度达到0.5mg/ml。（4）PCR特异性引物上游引物：CA-NdeI-F: GCCGCATATGCCGATCGTGCAGAACCTCCAGGGG下游引物：CA-BamHI-R: GCGCGGATCCTTACAAAACTCTTGCTTTATGGCCGGG（5）其它准备物品 1mL、100μL、10μL移液器器及其枪头、盒子；灭菌的1.5mLeppendorf管；PCR管。四、实验步骤DNA的PCR扩增：在一个50l反应体系中依次加入如下组分：H2O37.5l10×PCRbuffer5上游引物PW1（25pmol/L）1下游引物PW2（25pmol/L）1dNTPs（2.5mmol/L）4lDNA模板1lTaqDNA聚合酶（5U/l）0.5所有组分充分混匀后瞬时离心，确保反应混合物位于PCR管底部。在PCR仪上进行PCR扩增。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；最后72五、结果分析PCR产物大小，效率，是否有非特异性反应。六、思考与分析1．哪些因素影响PCR扩增效率？2．最后72℃目的基因克隆及鉴定一．目的学习目的基因克隆方法；学习阳性克隆筛选方法二．原理 选择克隆载体多克隆位点上相应的限制性内切酶，识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高。三、实验材料、仪器、试剂（1）基因：HIV-1P24PCR产物，载体：pET-11a（2）分子生物学试剂酶类：限制性内切酶及缓冲液（Buffer）：NdeI,BamHIDNA连接酶(T4DNAligase)核酸Marker：DL2000DNAMarker（3）所用溶液的配制50×TAE电泳缓冲液:24.2gTris5.71g冰乙酸10ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝40%（W/V）蔗糖水溶液1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE电泳缓冲液中，溶化后加入5μl10mg/mlEB贮存液，使凝胶中EB终浓度达到0.5mg/ml。（4）凝胶回收试剂盒（5）其它准备物品 1mL、200μL、50μL、10μL加样器及其枪头、盒子；灭菌的1.5mLeppendorf管；PCR管；刀片；金属浴，离心机。四、实验步骤1．PCR产物回收琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物在蓝光透射仪下将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入干净的离心管（自备）中，称取重量。注意：若胶块的体积过大，可将胶块切成碎块；后续步骤按照说明书（如下）进行2．限制性内切酶消化回收所得PCR产物和载体（酶切）（1）适应温度：37℃50ul体系：Ncol：2ulBamHI：2ul10xBuffer4：5ulDNA片段：41ul放入37℃金属浴酶切2.5小时。（2）所得酶切产物按上述纯化方法再次纯化回收。3．将DNA片段与载体连接：(1)20ul体系：10xBuffer：2ulQuick连接酶：1ul载体：2ulDNA片段：14ul插入片段与载体DNA摩尔比1:3-1:6,25℃静置10分钟。4．连接产物转化Ecoil.TransSetta(DE3)感受态细胞，载体DNA酶切片段作为阴性对照，载体DNA为阳性对照。5．阳性克隆的鉴定：配置PCR反应体系，并分装入7个PCR管，确保每管中反应体系为：H2O18.