产前诊断中绒毛、脐血、羊水取样及标本培养课件

产前诊断中绒毛、脐血、羊水取样及标本培养南京大学附属鼓楼医院妇产科产前诊断中心李洁副主任医生2006年11月产前诊断中绒毛、脐血、羊水取样及标本培养南京大学附属鼓楼医院产前诊断指征夫妇任一方有染色体异常；曾生育过染色体病患者；夫妇任一方为单基因病患者；曾生育过单基因病患者；有不明原因的自然流产史、畸胎史、死产或新生儿死亡史；产前诊断指征夫妇任一方有染色体异常；产前诊断指征羊水过多的孕妇；夫妇任一方曾接触致畸因素；孕妇年龄大于35岁；有遗传病家族史的近亲婚配的夫妇。产前筛查高风险的孕妇超声胎儿结构筛查胎儿有结构异常的孕妇产前诊断指征羊水过多的孕妇；产前诊断的方法羊膜腔穿刺取样（amniocentesis）绒毛穿刺取样（chorionvillussampling,cvs）脐带血取样（periumbilicalcordbloodsampling,PUBS）植入前诊断（preimplantatongeneticdiagnosis,PGD）产前诊断的方法羊膜腔穿刺取样（amniocentesis）产前诊断的方法胎儿组织取样（皮肤、肝脏）胎儿镜（fetoscope）胚胎镜（embryoscope）胎儿超声波图象（fetalultrasoundimaging）母体外周血胎儿细胞检测（cell-storing）产前诊断的方法胎儿组织取样（皮肤、肝脏）绒毛穿刺取样—历史1975年我国鞍山钢铁公司铁东医院首次问世（经宫颈盲吸法，准确率95%，自然流产率9.3%，出生婴儿未发现异常）莫斯科产科研究所（超声引导下经宫颈吸样）1983您Ward和Brambati分别于英国和意大利发表文章介绍绒毛取样及核型分析绒毛穿刺取样—历史1975年我国鞍山钢铁公司铁东医院首次问绒毛穿刺取样—时间妊娠9—11周绒毛穿刺取样—时间妊娠9—11周绒毛穿刺取样—抽取量20mg左右（染色体核型分析约需10mg，DNA分析约需5mg，生化测定约需5-10mg）绒毛穿刺取样—抽取量20mg左右（染色体核型分析约需10m绒毛穿刺取样—并发症胎儿丢失胎儿肢体发育缺陷（LRD）绒毛穿刺取样—并发症胎儿丢失CVS并发症—胎儿丢失CVS的流产率不比amniocentesis高经宫颈和经腹取样安全性相同（Jackson,1992）多胎取样高于单胎取样（Pergament,1992）CVS并发症—胎儿丢失CVS的流产率不比amniocenteCVS并发症－LRD1999年WHO发布CVS综合性资料认为CVS与LRD无关（216，381例CVS中115例出现LRD发生率1：1881，总的人群发生率1：1642）世界各地相关资料综合，9周以下CVS出现LRD的机会高，但原因尚不清楚CVS不应在小于孕10周的条件下进行CVS并发症－LRD1999年WHO发布CVS综合性资料认为绒毛穿刺取样—方法经宫颈（transcervical）经腹（transabdorminal）绒毛穿刺取样—方法经宫颈（transcervical）CVS方法—经宫颈取样B超采用高分辨的扇扫式或凸阵式实时超声诊断仪，经腹探头频率3.5MHz,经阴道探头频率5-7MHz。采用特制较细的滋养层活检导管（多聚乙烯导管），其塑料导管外径1.4–1.6mm,长20cm,带有导管芯，导管前端稍弯，外形似宫腔探子。导管另一端连接10-20ml含有2-4ml生理盐水的注射器CVS方法—经宫颈取样B超采用高分辨的扇扫式或凸阵式实时超声CVS方法—经腹取样双针活检系统由1根长15cm、外径1.2mm的18号引导套针，及1根长20cm、外径0.8mm的22号活检针组成。在超声引导下，先将引导套针经腹壁及子宫穿刺入胎盘绒毛边缘部分，拔出针芯，然后将活检针经引导套针内送入胎盘绒毛组织,连接含2-4ml生理盐水的20ml注射器，以5ml的负压上下移动活检针吸取绒毛组织CVS方法—经腹取样双针活检系统由1根长15cm、外径1.2CVS注意事项动作要轻柔穿刺部位在胎盘绒毛叶抽吸次数不宜过多CVS注意事项动作要轻柔羊膜腔穿刺—历史1956年Fucks进行羊膜腔穿刺行胎儿性别鉴定及胎儿Rh溶血诊断1966年Marksteele和RoyBreg从羊水中分离出羊水细胞培养成功并行胎儿核型分析羊膜腔穿刺—历史1956年Fucks进行羊膜腔穿刺行胎儿性羊膜腔穿刺—时间16—20周羊膜腔穿刺—时间16—20周羊膜腔穿刺—抽取量20—30ml羊膜腔穿刺—抽取量20—30ml抽取的羊水用途核型分析——诊断染色体病DNA分析——诊断单基因病生化测定——诊断NTD、代谢性疾病抽取的羊水用途核型分析——诊断染色体病羊水穿刺穿刺前孕妇俯卧位摇动腹部超声波定位引导采用22号或21号带芯长腰穿刺针头垂直、快速进针抽取羊水2ml弃置，换空针抽取羊水羊水穿刺羊膜腔穿刺—并发症胎儿丢失羊膜腔感染羊水渗漏穿刺部位的出血、血肿羊膜腔穿刺—并发症胎儿丢失羊穿并发症---胎儿丢失1976年，NihdRegistry报道流产率3.5%1986年，Taboretal报道流产率1.7%1995年，Bombardetal报道流产率1.3%2000年,Antsaklis报道流产率2.1%羊穿并发症---胎儿丢失1976年，NihdRegistr脐带血穿刺—历史1972年，Valenti用儿科膀胱镜在中期妊娠孕妇行子宫切开术插入羊膜腔，获取脐血标本。1979年，Rodeck和Campell应用胎儿镜行脐带血管穿刺，但由于并发症高，应用受到限制。1983年，TernandDaffos超声引导下经皮脐血管穿刺取血（Cordocentesis）脐带血穿刺—历史1972年，Valenti用儿科膀胱镜在中期脐带血穿刺—时间16周—分娩（最佳24—28周）脐带血穿刺—时间16周—分娩（最佳24—28周）脐带血穿刺—取血量3—5ml20周后抽取6—8ml对胎儿循环无不良影响脐带血穿刺—取血量3—5ml脐带血穿刺—适应症胎儿核型分析或基因检测（胎儿畸形、严重的FGR、羊水或绒毛细胞培养失败、羊水或绒毛培养结果为嵌合体、非免疫性胎儿水肿、脆性X综合症等）胎儿血液疾病分析（血型、血小板计数等）胎儿感染（弓形虫、病毒感染等）胎儿情况评估（酸碱平衡、甲功等）遗传性疾病（单基因病、凝血障碍、血红蛋白病、代谢性疾病等）胎儿治疗（宫内输血、宫内药物治疗等）脐带血穿刺—适应症胎儿核型分析或基因检测（胎儿畸形、严重的F脐带血穿刺—并发症穿刺部位的出血脐带血肿短暂性胎心减慢宫内感染胎儿丢失（流产、早产）大多数并发症为短暂性和非致命性脐带血穿刺—并发症穿刺部位的出血脐带血穿刺并发症—胎儿丢失Maxwell1991年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率为1%（1/76）；异常超声者流产率为7%（5/76）；胎儿结构明显异常者流产率为25%（9/36）Antsaklis1998年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率1%（2/191）；异常超声者流产率为13%（11/84）脐带血穿刺并发症—胎儿丢失Maxwell1991年报道胎儿脐带穿刺部位脐带穿刺部位脐血穿刺—确定胎儿血样血红蛋白电泳Kleihauer-Betke试验：胎儿红细胞在酸中稳定APT试验：NaOH中胎儿血为粉红色有核红细胞的出现脐血穿刺—确定胎儿血样血红蛋白电泳脐血穿刺—排除脐血中母血污染X染色体DMD基因内部5对CA重复序列的连锁分析脐血穿刺—排除脐血中母血污染X染色体DMD基因内部5对CA重绒毛组织、羊水细胞、脐血细胞培养绒毛组织、羊水细胞、脐血细胞培养绒毛组织的培养直接法培养法（悬浮培养、贴壁培养）绒毛组织的培养直接法绒毛组织的染色体检查—直接法孕早期Langhan’s细胞有较高的有丝分裂活性，能提供足以分析的良好有丝分裂相，较绒毛培养简易可靠、操作简单快速绒毛组织的染色体检查—直接法孕早期Langhan’s细胞有较绒毛组织的染色体检查—直接法绒毛组织的分离洗脱加秋水仙素（终浓度2ug/ml，可一次加，也可分次少量加）37OC5%CO2培养箱培养45分钟低渗（1%枸橼酸钠低渗10分钟或1%枸橼酸钠和0.075mol/l1：1低渗40分钟）预固定（甲醇：冰醋酸3：1）10分钟固定（甲醇：冰醋酸3：1）10-20分钟冰醋酸解离绒毛细胞（轻吹打）制片绒毛组织的染色体检查—直接法绒毛组织的分离洗脱绒毛组织的染色体检查—悬浮培养法绒毛挑选洗脱绒毛组织剪成小块入培养瓶（25ml培养瓶每瓶10mg）加特定培养液3ml培养3-6天收获（加秋素、低渗、固定、制片）绒毛组织的染色体检查—悬浮培养法绒毛挑选洗脱绒毛组织的染色体检查—贴壁培养法绒毛组织挑选洗脱绒毛组织剪成小块加0.25%+0.02%EDTA5ml37OC摇床中20分钟加培养基终止消化，离心后弃上清加培养基接种培养5-10天收获绒毛组织的染色体检查—贴壁培养法绒毛组织挑选洗脱羊水细胞培养—细胞类型成纤维样细胞（F细胞）上皮样细胞（密集型上皮样细胞-E细胞、镰刀样上皮细胞、圆形上皮细胞）羊水样细胞（AF细胞）羊水细胞培养—细胞类型成纤维样细胞（F细胞）羊水细胞培养—收获方法原位法消化法刮取法羊水细胞培养—收获方法原位法羊水细胞培养中存在的问题

——污染细菌真菌支原体病毒其他细胞羊水细胞培养中存在的问题

—羊水细胞培养中存在的问题

——母体细胞污染若胎儿为男性，由于母体细胞污染误将胎儿诊断为嵌合体母体细胞在培养中占优势羊水细胞培养中存在的问题

—羊水细胞培养中存在的问题

——母体细胞污染的预防羊水穿刺时，把最先抽得的1-2ml羊水弃掉染色体多态现象的测试羊水细胞、母体细胞的HLA组织定型鉴别羊水细胞培养中存在的问题

—羊水细胞培养中存在的问题

——细胞不生长、不贴壁最常见的原因是支原体污染培养基PH不适当，偏酸（＜6.4或偏碱＞7.4均不利最合适的穿刺时间16-20周羊水细胞培养中存在的问题

—羊水细胞培养中存在的问题

——细胞及染色体收获少每天观察细胞生长（梭形细胞背景上有透明透亮的圆形细胞）滚圆的细胞与有丝分裂的圆形细胞鉴别操作应轻柔，胰酶消化法要掌握好胰酶消化的时间羊水中胎脂多时3-5天可轻轻动一动，减少胎脂贴壁占据空间低渗时间短于外周血（一般3-5分钟）羊水细胞培养中存在的问题

—脐带血细胞培养量少于外周血（一般5ml注射器小于14滴）其他同外周血脐带血细胞培养量少于外周血（一般5ml注射器小于14滴）Thanks!Thanks!产前诊断中绒毛、脐血、羊水取样及标本培养南京大学附属鼓楼医院妇产科产前诊断中心李洁副主任医生2006年11月产前诊断中绒毛、脐血、羊水取样及标本培养南京大学附属鼓楼医院产前诊断指征夫妇任一方有染色体异常；曾生育过染色体病患者；夫妇任一方为单基因病患者；曾生育过单基因病患者；有不明原因的自然流产史、畸胎史、死产或新生儿死亡史；产前诊断指征夫妇任一方有染色体异常；产前诊断指征羊水过多的孕妇；夫妇任一方曾接触致畸因素；孕妇年龄大于35岁；有遗传病家族史的近亲婚配的夫妇。产前筛查高风险的孕妇超声胎儿结构筛查胎儿有结构异常的孕妇产前诊断指征羊水过多的孕妇；产前诊断的方法羊膜腔穿刺取样（amniocentesis）绒毛穿刺取样（chorionvillussampling,cvs）脐带血取样（periumbilicalcordbloodsampling,PUBS）植入前诊断（preimplantatongeneticdiagnosis,PGD）产前诊断的方法羊膜腔穿刺取样（amniocentesis）产前诊断的方法胎儿组织取样（皮肤、肝脏）胎儿镜（fetoscope）胚胎镜（embryoscope）胎儿超声波图象（fetalultrasoundimaging）母体外周血胎儿细胞检测（cell-storing）产前诊断的方法胎儿组织取样（皮肤、肝脏）绒毛穿刺取样—历史1975年我国鞍山钢铁公司铁东医院首次问世（经宫颈盲吸法，准确率95%，自然流产率9.3%，出生婴儿未发现异常）莫斯科产科研究所（超声引导下经宫颈吸样）1983您Ward和Brambati分别于英国和意大利发表文章介绍绒毛取样及核型分析绒毛穿刺取样—历史1975年我国鞍山钢铁公司铁东医院首次问绒毛穿刺取样—时间妊娠9—11周绒毛穿刺取样—时间妊娠9—11周绒毛穿刺取样—抽取量20mg左右（染色体核型分析约需10mg，DNA分析约需5mg，生化测定约需5-10mg）绒毛穿刺取样—抽取量20mg左右（染色体核型分析约需10m绒毛穿刺取样—并发症胎儿丢失胎儿肢体发育缺陷（LRD）绒毛穿刺取样—并发症胎儿丢失CVS并发症—胎儿丢失CVS的流产率不比amniocentesis高经宫颈和经腹取样安全性相同（Jackson,1992）多胎取样高于单胎取样（Pergament,1992）CVS并发症—胎儿丢失CVS的流产率不比amniocenteCVS并发症－LRD1999年WHO发布CVS综合性资料认为CVS与LRD无关（216，381例CVS中115例出现LRD发生率1：1881，总的人群发生率1：1642）世界各地相关资料综合，9周以下CVS出现LRD的机会高，但原因尚不清楚CVS不应在小于孕10周的条件下进行CVS并发症－LRD1999年WHO发布CVS综合性资料认为绒毛穿刺取样—方法经宫颈（transcervical）经腹（transabdorminal）绒毛穿刺取样—方法经宫颈（transcervical）CVS方法—经宫颈取样B超采用高分辨的扇扫式或凸阵式实时超声诊断仪，经腹探头频率3.5MHz,经阴道探头频率5-7MHz。采用特制较细的滋养层活检导管（多聚乙烯导管），其塑料导管外径1.4–1.6mm,长20cm,带有导管芯，导管前端稍弯，外形似宫腔探子。导管另一端连接10-20ml含有2-4ml生理盐水的注射器CVS方法—经宫颈取样B超采用高分辨的扇扫式或凸阵式实时超声CVS方法—经腹取样双针活检系统由1根长15cm、外径1.2mm的18号引导套针，及1根长20cm、外径0.8mm的22号活检针组成。在超声引导下，先将引导套针经腹壁及子宫穿刺入胎盘绒毛边缘部分，拔出针芯，然后将活检针经引导套针内送入胎盘绒毛组织,连接含2-4ml生理盐水的20ml注射器，以5ml的负压上下移动活检针吸取绒毛组织CVS方法—经腹取样双针活检系统由1根长15cm、外径1.2CVS注意事项动作要轻柔穿刺部位在胎盘绒毛叶抽吸次数不宜过多CVS注意事项动作要轻柔羊膜腔穿刺—历史1956年Fucks进行羊膜腔穿刺行胎儿性别鉴定及胎儿Rh溶血诊断1966年Marksteele和RoyBreg从羊水中分离出羊水细胞培养成功并行胎儿核型分析羊膜腔穿刺—历史1956年Fucks进行羊膜腔穿刺行胎儿性羊膜腔穿刺—时间16—20周羊膜腔穿刺—时间16—20周羊膜腔穿刺—抽取量20—30ml羊膜腔穿刺—抽取量20—30ml抽取的羊水用途核型分析——诊断染色体病DNA分析——诊断单基因病生化测定——诊断NTD、代谢性疾病抽取的羊水用途核型分析——诊断染色体病羊水穿刺穿刺前孕妇俯卧位摇动腹部超声波定位引导采用22号或21号带芯长腰穿刺针头垂直、快速进针抽取羊水2ml弃置，换空针抽取羊水羊水穿刺羊膜腔穿刺—并发症胎儿丢失羊膜腔感染羊水渗漏穿刺部位的出血、血肿羊膜腔穿刺—并发症胎儿丢失羊穿并发症---胎儿丢失1976年，NihdRegistry报道流产率3.5%1986年，Taboretal报道流产率1.7%1995年，Bombardetal报道流产率1.3%2000年,Antsaklis报道流产率2.1%羊穿并发症---胎儿丢失1976年，NihdRegistr脐带血穿刺—历史1972年，Valenti用儿科膀胱镜在中期妊娠孕妇行子宫切开术插入羊膜腔，获取脐血标本。1979年，Rodeck和Campell应用胎儿镜行脐带血管穿刺，但由于并发症高，应用受到限制。1983年，TernandDaffos超声引导下经皮脐血管穿刺取血（Cordocentesis）脐带血穿刺—历史1972年，Valenti用儿科膀胱镜在中期脐带血穿刺—时间16周—分娩（最佳24—28周）脐带血穿刺—时间16周—分娩（最佳24—28周）脐带血穿刺—取血量3—5ml20周后抽取6—8ml对胎儿循环无不良影响脐带血穿刺—取血量3—5ml脐带血穿刺—适应症胎儿核型分析或基因检测（胎儿畸形、严重的FGR、羊水或绒毛细胞培养失败、羊水或绒毛培养结果为嵌合体、非免疫性胎儿水肿、脆性X综合症等）胎儿血液疾病分析（血型、血小板计数等）胎儿感染（弓形虫、病毒感染等）胎儿情况评估（酸碱平衡、甲功等）遗传性疾病（单基因病、凝血障碍、血红蛋白病、代谢性疾病等）胎儿治疗（宫内输血、宫内药物治疗等）脐带血穿刺—适应症胎儿核型分析或基因检测（胎儿畸形、严重的F脐带血穿刺—并发症穿刺部位的出血脐带血肿短暂性胎心减慢宫内感染胎儿丢失（流产、早产）大多数并发症为短暂性和非致命性脐带血穿刺—并发症穿刺部位的出血脐带血穿刺并发症—胎儿丢失Maxwell1991年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率为1%（1/76）；异常超声者流产率为7%（5/76）；胎儿结构明显异常者流产率为25%（9/36）Antsaklis1998年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率1%（2/191）；异常超声者流产率为13%（11/84）脐带血穿刺并发症—胎儿丢失Maxwell1991年报道胎儿脐带穿刺部位脐带穿刺部位脐血穿刺—确定胎儿血样血红蛋白电泳Kleihauer-Betke试验：胎儿红细胞在酸中稳定APT试验：NaOH中胎儿血为粉红色有核红细胞的出现脐血穿刺—确定胎儿血样血红蛋白电泳脐血穿刺—排除脐血中母血污染X染色体DMD基因内部5对CA重复序列的连锁分析脐血穿刺—排除脐血中母血污染X染色体DMD基因内部5对CA重绒毛组织、羊水细胞、脐血细胞培养绒毛组织、羊水细胞、脐血细胞培养绒毛组织的培养直接法培养法（悬浮培养、贴壁培养）绒毛组织的培养直接法绒毛组织的染色体检查—直接法孕早期Langhan’s细胞有较高的有丝分裂活性，能提供足以分析的良好有丝分裂相，较绒毛培养简易可靠、操作简单快速绒毛组织的染色体检查—直接法孕早期Langhan’s细胞有较绒毛组织的染色体检查—直接法绒毛组织的分离洗脱加秋水仙素（终浓度2ug/ml，可一次加，也可分次少量加）37OC5%CO2培养箱培养45分钟低渗（1%枸橼酸钠低渗10分钟或1%枸橼酸钠和0.075mol/l1：1低渗40分钟）预固定（甲醇：冰醋酸3：1）10分钟固定（甲醇：冰醋酸3：1）10-20分钟冰醋酸解离绒毛细胞（轻吹打）制片绒毛组织的染色体检查—直接法绒毛组织的分离洗脱绒毛组织的染色体检查—悬浮培养法绒毛挑选洗脱绒毛组织剪成小块入培养瓶（25ml培养瓶每瓶10mg）加特定培养液3ml培养3-6天收获（加秋素、低渗、固定、制片）绒毛组织的染色体检查—悬浮培养法绒毛挑选洗脱