《单克隆抗体技术》课件

单克隆抗体技术单克隆抗体技术1疫苗和抗体的研制，是生物技术发展的永恒主题。目前在美国单克隆抗体类药物已占FDA所批生物药的3/4。疫苗和抗体的研制，是生物技术发展的永恒主题2美国已上市16种单克隆抗体药物2002年销售额29亿美元2005年90亿美元我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段，更谈不上抗体组药物的发展。凝集细菌抗体攻击病毒美国已上市16种单克隆抗体药物凝集细菌抗体攻击病毒3抗体是对其抗原有极强专一性的魔弹或巡弋飞弹研究 以免疫转印法检测

特定抗原医疗 以毒素连结抗体攻击

病变細胞检验 以ELISA侦测特定

病原体抗体是对其抗原有极强专一性的研究 以免疫转印法检测特4抗体药物销售趋势图抗体药物销售趋势图5生物技术生物技术制药基因工程药物（蛋白类药物）人源化治疗性单克隆抗体药物基因治疗技术现代中药生物技术生物技术制药基因工程药物（蛋白类药物）人源化治疗性单6●至2000年底，在美国药品市场上生物技术药物有76种，其中抗体药物有15种。●2003年治疗用单抗销售总额已超过52亿美元。●2006年预计50-60个治疗性单抗上市。●2010年预计单抗销售额200亿美元。●美国已占全球单抗市场90%—一支独秀。●完全人源化单抗现有多个处于临床前阶段●至2000年底，在美国药品市场上生物技术药物有76种，7多克隆抗体多克隆抗体8Epitope,Antigenicdeterminant抗原決定基●

一个抗原分子上可能有数个抗原決定基●

每個

抗原決定基

至少誘生一種專一性抗体●蛋白质性

抗原決定基

含有六个以上氨基酸Epitope,Antigenicdeterminant9整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术噬菌体抗体库技术Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技10多克隆抗体（polyclonalantibody）指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异性抗体）。

实际意义：（1）预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清抗破伤风，胎盘球蛋白抗病毒感染等副作用：超敏反应（2）临床诊断，如：肥达氏反应--伤寒、副伤寒缺点：特异性差。多克隆抗体（polyclonalantibody）11抗体体内生成的理论

抗原刺激前，机体具有抗体初级库抗原刺激后，抗体生成的细胞群体被选择，并发生克隆性增殖。在抗原的反复刺激下，抗体的V区发生高频率突变，产生高亲和力抗体的细胞被选择，抗体进行类别转换，最终抗体成熟。抗体体内生成的理论12传统抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234脾脏淋巴結B細胞传统抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234脾13

传统抗血清的交叉反应专一性反应沒有反應交叉反应+-?123AgA

xyzAgB1’20AgA’123123123传统抗血清的交叉反应专一性反应沒有反應交叉反应+-?114单克隆抗体单克隆抗体15杂交瘤技术的理论基础淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb杂交瘤技术的理论基础淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克16可生产有用抗体的

淋巴細胞

若与

癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。癌细胞可培养生长浆细胞Bcell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组染色体混在一起也可以培养生長产生专一性抗体一個Bcell只产生一种抗体可生产有用抗体的淋巴細胞若与癌细胞融合，则形成稳定而可17细胞DNA合成途经1.替代途径：次黄嘌呤（H）HGPRT2.主要途径：氨基酸鸟嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷单磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）细胞DNA合成途经1.替代途径：次黄嘌呤（H）18m核酸补救合成m核酸从头合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黄嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-m核酸补救合成m核酸从头合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黄嘌呤19HAT选择培养基的原理HAT选择培养基组分次黄嘌呤（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)HAT选择培养基的原理HAT选择培养基组分20

抗原免疫的脾细胞小鼠骨髓瘤细胞（B细胞）（B细胞恶性肿瘤）1.抗体分泌（Ig+)1.具永生性2.HGPRT+在HAT生长2.8-AG筛选出

HGPRT-株

PEG融合HAT筛选

脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）

（HGPRT+、Ig+）

抗原免疫的脾细胞小鼠骨髓瘤细21融合的结果及命运杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞脾-脾杂交细胞骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞融合的结果及命运杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞脾22免疫动物培养骨髓瘤细胞

收集致敏的B淋巴细胞收集骨髓瘤细胞

细胞融合HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞检测筛选阳性细胞

克隆化培养（反复3-5次）

获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株

McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）

McAb纯化及鉴定免疫动物23制备单克隆抗体的基本技术1抗原提纯与动物免疫2骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备3细胞融合4抗体检测5杂交瘤的克隆化和冻存6McAB的制备7单克隆抗体的纯化制备单克隆抗体的基本技术1抗原提纯与动物免疫24

抗体-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和

脾脏产生各种

B細胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫

抗原采血后可得传统抗血清已建立之小鼠骨髓癌细胞株由脾脏收集B細胞抗原通常有多个抗原決定基免疫后的脾脏约在两月內注射五到八次AgX抗体-a-b-c-d-a-b-25免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）冲击免疫（融合前3天进行）选用6-12周龄Balb/c小鼠免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细26颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果271234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗体分开1234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾細胞+各抗28骨髓瘤细胞系选择要点：稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63等。保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）防止支原体污染（胎牛血清）融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％融合比例脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞饲养细胞一般在融合前一天制备

骨髓瘤细胞系选择要点：29免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。融合比例：骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）融合24小时后加HAT培养液2周后改用HT培养液2周后改用一般培养液免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取30-d细胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤细胞（Subcloning）

(确定只有一种细胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌细胞Bcell脾细胞分株培养筛选筛选单抗传统抗体(抗血清)试验专一性对抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d’新的抗原-d细胞融合-a-b-c-dAgAgELISAHATPEG31一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选32克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体33

●

一个

B细胞只能生产一种抗体，对付某一

抗原決定基。●

若有许多抗原決定基，则需许多株

B細胞分別生产许多抗体。BBBYYYY抗原BYB亲和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基●一个B细胞只能生产一种抗体，对付某一抗原決定基341234mmmm1234YYYYYYYYY1234mmmm1234YYYYYYYYY35单抗生产的方法：动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。单抗生产的方法：36基因工程抗体基因工程抗体37《单克隆抗体技术》课件381人一鼠嵌合抗体(ChimericAntibodies)人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。1人一鼠嵌合抗体(ChimericAntibodies)39

构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。构建重组表达载体构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆40克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。

人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PC412鼠单抗可变区的人源化

尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。

2鼠单抗可变区的人源化尽管嵌合抗体的免疫42《单克隆抗体技术》课件43经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体）经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力44人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。

人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。45

定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。

研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR序46小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。小分子抗体有很多优点:

可以用细菌发酵生产，成本低;分子小，穿透力强;不含Fc，没有Fc带来的效应;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。

3小分子抗体小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别47FvScFv单区抗体最小识别单位FabFvScFv单区抗体最小识别单位Fab48由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。

把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。(1)Fab由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。(149

Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv连接肽Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。(250

Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。

连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。

Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳51

单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法;在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中;如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法;52

单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式:一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性;二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式:53即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。(3)单域抗体VH即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，54约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。(4)最小识别单位CDR约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构554双特异抗体和多价抗体

双链抗体（Diabody）一词最早由Hollinger等于1993年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。

4双特异抗体和多价抗体双链抗体（Diabody）56

双特异性抗体(bispecificantibody,BSAb)是指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原。另1种为对应效应成分。

即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。双特异性抗体(bispecificantibody57

Hollinger等巧妙地将Ａ抗原抗体的轻链可变区基因(VLA)与抗Ｂ抗原抗体的重链可变区(VHB)通过短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中,构建成双链抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺反子。表达后,VLAVHB与VHAVLB交叉连结,形成双特异性抗体。Hollinger等巧妙地将Ａ抗原抗体的轻链可变区基58《单克隆抗体技术》课件59所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比,除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是肿瘤治疗的新突破。所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比,除了能特异性60《单克隆抗体技术》课件61

抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。

PCR技术;免疫球蛋白Fab片段在大肠杆菌中的成功表达;噬菌体表面展示文库技术。5抗体库技术5抗体库技术62

初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。

初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA，反转63它是在PCR技术和PhageDisplay的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与PⅢ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。噬菌体抗体库技术它是在PCR技术和PhageDisplay的基础上实现64

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。噬菌体表面展示系统(phagesurfacedisplaysystem)1990年McCafferty等成功地建立了噬菌体表面65《单克隆抗体技术》课件66

噬菌体表面展示文库技术的要点:外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因g3或g8的先导系列的紧靠下游随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段噬菌体表面展示文库技术的要点:67用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的周质腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简68该项技术的优点:

将抗体的基因型和表型紧密联系起来;可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术;抗体基因筛选的范围广;技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产;适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。该项技术的优点:69噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容70《单克隆抗体技术》课件71单克隆抗体技术单克隆抗体技术72疫苗和抗体的研制，是生物技术发展的永恒主题。目前在美国单克隆抗体类药物已占FDA所批生物药的3/4。疫苗和抗体的研制，是生物技术发展的永恒主题73美国已上市16种单克隆抗体药物2002年销售额29亿美元2005年90亿美元我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段，更谈不上抗体组药物的发展。凝集细菌抗体攻击病毒美国已上市16种单克隆抗体药物凝集细菌抗体攻击病毒74抗体是对其抗原有极强专一性的魔弹或巡弋飞弹研究 以免疫转印法检测

特定抗原医疗 以毒素连结抗体攻击

病变細胞检验 以ELISA侦测特定

病原体抗体是对其抗原有极强专一性的研究 以免疫转印法检测特75抗体药物销售趋势图抗体药物销售趋势图76生物技术生物技术制药基因工程药物（蛋白类药物）人源化治疗性单克隆抗体药物基因治疗技术现代中药生物技术生物技术制药基因工程药物（蛋白类药物）人源化治疗性单77●至2000年底，在美国药品市场上生物技术药物有76种，其中抗体药物有15种。●2003年治疗用单抗销售总额已超过52亿美元。●2006年预计50-60个治疗性单抗上市。●2010年预计单抗销售额200亿美元。●美国已占全球单抗市场90%—一支独秀。●完全人源化单抗现有多个处于临床前阶段●至2000年底，在美国药品市场上生物技术药物有76种，78多克隆抗体多克隆抗体79Epitope,Antigenicdeterminant抗原決定基●

一个抗原分子上可能有数个抗原決定基●

每個

抗原決定基

至少誘生一種專一性抗体●蛋白质性

抗原決定基

含有六个以上氨基酸Epitope,Antigenicdeterminant80整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术噬菌体抗体库技术Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技81多克隆抗体（polyclonalantibody）指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异性抗体）。

实际意义：（1）预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清抗破伤风，胎盘球蛋白抗病毒感染等副作用：超敏反应（2）临床诊断，如：肥达氏反应--伤寒、副伤寒缺点：特异性差。多克隆抗体（polyclonalantibody）82抗体体内生成的理论

抗原刺激前，机体具有抗体初级库抗原刺激后，抗体生成的细胞群体被选择，并发生克隆性增殖。在抗原的反复刺激下，抗体的V区发生高频率突变，产生高亲和力抗体的细胞被选择，抗体进行类别转换，最终抗体成熟。抗体体内生成的理论83传统抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234脾脏淋巴結B細胞传统抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234脾84

传统抗血清的交叉反应专一性反应沒有反應交叉反应+-?123AgA

xyzAgB1’20AgA’123123123传统抗血清的交叉反应专一性反应沒有反應交叉反应+-?185单克隆抗体单克隆抗体86杂交瘤技术的理论基础淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb杂交瘤技术的理论基础淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克87可生产有用抗体的

淋巴細胞

若与

癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。癌细胞可培养生长浆细胞Bcell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组染色体混在一起也可以培养生長产生专一性抗体一個Bcell只产生一种抗体可生产有用抗体的淋巴細胞若与癌细胞融合，则形成稳定而可88细胞DNA合成途经1.替代途径：次黄嘌呤（H）HGPRT2.主要途径：氨基酸鸟嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷单磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）细胞DNA合成途经1.替代途径：次黄嘌呤（H）89m核酸补救合成m核酸从头合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黄嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-m核酸补救合成m核酸从头合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黄嘌呤90HAT选择培养基的原理HAT选择培养基组分次黄嘌呤（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)HAT选择培养基的原理HAT选择培养基组分91

抗原免疫的脾细胞小鼠骨髓瘤细胞（B细胞）（B细胞恶性肿瘤）1.抗体分泌（Ig+)1.具永生性2.HGPRT+在HAT生长2.8-AG筛选出

HGPRT-株

PEG融合HAT筛选

脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）

（HGPRT+、Ig+）

抗原免疫的脾细胞小鼠骨髓瘤细92融合的结果及命运杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞脾-脾杂交细胞骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞融合的结果及命运杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞脾93免疫动物培养骨髓瘤细胞

收集致敏的B淋巴细胞收集骨髓瘤细胞

细胞融合HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞检测筛选阳性细胞

克隆化培养（反复3-5次）

获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株

McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）

McAb纯化及鉴定免疫动物94制备单克隆抗体的基本技术1抗原提纯与动物免疫2骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备3细胞融合4抗体检测5杂交瘤的克隆化和冻存6McAB的制备7单克隆抗体的纯化制备单克隆抗体的基本技术1抗原提纯与动物免疫95

抗体-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和

脾脏产生各种

B細胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫

抗原采血后可得传统抗血清已建立之小鼠骨髓癌细胞株由脾脏收集B細胞抗原通常有多个抗原決定基免疫后的脾脏约在两月內注射五到八次AgX抗体-a-b-c-d-a-b-96免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）冲击免疫（融合前3天进行）选用6-12周龄Balb/c小鼠免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细97颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果981234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗体分开1234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾細胞+各抗99骨髓瘤细胞系选择要点：稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63等。保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）防止支原体污染（胎牛血清）融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％融合比例脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞饲养细胞一般在融合前一天制备

骨髓瘤细胞系选择要点：100免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。融合比例：骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）融合24小时后加HAT培养液2周后改用HT培养液2周后改用一般培养液免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取101-d细胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤细胞（Subcloning）

(确定只有一种细胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌细胞Bcell脾细胞分株培养筛选筛选单抗传统抗体(抗血清)试验专一性对抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d’新的抗原-d细胞融合-a-b-c-dAgAgELISAHATPEG102一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选103克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体104

●

一个

B细胞只能生产一种抗体，对付某一

抗原決定基。●

若有许多抗原決定基，则需许多株

B細胞分別生产许多抗体。BBBYYYY抗原BYB亲和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基●一个B细胞只能生产一种抗体，对付某一抗原決定基1051234mmmm1234YYYYYYYYY1234mmmm1234YYYYYYYYY106单抗生产的方法：动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。单抗生产的方法：107基因工程抗体基因工程抗体108《单克隆抗体技术》课件1091人一鼠嵌合抗体(ChimericAntibodies)人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。1人一鼠嵌合抗体(ChimericAntibodies)110

构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。构建重组表达载体构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆111克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。

人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PC1122鼠单抗可变区的人源化

尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。

2鼠单抗可变区的人源化尽管嵌合抗体的免疫113《单克隆抗体技术》课件114经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体）经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力115人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。

人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。116

定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。

研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR序117小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。小分子抗体有很多优点:

可以用细菌发酵生产，成本低;分子小，穿透力强;不含Fc，没有Fc带来的效应;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。

3小分子抗体小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别118FvScFv单区抗体最小识别单位FabFvScFv单区抗体最小识别单位Fab119由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。

把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。(1)Fab由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。(1120

Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv连接肽Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。(2121

Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。

连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。

Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳122

单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法;在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中;如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法;123

单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式:一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性;二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式:124即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。(3)单域抗体VH即为VH，