基因工程与药物课件

基技学院严永敏

基因重组与基因工程基技学院严永敏基因重组与基因工程1概念基因重组（geneticrecombination）：指不同来源的DNA分子通过重新组合（插入、缺失、置换等）形成新的重组DNA分子的过程。概念基因重组（geneticrecombination2自然界的基因重组一、转化作用概念：受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞局部遗传性状的现象。DNADNA片段新DNA重组摄取溶解自然界的基因重组一、转化作用DNADNA片段新DNA重组摄取3转导作用概念：以病毒为媒介发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。转导作用4转位：概念：基因从基因组的一个位置转移到另一个位置。转位：5基因工程与药物课件6基因工程与药物课件7第一节概述第二节基因工程相关的酶学第三节基因工程的载体〔vector〕第四节目的基因制备和常用别离方法第五节载体DNA和目的基因的连接第六节重组DNA分子引入受体细胞第七节重组体的鉴定与分析第八节克隆基因的表达第一节概述8基因工程（geneticengineering）：

在体外应用人工方法进行基因重组，然后导入宿主细胞去复制、扩增或表达的过程。因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程。

分子克隆（molecularcloning）:

指按照人的意愿，在体外将制备的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝或表达产物。

基因工程（geneticengineering）：分9分切连转

筛基因工程步骤分切连转10基因工程基因工程11基因工程技术的应用(P307)一、生产〔基因工程〕产品：1.构建基因组文库，cDNA文库，核酸探针等2.生产基因的(用于医药目的)的一级产品，即蛋白质、多肽；二级产品，如维生素、多糖、氨基酸(因为它们由酶催化产生〕3.生产基因疫苗、如:乙肝疫苗.二、改进生物的性状如将固氮基因引入水稻,就可以不用施氮肥了基因治疗三、分子诊断基因工程技术的应用(P307)一、生产〔基因工程〕产品：12

在分子克隆技术中，对DNA进行切割、合成、补平、连接和修饰等工具酶是必不可少的。常用的工具酶主要有：

限制性核酸内切酶、DNA聚合酶Ⅰ、逆转录酶、DNA连接酶、碱性磷酸酶、多核苷酸激酶和末端脱氧核苷酸转移酶，甲基化酶等。重要的工具酶（toolenzyme)

在分子克隆技术中，对DNA进行切割、合成、补平、13一、限制性核酸内切酶

（restrictionendonuclease，RE）

简称限制酶，是一类能识别和切割特定DNA序列的核酸内切酶，为原核生物所特有。分为三型。其中Ⅱ型被称为基因工程的分子剪刀，是分子克隆技术中最重要的工具酶。一、限制性核酸内切酶

（restrictionendonu14作用ⅠⅡⅢ

三种限制性核酸内切酶的作用(P309)

酶活性

核酸内切酶

核酸内切酶

核酸内切酶

甲基化酶甲基化酶

ATP酶

DNA解旋酶DNA链上的无

有

有特异识别位点DNA链上的无

在识别序列内

在识别序列外特异切割位点在分子克隆中无

有

无的重要意义作用ⅠⅡ15〔一〕限制酶的命名与分类EcoR

I产生该酶的宿主菌属名微生物的种名

宿主菌的株或型同一菌株中不同限制酶的编号（按发现先后顺序）

大肠杆菌Escherichia属、coli种、RY13株中分离到几种限制酶，分别表示为:

EcoR

I

、EcoR

Ⅱ、EcoR

Ⅴ等。〔一〕限制酶的命名与分类EcoRI产生该酶的微生物的种名16（二）Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用

根据需要在特定的位点上精确切割双链DNA分子，产生特异末端的DNA片段。识别序列：双链DNA特异的碱基对（一般46个），在识别序列内特异切割DNA。断裂磷酸二酯键（二）Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用根据需要在特定的位点17

Ⅱ型限制酶的特异识别序列回文结构（palindromestructure）：

指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列。5——GAATTC——3ATATGC5’3’EcoRⅠ识别序列：对称轴3——CTTAAG——5Ⅱ型限制酶的特异识别序列5——GAATTC——3ATA18粘性末端（cohesiveend）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的带单链突出的末端。—GAATTC——CTTAAG—平末端（bluntend）：

指限制酶在对称轴上同时切割互补DNA双链所产生的末端。EcoRⅠ—CCCGGG——GGGCCC—SmaⅠ粘性末端（cohesiveend）：—GAATTC—平末端194420基因工程与药物课件21基因工程与药物课件22同裂酶（isoschizomers）:来源不同，但能识别和切割同一核苷酸序列的限制酶，也称异源同工酶。

这些同工异源酶可以互相代用。如：BamHⅠ和BstⅠ（GGATCC）；

XhoⅠ和

PaeR7（CTCGAG）。同裂酶（isoschizomers）:这些同工异源酶可以互相23

如：BamHⅠ（G

GATCC）和Sau3AⅠ（N

GATCN）。

同尾酶（isocaudamers）:

来源，识别序列，且切割方式均不同，但可产生相同粘性末端的限制酶。

产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在DNA重组时具有更大的灵活性。如：BamHⅠ（GGATCC）24“分子剪刀〞的应用根据特异识别序列切割DNA片段用于基因组方案研究〔如物理图谱)，基因组文库，DNA序列分析,DNA分子杂交，制备探针〕限制性片段长度多态性〔restrictionfragmentlengthpolymorphysm，RFLP〕研究，用于法医学个体识别和遗传性疾病的诊断等－DNA指纹分析“分子剪刀〞的应用根据特异识别序列切割DNA片段25人类两个个体的基因组DNA中平均有1000万处不同，多位于非编码序列中。碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现，当使用同一限制酶切割不同个体基因组DNA时，DNA片段长度出现差异，这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为RFLP。

限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)人类两个个体的基因组DNA中平均有1000万处不同，26GAATTC

CTTAAGGATTTC

CTAAAG1212III2kb3kb5kb7kb个体识别

RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。

GAATTC

CTTAAGGATTTC

CTAAAG127RFLP在遗传病检测中的应用镰状细胞贫血症（globin，6），其GAGGTG的突变（MstII，CCTNAGG）RFLP在遗传病检测中的应用镰状细胞贫血症（glo28一、限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease，简称限制酶），分为三型。其中Ⅱ型被称为基因工程的分子手术刀，是分子克隆技术中最重要的工具酶。甲基化限制酶一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（res29作用ⅠⅡⅢ三种限制性核酸内切酶的作用

酶活性

核酸内切酶

核酸内切酶

核酸内切酶

甲基化酶甲基化酶ATP酶DNA解旋酶DNA链上的无

有

有特异识别位点DNA链上的无

在识别序列内

在识别序列外特异切割位点在分子克隆中无

有

无的重要意义作用Ⅰ30（二）Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用限制酶功能：根据需要在特定的位点上

精确切割双链DNA分子。Ⅱ型限制酶能识别双链DNA特异的46个碱基对，并在此序列内特异切割DNA。（二）Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用限制酶功能：根据需要在特定的31回文结构（palindromestructure）：

指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限制酶所识别）。5——GAATTC——3ATATGC5’3’EcoRⅠ识别序列：对称轴3——CTTAAG——5回文结构（palindromestructure）：5—32粘性末端（stickyend）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。—GAATTC——CTTAAG—平末端（bluntend）：

指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。EcoRⅠ—CCCGGG——GGGCCC—SmaⅠ粘性末端（stickyend）：—GAATTC—平末端（b33图4-1回文结构和限制性核酸内切酶作用模式图图4-1回文结构和限制性核酸内切酶作用模式图34二、DNA连接酶

基因工程的缝纫针主要功能:催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5磷酸基团与3羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来，实现DNA体外重组。包括大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶。二、DNA连接酶基因工程的缝纫针35图4-4DNA连接酶作用模式图

大肠杆菌DNA连接酶只能连接粘性末端，而T4DNA连接酶既能连接粘性末端，又能连接平末端。图4-4DNA连接酶作用模式图大肠杆菌D36三、DNA聚合酶（一）DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ）是单一多肽链的多功能酶，分子量为109kD，它具有3种酶活性：①5→3

DNA聚合酶活性。②3→5核酸外切酶活性。③5→3核酸外切酶活性。三、DNA聚合酶（一）DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段37Klenow片段的主要用途：

①补齐双链DNA的3末端，同时可使3末端DNA标记同位素。②cDNA克隆中，合成cDNA第二链。图4-2DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段5→3外切酶5→3聚合酶3→5外切酶DNA聚合酶Ⅰ(103kD)Klenow片段NC

5→3聚合酶3→5外切酶(68kD)35kD(小)68kD(大)CN枯草杆菌蛋白酶Klenow片段的主要用途：图4-2DNA聚合酶Ⅰ和38（二）TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶（简称Taq酶）是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度是70~80℃，Taq酶具有5→3聚合酶活性和依赖于聚合作用的5→3外切酶活性。TaqDNA聚合酶可用于DNA测序及通过聚合酶链反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增。

（二）TaqDNA聚合酶39①RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）。②核糖核酸酶H活性（RNaseH）。③DNA聚合酶活性（DDDP）。逆转录酶的作用：（三）逆转录酶

逆转录酶（reversetranscriptase）是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。逆转录酶是多功能酶。

①RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）。②核糖405335RNA(用表示)RNA-DNA杂化分子35

RNase（核酸酶H活性)

DDDP（DNA聚合酶活性）

4种dNTPRDDP（逆转录酶）引物、4种dNTP病毒双链DNA用表示）（cDNA第二链(complementaryDNA，cDNA)与病毒RNA互补的DNA(用表示)5335

535

3图4-3逆转录酶的作用5335RNARNA-DNA杂化分41

末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT，简称末端转移酶）分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3末端-OH上。四、末端脱氧核苷酸转移酶末端转移酶的功能主要有：①在载体或目的基因3末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。②用于DNA3末端的同位素探针标记。末端脱氧核苷酸转移酶（terminal42(A、G、C、T)nOH5′3′5′3′OH5′3′5′3′(A、G、C、T)nMg2+dNTPnppiMg2+dNTPnppi5′3′OH5′3′OH

5′3′5′3′(A、G、C、T)nCo2+dNTPnppiCo2+dNTPnppi（1）底物是单链DNA或有3突出末端的双链DNA，需要Mg2+。（2）底物是平端或3凹端的双链DNA，需要Co2+。(A、G、C、T)n(A、G、C、T)nOH5′3′5′43五、碱性磷酸酶

碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基团。主要用途有：除去DNA片段上的5磷酸以防自身连接。

5-pCpGpC┅┅-OH3

碱性磷酸酶5-CpGpC┅┅-OH35-p3-HO5-HO3-HO五、碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkalin44第二节载体

指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。制备的目的基因或外源性DNA片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。载体包括克隆载体和表达载体。载体（vector）:第二节载体指能携带外源DNA片段导入宿主细45①能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般<10Kb。②带有遗传筛选标记。③有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。

载体上具有多个限制酶的单一切点（即在载体的其它部位无这些酶的相同切点）称为多克隆位点（multiplecloningsites，MCS）。载体应具备的特征：①能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般<10Kb。46多克隆位点复制起始点抗药基因抗药基因多克隆位点复制起始点抗药基因抗药基因47质粒(plasmid)载体

噬菌体(phage)载体

真核病毒(virus〕载体

按来源分：PBR322；pUC系列；pGEM系列；M13mp系列；噬菌体载体；柯斯质粒（粘粒）；SV40载体；逆转录病毒载体；腺病毒载体；质粒(plasmid)载体

噬菌48

克隆载体(cloningvector)：

用于克隆和扩增某一DNA序列，为研究提供材料或建立基因库。表达载体(expressionvector)：附加表达构件——参与转录和翻译所必需的调控序列，用于表达相关的蛋白质产品。穿梭载体(shuttervector)：既能在原核细胞中复制，又能在真核细胞中复制表达的载体。按功能分：克隆载体(cloning49一、克隆载体（一）质粒载体

质粒（plasmid）是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。

分为“紧密型”和“松弛型”一、克隆载体（一）质粒载体50质粒与宿主细胞的关系（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主细胞中（2）质粒离开宿主就无法生存，必须依赖宿主细胞的（３）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关的，如抗生素抗性基因：Ampr酶，水解β-内酰胺环,解除氨苄毒性,使细菌抗氨苄。Tetr膜蛋白,可阻止四环素进入细胞,使细菌抗四环素。质粒与宿主细胞的关系51①

用于保存和扩增<2Kb目的DNA。②

构建cDNA文库。③目的DNA的测序。④作为核酸杂交时的探针来源。质粒克隆载体的主要用途：Super-coiledformRelaxedcircleLinearized

form①用于保存和扩增<2Kb目的DNA。质粒克隆载体的主要52质粒的理化性质具有核酸分子的一般理化特性：可嵌入某些染料〔溴化乙锭〕具有较强的抗切割和抗变性的能力质粒的理化性质53质粒DNA琼脂糖凝胶电泳转GFP质粒DNA转染细胞质粒DNA琼脂糖凝胶电泳转GFP质粒DNA转染细胞54复制起始点抗药基因抗药基因图4-5pBR322质粒的物理图谱1.pBR322质粒载体复制起始点抗药基因抗药基因图4-5pBR322质粒的物理55图4-6pUC质粒物理图谱

2.pUC18、pUC19质粒载体图4-6pUC质粒物理图谱2.pUC18、pUC19质56pUC18和pUC19质粒长约2.69Kb，除多克隆位点互为相反方向排列外，其它序列均相同。pUC质粒含Ampr，可供菌落筛选。半乳糖苷酶的蓝白斑筛选实验：lacZ基因-半乳糖苷酶氨基端+缺陷型-半乳糖苷酶IPTG-半乳糖苷酶-互补蓝色菌落X-galpUC18和pUC19质粒长约2.69Kb，除多57（二）噬菌体载体噬菌体（bacteriophage，phage）：

指感染细菌的病毒。（三）动物细胞基因克隆的载体已构建并经常使用的动物病毒克隆载体有：猿猴空泡病毒40（simianvacuolatingvirus40，SV40）载体、腺病毒（adenovirus）载体和逆转录病毒（retrovirus）载体等，它们都有各自的特点和应用范围。（二）噬菌体载体噬菌体（bacteriophage，phag58原核细胞的表达载体主要是大肠杆菌表达载体。大肠杆菌表达载体是在克隆载体的基础上导入表达系统调控元件：启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号。（一）原核细胞表达载体二、表达载体原核细胞的表达载体主要是大肠杆菌表达载体。大595—TTGACA——TATAAT———//——3-35区-10区转录起始点PribnowboxDNA

如乳糖启动子（Lac）、色氨酸启动子（Trp）、Tac启动子（Trp-Lac）以及PL和PR启动子等。原核细胞启动子示意图1.启动子（promoter）：5—TTGACA——TATAAT———//——3-35区60mRNA核蛋白体小亚基上的16SrRNA2.SD序列SD-序列示意图mRNA核蛋白体小亚基上的16SrRNA2.SD序列SD61

一个基因的3末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功能，此序列称为终止子。该序列含有一段富含A/T和富含G/C的回文对称结构，终止子转录后形成的RNA具有茎环状局部二级结构。3.终止子：一个基因的3末端有一特定的DNA序列，它62-NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCTTTTTTNNN-DNA-NNTTCGCGGCNNNNGGCCGCGAAAAAANNN-G/C富含区2G/C富含区1A/T富含区5353RNA-NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH53RNA结构5GC

NNNNCCGCGCGGCGCAUAU—NNNNUUUU-OH

3DNA转录的强终止子模式图转录-NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCTTTTT63图4-8pKK223-3质粒载体的物理图谱

图4-8pKK223-3质粒载体的物理图谱64（二）哺乳动物细胞表达载体真核表达载体的真核表达元件有：启动子/增强子—克隆位点—终止位点和加polyA信号。1．原核DNA序列包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子和抗药基因的筛选标记。2．启动子转录起始位点上游25~30bp有富含AT的TATA框，TATA框的上游约100~200bp处为上游启动子元件。3．增强子（enhancer）是一类显著提高基因转录效率的顺式作用元件。4．终止子和加polyA信号。

（二）哺乳动物细胞表达载体真核表达载体的真核表达元件有65第三节分子克隆的基本步骤一、目的基因的获取二、载体的选择三、目的基因和载体酶切与连接四、重组DNA导入受体细胞五、重组体的筛选和鉴定第三节分子克隆的基本步骤一、目的基因的获取66连接含重组子的阳性克隆载体+目的基因转化、筛选和鉴定阳性克隆DNA重组体+受体细胞分切连转筛基因工程步骤连接含重组子的阳性克隆载体+目的基因转化、筛选和鉴定阳性克隆67分--分离目的基因DNA和载体DNA从组织或器官中提取并分离出某基因DNA或cDNA目的基因DNA质粒染色体基因克隆用细菌提取载体质粒DNA质粒DNA质粒是细菌染色体外双链环状DNA，是基因工程最常用的载体之一。目的基因可以来源于动植物的组织、培养的细胞或者PCR产物分--分离目的基因DNA和载体DNA从组织或器官中提取并分离68切--对目的基因DNA和载体DNA进行酶切修饰目的DNA限制性核酸内切酶质粒DNA基因克隆的载体粘性末端平末端DNA经过酶切后产生两种形式的末端酶切后的质粒示意图切--对目的基因DNA和载体DNA进行酶切修饰目的DNA限制69酶切后的质粒DNA简单表示为重组质粒同种限制酶切除目的基因和载体，产生相互对应的粘性末端，退火后以连接酶共价互补连接。连--目的基因连接到载体上，DNA连接酶连接切口。酶切后的质粒DNA简单表示为重组质粒同种限制酶切除目的基因和70转--即转化。以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入受体细胞的过程称为转化(transformation）。重组质粒细菌(CaCl2处理）细菌(CaCl2处理）质粒导入未成功质粒导入成功质粒导入不成功细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞称谓感受态细胞(competentcell)。转--即转化。以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入受体细71筛--即筛选。筛选含有质粒的细菌和含有正确重组DNA的细菌克隆含重组质粒的细菌不含质粒的细菌含有抗生素的培养基由于质粒本身能够编码产生分解抗生素的酶，因此，凡是转化成功的细菌就能够在含有抗生素的培养基中生长。含质粒的细菌（自身环化）含有质粒者才能生存筛--即筛选。筛选含有质粒的细菌和含有正确重组DNA的细菌克72一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取（二）逆转录法（三）人工合成DNA片段（四）直接从染色体DNA中分离目的基因一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取73（一）从基因文库中获取

目的基因：

指被研究的某一基因或DNA序列，即需要克隆或表达的基因。

基因组文库（genomiclibrary，G-文库）是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。

cDNA文库（cDNAlibrary）：以细胞全部mRNA经逆转录，制备出全套cDNA建库。（一）从基因文库中获取74构建G文库筛选目的基因一、别离基因组DNA二、载体的选择〔一般为噬菌体〕三、将基因组DNA片段连接入载体四、将重组载体转入宿主细胞

构建G文库筛选目的基因一、别离基因组DNA75组织细胞

破碎细胞，除去DNA与蛋白质提取总RNA

Oligo(dT)纤维素亲和层析制备mRNA

反转录合成cDNA第一链合成cDNA第二链合成cDNA双链

插入载体重组DNA

导入大肠杆菌扩增构建cDNA文库构建cDNA文库筛选目的基因组织细胞构建cDNA文库筛选目的基因76基因工程与药物课件77（二）逆转录PCR法。

选用富含目的基因mRNA的细胞作为实验材料，有利于分离到目的基因。如胰岛素基因的mRNA主要存在于胰腺组织，血红蛋白基因的mRNA占网质红细胞总mRNA的50%~90%。（二）逆转录PCR法。78PCR

特点：短时间获得大量DNA片段。PCR79（三）人工合成DNA片段

根据已知某种基因的核苷酸序列，再用DNA合成仪人工合成目的基因,可分段合成。此法适用于合成分子量较小的目的基因（100bp以内），如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。（三）人工合成DNA片段80（四）直接从染色体DNA中分离目的基因根据染色体DNA的限制性内切酶图谱，用适当的限制性内切酶切割染色体DNA、分离目的基因。本方法较适用于制备原核生物目的基因，（四）直接从染色体DNA中分离目的根据染色体DNA81二、载体的选择噬菌体和粘性质粒载体常用来构建基因组文库pUC系列等质粒常用来构建cDNA文库和克隆较小DNA片段M13噬菌体则用于克隆一些待测的DNA序列。二、载体的选择噬菌体和粘性质粒载体常用来构建基因组文库82三、目的基因和载体酶切与连接(一)粘性末端连接本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点图4-10A粘性末端DNA重组体的构建三、目的基因和载体酶切与连接本法适用于在质粒和目的基图4-183图4-10B粘性末端DNA重组体的构建3

HO-G━━━━━CTTAA-p5

5p-AATTC━━━━━G-OH

3

3HO-G━━━━━CTTAA-p5

5p-AATTC━━━━━

G-OH3

质粒目的基因

━━━━━━━━━━━━━━━━目的基因和载体连接EcoRⅠEcoRⅠ碱性磷酸酶3HO-G━━━━━CTTAA-OH5

5HO-AATTC━━━━━G-OH

3

退火DNA连接酶

3HO-G━━━━━CTTAAG━━━━━CTTAA-p55p–AATTC━━━━━GAATTC━━━━━

G-OH3

图4-10B粘性末端DNA重组体的构建384(二)平末端连接质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶目的基因重组质粒产生粘性末端的内切酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1核酸酶S11．质粒和目的基因上没有相同的酶切位点平末端连接模式图(二)平末端连接质粒产生平末端的DNA连接酶目的基因重组质85本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点图人工接头构建DNA重组体

2．人工接头本法适用于在图人工接头构建DNA重组体2．人工接863.通过同聚尾连接本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点图同聚尾连接法构建DNA重组体3.通过同聚尾连接本法适用于在图同聚尾连接法构建D87质粒目的基因

━━━━━━━━━━━━━━━━333ACGTC━━━━━G55G━━━━━CTGCA33

GnGGGACGTC━━━━━G55G━━━━━CTGCAGGGGn33CnCCC━━━━━55━━━━━CCCCn3末端转移酶dGTP末端转移酶dCTP混合，退火1）转化细菌2）体内修复图4-12-B同聚尾连接法构建DNA重组体GCCCC━━━━━GGGGACGTC

CTGCAGGGG

━━━━━CCCC

G

PstⅠ

核酸外切酶目的基因和载体连接GACGTCCTGCAGGACGTCCTGCAGCCC

━━━━━━━GGG

GGG

━━━━━━━CCCPstⅠ

PstⅠ

质粒目的基因━━━━━━━━━━━━━━━━3388通过PCR技术引物设计时导入限制性酶切位点通过PCR技术引物设计时导入限制性酶切位点89四、重组DNA导入受体细胞

以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入受体细胞的过程称为转化(transformation）。四、重组DNA导入受体细胞90对受体细胞的要求：容易接纳重组分子〔处于感受态〕

对载体的复制扩增无严格限制

不存在特异的内切酶体系降解外源DNA〔R-〕

不对外源DNA进展修饰〔Rec-〕

符合“重组DNA操作规那么〞平安标准(sars)

对受体细胞的要求：容易接纳重组分子〔处于感受态〕91常用的受体细胞是大肠杆菌。重组DNA导入大肠杆菌方法：1.CaCl2处理，增加大肠杆菌细胞膜通透性。2.电穿孔法，效率最高。3.体外包装DNA重组体，再转染宿主细胞〔噬菌体〕。感受态细胞(competentcell):细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞常用的受体细胞是大肠杆菌。重组DNA导入大肠杆菌方法：92重组DNA导入哺乳动物细胞的方法1.DNA-磷酸钙共沉淀2.病毒感染法RNA病毒与DNA病毒，polybrene〔凝聚胺〕电荷中和作用3.显微注射法转基因动物研究重组DNA导入哺乳动物细胞的方法1.DNA-磷酸钙共沉淀93

阳性克隆：指目的DNA重组体转入宿主细胞的克隆。阳性克隆的筛选:直接筛选法－－遗传学表型改变(抗性基因、蓝白斑等）间接筛选法－－核酸水平（限制酶切、PCR扩增），杂交法蛋白质水平（免疫学方法）

五、重组体的筛选和鉴定阳性克隆：阳性克隆的筛选:五、重组体的筛选和鉴定94（一）遗传标记表型特征筛选

1．抗生素抗性标记筛选

因大多数质粒载体带有抗生素抗性标记的特征（如Ampr、Tetr等），当带有完整抗性基因的载体转化无抗性细菌后，被转化的阳性菌获得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌斑，未转化菌不能存活，但应排除未重组的空载体。

（一）遗传标记表型特征筛选95抗生素抗性标记筛选抗生素抗性标记筛选962．双抗生素筛选法

某些质粒载体如pBR322质粒中装有Ampr和Tetr抗性基因，在这两个基因中装有几个常用的MCS，如将外源DNA片段插入BamHⅠ识别序列时，则此质粒由Tetr变为对四环素敏感（Tets）。这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为双抗生素对照筛选。

图4-13重组体的筛选—双抗生素对照筛选2．双抗生素筛选法某些质粒载体如pBR97

双抗生素筛选法

双抗生素筛选法98

重组体的筛选—双抗生素对照筛选重组体的筛选—双抗生素对照筛选993．蓝白斑筛选

3．蓝白斑筛选100阳性克隆阴性克隆阳性克隆阴性克隆1014.遗传互补法

如二氢叶酸复原酶，胸腺核苷激酶基因等

5.噬菌斑形成筛选法

噬菌体载体筛选4.遗传互补法

如二氢叶酸复原酶，胸腺核苷激酶基因等

5.102噬菌斑形态噬菌斑形态103（二）重组子结构特征的筛选1．重组子大小鉴别筛选重组子装有外源DNA，分子量较原载体大得多，从挑选的菌落中分别提取重组载体DNA和原载体DNA，用一种限制酶切消化后直接进行电泳，原载体DNA分子量较小、电泳迁移率较大；而重组载体DNA因分子量较大而迁移率较小。2．酶切鉴定少量培养含重组子的菌株，从中分别提取重组载体DNA和原载体DNA，根据已知外源基因两端的酶切位点，分别用相应的两种内切酶进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，只出现一条区带的是原载体本身，而重组载体还多一条外源DNA片段的区带，可根据DNAmark来分析插入DNA片段的分子量。（二）重组子结构特征的筛选1．重组子大小鉴别筛选重组104酶切筛选--利用限制性内切酶的切割来鉴定质粒中是否有目的基因DNA存活的含有质粒的细菌菌落接种细菌细菌培养大量生长的细菌质粒提取和含目的DNA无目的DNA酶切鉴定获得含有目的基因DNA的重组质粒和菌种酶切筛选--利用限制性内切酶的切割来鉴定质粒中是否有目的基因105

3．PCR筛选法提取重组子DNA，利用插入外源基因两端互补的特异引物，对重组子DNA进行PCR扩增。此法不仅可分离扩增目的基因，还可对目的基因进行测序。

4．核酸杂交技术筛选细菌、噬菌体原位杂交，northernblot和Southernblot杂交技术筛选。

5.蛋白检测免疫学技术如Westernblot，Elisa等。3．PCR筛选法提取重组子DNA，利用插入外源基106杂交杂交107插入片段方向性鉴定联合酶切插入片段的末端和载体上各选一限制酶位点后酶切鉴定插入片段方向性鉴定联合酶切108基技学院严永敏

基因重组与基因工程基技学院严永敏基因重组与基因工程109概念基因重组（geneticrecombination）：指不同来源的DNA分子通过重新组合（插入、缺失、置换等）形成新的重组DNA分子的过程。概念基因重组（geneticrecombination110自然界的基因重组一、转化作用概念：受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞局部遗传性状的现象。DNADNA片段新DNA重组摄取溶解自然界的基因重组一、转化作用DNADNA片段新DNA重组摄取111转导作用概念：以病毒为媒介发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。转导作用112转位：概念：基因从基因组的一个位置转移到另一个位置。转位：113基因工程与药物课件114基因工程与药物课件115第一节概述第二节基因工程相关的酶学第三节基因工程的载体〔vector〕第四节目的基因制备和常用别离方法第五节载体DNA和目的基因的连接第六节重组DNA分子引入受体细胞第七节重组体的鉴定与分析第八节克隆基因的表达第一节概述116基因工程（geneticengineering）：

在体外应用人工方法进行基因重组，然后导入宿主细胞去复制、扩增或表达的过程。因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程。

分子克隆（molecularcloning）:

指按照人的意愿，在体外将制备的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝或表达产物。

基因工程（geneticengineering）：分117分切连转

筛基因工程步骤分切连转118基因工程基因工程119基因工程技术的应用(P307)一、生产〔基因工程〕产品：1.构建基因组文库，cDNA文库，核酸探针等2.生产基因的(用于医药目的)的一级产品，即蛋白质、多肽；二级产品，如维生素、多糖、氨基酸(因为它们由酶催化产生〕3.生产基因疫苗、如:乙肝疫苗.二、改进生物的性状如将固氮基因引入水稻,就可以不用施氮肥了基因治疗三、分子诊断基因工程技术的应用(P307)一、生产〔基因工程〕产品：120

在分子克隆技术中，对DNA进行切割、合成、补平、连接和修饰等工具酶是必不可少的。常用的工具酶主要有：

限制性核酸内切酶、DNA聚合酶Ⅰ、逆转录酶、DNA连接酶、碱性磷酸酶、多核苷酸激酶和末端脱氧核苷酸转移酶，甲基化酶等。重要的工具酶（toolenzyme)

在分子克隆技术中，对DNA进行切割、合成、补平、121一、限制性核酸内切酶

（restrictionendonuclease，RE）

简称限制酶，是一类能识别和切割特定DNA序列的核酸内切酶，为原核生物所特有。分为三型。其中Ⅱ型被称为基因工程的分子剪刀，是分子克隆技术中最重要的工具酶。一、限制性核酸内切酶

（restrictionendonu122作用ⅠⅡⅢ

三种限制性核酸内切酶的作用(P309)

酶活性

核酸内切酶

核酸内切酶

核酸内切酶

甲基化酶甲基化酶

ATP酶

DNA解旋酶DNA链上的无

有

有特异识别位点DNA链上的无

在识别序列内

在识别序列外特异切割位点在分子克隆中无

有

无的重要意义作用ⅠⅡ123〔一〕限制酶的命名与分类EcoR

I产生该酶的宿主菌属名微生物的种名

宿主菌的株或型同一菌株中不同限制酶的编号（按发现先后顺序）

大肠杆菌Escherichia属、coli种、RY13株中分离到几种限制酶，分别表示为:

EcoR

I

、EcoR

Ⅱ、EcoR

Ⅴ等。〔一〕限制酶的命名与分类EcoRI产生该酶的微生物的种名124（二）Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用

根据需要在特定的位点上精确切割双链DNA分子，产生特异末端的DNA片段。识别序列：双链DNA特异的碱基对（一般46个），在识别序列内特异切割DNA。断裂磷酸二酯键（二）Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用根据需要在特定的位点125

Ⅱ型限制酶的特异识别序列回文结构（palindromestructure）：

指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列。5——GAATTC——3ATATGC5’3’EcoRⅠ识别序列：对称轴3——CTTAAG——5Ⅱ型限制酶的特异识别序列5——GAATTC——3ATA126粘性末端（cohesiveend）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的带单链突出的末端。—GAATTC——CTTAAG—平末端（bluntend）：

指限制酶在对称轴上同时切割互补DNA双链所产生的末端。EcoRⅠ—CCCGGG——GGGCCC—SmaⅠ粘性末端（cohesiveend）：—GAATTC—平末端12744128基因工程与药物课件129基因工程与药物课件130同裂酶（isoschizomers）:来源不同，但能识别和切割同一核苷酸序列的限制酶，也称异源同工酶。

这些同工异源酶可以互相代用。如：BamHⅠ和BstⅠ（GGATCC）；

XhoⅠ和

PaeR7（CTCGAG）。同裂酶（isoschizomers）:这些同工异源酶可以互相131

如：BamHⅠ（G

GATCC）和Sau3AⅠ（N

GATCN）。

同尾酶（isocaudamers）:

来源，识别序列，且切割方式均不同，但可产生相同粘性末端的限制酶。

产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在DNA重组时具有更大的灵活性。如：BamHⅠ（GGATCC）132“分子剪刀〞的应用根据特异识别序列切割DNA片段用于基因组方案研究〔如物理图谱)，基因组文库，DNA序列分析,DNA分子杂交，制备探针〕限制性片段长度多态性〔restrictionfragmentlengthpolymorphysm，RFLP〕研究，用于法医学个体识别和遗传性疾病的诊断等－DNA指纹分析“分子剪刀〞的应用根据特异识别序列切割DNA片段133人类两个个体的基因组DNA中平均有1000万处不同，多位于非编码序列中。碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现，当使用同一限制酶切割不同个体基因组DNA时，DNA片段长度出现差异，这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为RFLP。

限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)人类两个个体的基因组DNA中平均有1000万处不同，134GAATTC

CTTAAGGATTTC

CTAAAG1212III2kb3kb5kb7kb个体识别

RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。

GAATTC

CTTAAGGATTTC

CTAAAG1135RFLP在遗传病检测中的应用镰状细胞贫血症（globin，6），其GAGGTG的突变（MstII，CCTNAGG）RFLP在遗传病检测中的应用镰状细胞贫血症（glo136一、限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease，简称限制酶），分为三型。其中Ⅱ型被称为基因工程的分子手术刀，是分子克隆技术中最重要的工具酶。甲基化限制酶一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（res137作用ⅠⅡⅢ三种限制性核酸内切酶的作用

酶活性

核酸内切酶

核酸内切酶

核酸内切酶

甲基化酶甲基化酶ATP酶DNA解旋酶DNA链上的无

有

有特异识别位点DNA链上的无

在识别序列内

在识别序列外特异切割位点在分子克隆中无

有

无的重要意义作用Ⅰ138（二）Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用限制酶功能：根据需要在特定的位点上

精确切割双链DNA分子。Ⅱ型限制酶能识别双链DNA特异的46个碱基对，并在此序列内特异切割DNA。（二）Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用限制酶功能：根据需要在特定的139回文结构（palindromestructure）：

指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限制酶所识别）。5——GAATTC——3ATATGC5’3’EcoRⅠ识别序列：对称轴3——CTTAAG——5回文结构（palindromestructure）：5—140粘性末端（stickyend）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。—GAATTC——CTTAAG—平末端（bluntend）：

指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。EcoRⅠ—CCCGGG——GGGCCC—SmaⅠ粘性末端（stickyend）：—GAATTC—平末端（b141图4-1回文结构和限制性核酸内切酶作用模式图图4-1回文结构和限制性核酸内切酶作用模式图142二、DNA连接酶

基因工程的缝纫针主要功能:催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5磷酸基团与3羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来，实现DNA体外重组。包括大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶。二、DNA连接酶基因工程的缝纫针143图4-4DNA连接酶作用模式图

大肠杆菌DNA连接酶只能连接粘性末端，而T4DNA连接酶既能连接粘性末端，又能连接平末端。图4-4DNA连接酶作用模式图大肠杆菌D144三、DNA聚合酶（一）DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ）是单一多肽链的多功能酶，分子量为109kD，它具有3种酶活性：①5→3

DNA聚合酶活性。②3→5核酸外切酶活性。③5→3核酸外切酶活性。三、DNA聚合酶（一）DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段145Klenow片段的主要用途：

①补齐双链DNA的3末端，同时可使3末端DNA标记同位素。②cDNA克隆中，合成cDNA第二链。图4-2DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段5→3外切酶5→3聚合酶3→5外切酶DNA聚合酶Ⅰ(103kD)Klenow片段NC

5→3聚合酶3→5外切酶(68kD)35kD(小)68kD(大)CN枯草杆菌蛋白酶Klenow片段的主要用途：图4-2DNA聚合酶Ⅰ和146（二）TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶（简称Taq酶）是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度是70~80℃，Taq酶具有5→3聚合酶活性和依赖于聚合作用的5→3外切酶活性。TaqDNA聚合酶可用于DNA测序及通过聚合酶链反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增。

（二）TaqDNA聚合酶147①RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）。②核糖核酸酶H活性（RNaseH）。③DNA聚合酶活性（DDDP）。逆转录酶的作用：（三）逆转录酶

逆转录酶（reversetranscriptase）是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。逆转录酶是多功能酶。

①RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）。②核糖1485335RNA(用表示)RNA-DNA杂化分子35

RNase（核酸酶H活性)

DDDP（DNA聚合酶活性）

4种dNTPRDDP（逆转录酶）引物、4种dNTP病毒双链DNA用表示）（cDNA第二链(complementaryDNA，cDNA)与病毒RNA互补的DNA(用表示)5335

535

3图4-3逆转录酶的作用5335RNARNA-DNA杂化分149

末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT，简称末端转移酶）分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3末端-OH上。四、末端脱氧核苷酸转移酶末端转移酶的功能主要有：①在载体或目的基因3末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。②用于DNA3末端的同位素探针标记。末端脱氧核苷酸转移酶（terminal150(A、G、C、T)nOH5′3′5′3′OH5′3′5′3′(A、G、C、T)nMg2+dNTPnppiMg2+dNTPnppi5′3′OH5′3′OH

5′3′5′3′(A、G、C、T)nCo2+dNTPnppiCo2+dNTPnppi（1）底物是单链DNA或有3突出末端的双链DNA，需要Mg2+。（2）底物是平端或3凹端的双链DNA，需要Co2+。(A、G、C、T)n(A、G、C、T)nOH5′3′5′151五、碱性磷酸酶

碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基团。主要用途有：除去DNA片段上的5磷酸以防自身连接。

5-pCpGpC┅┅-OH3

碱性磷酸酶5-CpGpC┅┅-OH35-p3-HO5-HO3-HO五、碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkalin152第二节载体

指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。制备的目的基因或外源性DNA片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。载体包括克隆载体和表达载体。载体（vector）:第二节载体指能携带外源DNA片段导入宿主细153①能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般<10Kb。②带有遗传筛选标记。③有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。

载体上具有多个限制酶的单一切点（即在载体的其它部位无这些酶的相同切点）称为多克隆位点（multiplecloningsites，MCS）。载体应具备的特征：①能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般<10Kb。154多克隆位点复制起始点抗药基因抗药基因多克隆位点复制起始点抗药基因抗药基因155质粒(plasmid)载体

噬菌体(phage)载体

真核病毒(virus〕载体

按来源分：PBR322；pUC系列；pGEM系列；M13mp系列；噬菌体载体；柯斯质粒（粘粒）；SV40载体；逆转录病毒载体；腺病毒载体；质粒(plasmid)载体

噬菌156

克隆载体(cloningvector)：

用于克隆和扩增某一DNA序列，为研究提供材料或建立基因库。表达载体(expressionvector)：附加表达构件——参与转录和翻译所必需的调控序列，用于表达相关的蛋白质产品。穿梭载体(shuttervector)：既能在原核细胞中复制，又能在真核细胞中复制表达的载体。按功能分：克隆载体(cloning157一、克隆载体（一）质粒载体

质粒（plasmid）是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。

分为“紧密型”和“松弛型”一、克隆载体（一）质粒载体158质粒与宿主细胞的关系（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主细胞中（2）质粒离开宿主就无法生存，必须依赖宿主细胞的（３）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关的，如抗生素抗性基因：Ampr酶，水解β-内酰胺环,解除氨苄毒性,使细菌抗氨苄。Tetr膜蛋白,可阻止四环素进入细胞,使细菌抗四环素。质粒与宿主细胞的关系159①

用于保存和扩增<2Kb目的DNA。②

构建cDNA文库。③目的DNA的测序。④作为核酸杂交时的探针来源。质粒克隆载体的主要用途：Super-coiledformRelaxedcircleLinearized

form①用于保存和扩增<2Kb目的DNA。质粒克隆载体的主要160质粒的理化性质具有核酸分子的一般理化特性：可嵌入某些染料〔溴化乙锭〕具有较强的抗切割和抗变性的能力质粒的理化性质161质粒DNA琼脂糖凝胶电泳转GFP质粒D