基因工程的发展历史分子生物学基础建立期课件

基因工程的工具及方法限制酵素(restrictionenzyme)連接酵素(ligase)載體(vector)宿主(host)1基因工程的工具及方法限制酵素(restrictionenz限制酵素(restrictionenzyme)可從不同來源之DNA製造兩端帶有相同黏合端子(cohesiveend)之核酸序列片段。不同之限制酵素因認定序列(recognitionsite)之不同，分可切製200至數千個核甘酸之DNA，因而容許轉殖具有生物功能（基因）之核酸片段（通常一個基因約有1000個以上核甘酸）。以切割序列含有為七、六、五、四個核甘酸認定序列者，因切割後之DNA片段較大，較為有用。2限制酵素(restrictionenzyme)可從不同來源連接酵素(ligase)假如限制酵素是可切割特定DNA序列之“剪刀”，則連接酵素有如“漿糊”，可用來連接不同來源、不同大小但帶有相同黏合端序列之核酸片段。較常用之連接酵素有E.coliligase及T4ligase。這兩種ligases均可連接有黏合端子之雙股核酸片段，T4ligase更可連接bluntend之核酸片段。通常在基因轉殖之操作裡都使用可產生相同黏合端序列之限制酵素來切割質體及樣品DNA。因使用相同之限制酵素切割之DNA片段都有互補之黏合端序列，故連接酵素就可把質體及樣品DNA片段結合，製成所謂之重組核酸(recombinantDNA)。3連接酵素(ligase)假如限制酵素是可切割特定DNA序列之載體(vector)一個可在生物體中世代相傳，攜帶外來核酸片段之核酸個體。載體DNA的構造應含有的核酸序列：1.在宿主裡複製(replication)DNA之複製子(replicon)序列。2.帶有可供篩選重組核酸之標幟序列，如抗生素抗藥性或產生顏色反應之b-galactosidase等之標幟。3.帶有多種限制酵素切割之區域(multiplerecognitionsites)，以供轉殖不同限制酵素切割之核酸片段。4載體(vector)一個可在生物體中世代相傳，攜帶外來核酸片載體之功能分類具篩選標幟之載體(markervector):如pBR322,pUC等系列載體，都帶有可供迅速篩選之標記；如b-galactosidase,luciferase,抗生素抗藥性等可供迅速篩選重組核酸之標幟。轉運載體(shuttlevector)：如pMAN等載體，帶有能載細菌及動物間作核酸複製及基因表現之雙重功能，故可在不同生物間作基因轉移之操作。核酸序列分析之載體(sequencingvector)：如pUC/m13及pUC/f1，pGEM-3Ef系列載體，因其可製造單股DNA，以供分析核酸序列，或可用已知之primer來迅速作核酸序列分析。表現載體(expressionvector)：如pET,pGEM,pEX等載體，帶有如SP6,T7,T3,lac等優良之啟動子，或帶有兩個不同方向之T7,SP6之啟動子以供基因表現製造蛋白。5載體之功能分類具篩選標幟之載體(markervector)載體之功能分類(continued)特殊功能載體(specialpurposevector)：如pCAT-promoter,pCAT-enhancer可用於分析真菌細胞之加強基因(enhancer)及啟動子之功能。以l為基礎之載體：如lgt系列載體、EMBL系列載體，可供轉殖較大之核酸片段。可利用於植物基因轉移使用之Agrobacter的Tiplasmid等。若欲轉殖之核酸片段在10kb以下,則使用細菌載體(plasmid)，載10kb以上通常使用l系列之載體，若轉殖更大的片段則可使用黏接質體(cosmid)為載體。6載體之功能分類(continued)特殊功能載體(speci宿主(host)包括E.coli,真核細胞之酵母菌(yeast),昆蟲病毒系統(baculoviralsystem)及動物細胞系統(mammaliansystem).E.coli作為宿主之優點為可在很短時間以最便宜之培養基來大量表現基因、製造蛋白，其製造成本最低，其缺點為E.coli缺乏glycosylation等與蛋白活性相關之功能，並且在E.coli內大量產生之蛋白常形成內涵體(inclusionbody)之固體存在，缺乏生理活性，但以E.coli製造出來之製劑亦有：humaninsulin,a-interferon,IL-2.等以yeast製造成功之例子有：HBsAgvaccine,G-CSF等以動物細胞表現成功例子有：EPO,tPA,FactorVIII,FactorVII等7宿主(host)包括E.coli,真核細胞之酵母菌(ye各種使用於基因工程之宿主特點比較8各種使用於基因工程之宿主特點比較8ExpressionofhumaninsulininE.coli9ExpressionofhumaninsulininBacterialproductionofhumangrowthhormone10BacterialproductionofhumanBacterialproductionofhumangrowthhormone(b)11BacterialproductionofhumanProductionofasubunitvaccineinyeast12ProductionofasubunitvaccinSalvagePathway13SalvagePathway13Productionoftissueplasminogenactivator(tPA)14ProductionoftissueplasminogProductionofamonoclonalantibody(MAb)15ProductionofamonoclonalantAbispecificantibody16Abispecificantibody16基因工程之新應用17基因工程之新應用17全球生技藥品市場及成長率18全球生技藥品市場及成長率18生技藥品市場分配份額19生技藥品市場分配份額19不同研發階段之生技藥品20不同研發階段之生技藥品20紅血球生成素(Erythropoietin,EPO)EPO於1906年被發現，是一種醣蛋白荷爾蒙，其功能為調節人體紅血球的形成，它能促進骨髓內的紅血球前驅細胞(Erythroidprogenitorcells)，分化成為功能性的成紅血球細胞(Functionalerythroblasts)。人體內紅血球生成素的製造，有90%以上是由腎臟分泌，其他10%左右，可能由肝臟或血管母細胞瘤(Hemangioblastomas)等地方分泌產生。21紅血球生成素(Erythropoietin,EPO)EPO紅血球生成素之臨床應用RecombinantEPO於1985年即應用於臨床，1989年美國首先應用於治療慢性腎衰竭患者在透析後所引起的貧血。1990年美國首度通過治療AIDS患者使用AZT後所引起的貧血。1995年FDA核准recombinantEPO可用來治療癌症患者的貧血。臨床應用作為人血替代產品。22紅血球生成素之臨床應用RecombinantEPO於198EPO市場概況2005年全球銷售額達100億美元，約佔全球生技藥品市場的1/4強,主要由Amgen,Johnson&Johnson和Roche三家廠商瓜分市場。目前全美約有25萬名洗腎患者，並以每年6~8%的速率成長，在歐洲也有17萬名的洗腎患者，這二個市場為EPO藥品創造了巨大的商機。23EPO市場概況2005年全球銷售額達100億美元，約佔全球生干擾素(Interferons,IFN)1957年兩位美國科學家在研究病毒干擾現象發現了一種抗病毒的特效藥-IFN，它是少數幾種能抵禦病毒的天然防禦物質之一。IFN是一種重要的細胞因子，它是在人體受到病毒感染時，免疫細胞透過抗病毒應答反應，而產生的一組結構類似、功能相近的醣蛋白。IFN具有廣效的抗病毒、抗細胞分裂、免疫調節等多種生物學活性，現唯一種重要的抗病毒、抗腫瘤治療藥物。24干擾素(Interferons,IFN)1957年兩位美國干擾素之生產早期IFN是用病毒或誘導人體細胞產生，先由血液中提取白細胞(leukocyte)，然後用病毒去感染它，使白細胞產生干擾素，其產量每個細胞最多產生100~1,000個干擾素分子，純化後，便可供使用。1980年美國Genentech公司利用基因工程技術改造的大腸桿菌發酵生產，1～2天便可產生20萬個干擾素分子，因此現在大多數採用基因工程大規模工業化生產。25干擾素之生產早期IFN是用病毒或誘導人體細胞產生，先由血液中干擾素之臨床應用干擾素有多種亞型，包括18種,一種,一種和一種。IFN1b 病毒性疾病IFN2a 病毒性疾病，腫瘤IFN2b 病毒性疾病，腫瘤IFN 多發性硬化症IFN 類風濕性關節炎26干擾素之臨床應用干擾素有多種亞型，包括18種,一種,干擾素之市場分析干擾素約佔全球生技藥品市場的17%,銷售額達60億美元以上。PEG－干擾素上市，不僅延長產品的半衰期，且帶給病人更多的便利性。目前主要由Biogen,Schering及Serono三家廠商瓜分市場。27干擾素之市場分析干擾素約佔全球生技藥品市場的17%,銷售額達胰島素(Insulin)Insulin是由胰臟B細胞分泌，可控制血糖的貯存及移動。糖尿病患者正是缺乏適量的胰島素來移出血液中的葡萄糖，而使血糖增高，因此必需注射胰島素來控制血糖的濃度，以解除糖尿現象。28胰島素(Insulin)Insulin是由胰臟B細胞分泌，可胰島素製造方法化學合成法：成本高、過程繁複，只能在實驗室中小量地製造，而沒有真正商業化的推廣價值。動物胰臟萃取法：豬與人類的胰島素只差B30一個氨基酸，牛與人類差三個氨基酸，所以一些動物的胰島素也可以在人身上使用。但是萃取所得不純的胰島素會使病人有過敏反應，因此動物胰島素純化技術是影響市場的重要因素。半合成製造法：將豬B30的Alanine改成Threonine，可將豬胰島素轉換成人類胰島素。遺傳工程製造法。29胰島素製造方法化學合成法：成本高、過程繁複，只能在實驗室中小胰島素市場分析約佔全球生技藥品市場的13.2%。主要廠商為NovoNordisk及Lilly.30胰島素市場分析約佔全球生技藥品市場的13.2%。30單株抗體(monoclonalantibody)1975年Dr.GeorgeKohler及Dr.CesarMilstein發明融合瘤技術，生產單株抗體由單一細胞株(cellline)所製造出來之單一抗體稱之為單株抗體屬於第二代抗體。由於其具有特異性高、親和力強、效價高、血清交叉反應少等優點，已經在基礎研究、臨床診斷及治療、免疫預防等領域發揮了重要作用，在治療上單株抗體主要用於抗腫瘤、抗器官移植排斥反應、抗感染、解毒等。近年來單株抗體與毒素或化學藥物結合設計成目標導向藥物，用於癌症的治療成為近來研究的重點。31單株抗體(monoclonalantibody)1975年單株抗體技術演進老鼠單株抗體技術(Murinemonoclonalantibodies:100%老鼠）。 成功例子：OrthoClone(Johnson&Johnson)在1986年上市用於治療急性腎移植的排斥。為老鼠單株抗體作用於CD3受體。32單株抗體技術演進老鼠單株抗體技術(Murinemonocl單株抗體技術演進老鼠單株抗體技術(Murinemonoclonalantibodies:100%老鼠）。嵌合單株抗體技術(Chimericmonoclonalantibodies:30%老鼠及70%人類）。仿人類單株抗體技術(Humanizedmonoclonalantibodies:5%-10%老鼠和90%-95%人類）人類單株抗體技術(Humanmonoclonalantibodies:100%人類）33單株抗體技術演進老鼠單株抗體技術(Murinemonocl老鼠單株抗體技術(Murinemonoclonalantibodies)成功例子：OrthoClone(Johnson&Johnson)在1986年上市用於治療急性腎移植的排斥。為老鼠單株抗體作用於CD3受體。34老鼠單株抗體技術(Murinemonoclonalant老鼠單株抗體商品化的限制因素在50~80%的人體會產生人類抗老鼠抗體(ahumananti-mouseantibody,HAMA)，往往在尚未發生臨床效能前中和老鼠單株抗體。HAMA反應也會妨礙再用藥，因為第一次使用引發免疫系統確認老鼠單株抗體為外來物質，產生更快更有效率的第二次免疫反應，使第二次使用時效用更短甚至導致過敏性休克(anaphylacticshock)或更嚴重導致死亡。老鼠單株抗體在血中的半衰期過短，不超過20小時，往往未達到治療所需的劑量，就被代謝掉了。老鼠單株抗體的Fc區域並不能完全與人類Fc受體完全結合，無法有效的產生免疫反應。35老鼠單株抗體商品化的限制因素在50~80%的人體會產生人類抗嵌合單株抗體為增加效能並減少HAMA免疫反應，研究人員將老鼠抗體的Fc區域利用基因重組技術導入人類基因，產生嵌合單株抗體，嵌合單株抗體30%是老鼠抗體70%是人類抗體。嵌合單株抗體通常在10例患者中僅有1例產生了嵌合單株抗體的抗體，而且此例患者體內的嵌合單株抗體的功能並沒有降低。1994年Centocor的ReoPro是第一個上市的嵌合單株抗體，商業應用很成功，1997年IDEC/Genentech的Rituxan是另一個非常成功的嵌合抗體，銷售額超過10億美元。36嵌合單株抗體為增加效能並減少HAMA免疫反應，研究人員將老鼠仿人類單株抗體在嵌合單株抗體中，可變區100%都是鼠源的，對人體來說仍有一定的免疫抗原性。如果治療需要多次投藥進行的話，那麼抗體部份就必須採用人類抗體，以避免交叉免疫引起人的抗鼠反應。科學家繼續努力降低單株抗體中老鼠氨基酸的量，將老鼠抗體中CDR的部份移植到人類抗體中，此技術使老鼠氨基酸降到5~10%，稱為仿人類單株抗體。在人體中仍會產生抗體稱為抗仿人類單株抗體抗體(ahumananti-humanizedantibody,HAHA)，但發生機率很低約1~2%。1997年FDA核准第一個仿人類單株抗體產品，Roche/PDL的Zenapax，用於治療腎臟移植引起的排斥。37仿人類單株抗體在嵌合單株抗體中，可變區100%都是鼠源的，對人類單株抗體完全人類單株抗體之優點： 1.不會產生免疫反應，可反覆使用效能不會下降。 2.完全結合很高的親和性，少量的藥產生高的效能。 3.有效程序生產單株抗體，能快速導入臨床試驗。38人類單株抗體完全人類單株抗體之優點：38單株抗體之產品現況全球超過225家公司研發臨床治療單株抗體，預估有1000個產品正在研發中，其中72%進入臨床前試驗，臨床應用以癌症最多佔50%,自體免疫疾病佔18%,感染佔13%,心血管疾病佔6%,器官移植引起的排斥佔5%,其他疾病佔8%,預估到2008年將有70個產品上市，市場銷售將達140億美元。39單株抗體之產品現況全球超過225家公司研發臨床治療單株抗體，血液因子市面上使用的抗凝血蛋白質(anticlottingproteins)可區分為下列三大類：血液稀化劑纖維消化酵素(fibrinolyticenzyme)血栓溶解劑40血液因子市面上使用的抗凝血蛋白質(anticlotting血液稀化劑這類產品適用於避免新鮮血液的凝固，且佔了抗凝血劑大部分的市場。（例如：polysaccharideheparin）41血液稀化劑這類產品適用於避免新鮮血液的凝固，且佔了抗凝血劑大纖維消化酵素局部用於傷口及燙傷部份的擴創作用(debridement)，去除化膿及敗壞的組織。因纖維消化酵素具有纖維消化及蛋白質分解的活性，可分解內部血塊及幫助移除壞死皮膚。42纖維消化酵素局部用於傷口及燙傷部份的擴創作用(debride血栓溶解劑凡是能夠直接分解血塊或加速內生性溶解過程的藥物都可稱為血栓溶解劑，可破壞體內已形成的血塊，產品包括urokinase,streptokinase,tissueplasminogenactivator等。鏈激酶(streptokinase)為衍生自b-溶血性鏈球菌。尿激酶(urokinase)為一種源自人類腎細胞之酵素。組織型胞漿素原活化劑(tissueplasminogenactivator,tPA)是由內皮細胞所分泌的一種serineprotease,能將血液中胞漿素原(plasminogen),轉換成具血栓溶解活性的胞漿素(plasmin),再進一步將纖維蛋白溶解掉。43血栓溶解劑凡是能夠直接分解血塊或加速內生性溶解過程的藥物都可凝血蛋白質(clottingproteins)為能促進血液凝固的蛋白質，除了鈣及維他命K外，凝血蛋白質多為酵素類。第八因子(factorVIII)是目前上市的主要凝血蛋白質藥物，主要來源由人類血液中抽取，用途為控制A型血友病。很多公司試圖開發遺傳工程FactorVIII,大部分公司致力於基因重組，事實上這是一項很艱難的技術，因FactorVIII的分子量很大，而且其組成是完全的醣蛋白，因此其製程很複雜而不易開發。目前主要已上市的公司有Baxter,Bayer,Aventis,NovoNordisk,和AlphaTherapeutics。全球血液因子藥物市場約佔生技藥品市場10.7%。

44凝血蛋白質(clottingproteins)為能促進血液細胞集落刺激因子(colonystimulatingfactor,CSF)在進行造血細胞的體外研究中，發現一些細胞因子可刺激不同的造血幹細胞在半固體培養基中形成細胞群落，這些因子被命名為集落刺激因子。根據他們的作用範圍，分別命名為G-CSF,M-CSF,GM-CSF。不同的CSF對不同發育階段的造血幹細胞和主細胞起促進增值作用，是血細胞發生不可或缺的刺激因子。45細胞集落刺激因子(colonystimulatingfaGranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor(GM-CSF)1977年Burgress等從小鼠肺條件培養液中發現一種能刺激粒細胞和巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。T細胞、B細胞、巨噬細胞、肥大細胞、內皮細胞、成纖維細胞等均可產生GM-CSF。其中T細胞和巨噬細胞一般在免疫應答或炎症介質刺激過程中直接產生；而內皮細胞、成纖維細胞可能通過IL-1和TNF的誘導而產生。GM-CSF主要作用為刺激Stemcell製造Granulocyte及Macrophage，可用於癌症化學治療、放射性治療期間輔助造血劑，治療再生不良性貧血、白血球低下症、骨髓纖維化、免疫缺乏症等。46Granulocyte-macrophagecolonyGranulocytecolonystimulatingfactor(G-CSF)內毒素、TNF-a和IFN-g可活化單核細胞和巨噬細胞產生粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，此外，成纖維細胞、內皮細胞、星狀細胞和骨髓基質細胞等在LPS,IL-1或TNF-a刺激活化後也可分泌G-CSF。GM-CSF作用較廣泛，而G-CSF及M-CSF則作用於血球分裂後期，較具特異性，分別刺激Monocyte及Granulocyte之生成。G-CSF刺激Neutrophils可用於抗細菌、黴菌、寄生蟲之感染。其他用途包括骨髓移植、嚴重燙傷及系統性感染之治療。G-CSF可促進白血球之成熟，預期可用於治療白血病(Leukemia)，亦可用於治療先天性顆粒白血球缺乏症(Congenitalagranulocytosis)。47GranulocytecolonystimulatingMacrophagecolonystimulatingfactor(M-CSF)多種細胞均可產生M-CSF，包括：成纖維細胞、子宮內膜中分泌型上皮細胞、骨髓基質細胞、腦星狀細胞、成骨細胞；LPS等啟動的巨噬細胞、B細胞、T細胞和內皮細胞等。M-CSF可刺激Macrophage的生成，使用於再生不良性貧血(Aplasticanemia)，可刺激Monocyte的轉移。預期用途在於抗癌作用、治療白血病及預防細菌、病毒及寄生蟲的感染，並可用於骨髓移植之復健、抗癌藥物及化學療法之佐劑等。48MacrophagecolonystimulatingCSF市場研發狀況上市公司有： Roche/Amgen(Amgen研發):FilgrastimDaiichi(Amgen研發):FilgrastimAventis(Chugai研發):LenograstimChugai(Chugai研發):LenograstimNovartis(GI,Wyeth研發):MolgramostimGreenCross(GreenCross研發):mirimostim………等CSF約佔全球生技藥品市場的8.2%。49CSF市場研發狀況上市公司有：49生長賀爾蒙(Growthhormone)由腦下垂體分泌刺激身體成長，特別是骨骼的成長，在正常狀況下人體會分泌少量生長賀爾蒙，但在青春期時會大量分泌刺激生長。1985年以前生長賀爾蒙主要由NPA(NationalPituitaryAgency)供應，NPA生產生長賀爾蒙的方法，是由屍體中抽取純化，1985年4月美國FDA禁止由屍體純化的生長賀爾蒙的銷售，因為有四名患者使用該生長賀爾蒙後，受到腦部病毒(Creuz-feld-jacobdiseaseofthebrain)疾病的感染。此時，Genentech之遺傳工程生長賀爾蒙適時開發成功，並獲得核准上市。生長賀爾蒙約佔全球生技藥品市場的5.1%。50生長賀爾蒙(Growthhormone)由腦下垂體分泌刺激5151介白素(Interleukin)淋巴細胞素(Lymphokines)是體內正常免疫系統的一部份，其功能為調節體內的免疫反應。淋巴球(Lymphocytes)則是一種白血球細胞，當病毒、寄生蟲、惡性癌細胞侵入體內時，淋巴球具有調解體內免疫系統以對抗入侵者的功能。淋巴球分為B細胞及T細胞兩類。B細胞能產生抗體(免疫球蛋白)，T細胞能產生淋巴腺素(Lymphokines)並控制B細胞的反應。52介白素(Interleukin)淋巴細胞素(Lymphoki介白素-2(Interleukin-2,IL-2)1976年Morgan等發現小鼠脾細胞培養上清液中含有一種刺激胸腺細胞生長的因子，由於這種因子能促進和維持T細胞長期培養，稱為T細胞生長因子(Tcellgrowthfactor,TCGF),1979年統一命名為介白素-2。可促進T細胞的增殖，破壞惡性細胞(Malignantcell)，對抗病毒感染，並刺激其他淋巴細胞素。在臨床上具有治療癌症的潛力。為目前已上市唯一之介白素，約佔全球生技藥品市場的0.6%。53介白素-2(Interleukin-2,IL-2)197BiotechnologyDrugs

PartI BasicconceptsPartII Process:Quality&SafetyissuesPartIII Achecklistforinspection54BiotechnologyDrugs

PartI BasWhyAreBiotechnologyProductsDifferentFromSimpleOrganicChemicals?SyntheticDrugsSmallmoleculesEasysynthesisAspirinOligopeptidesHemi-synthesisNeedofactivestereo-isomersSteroidsAnticancerAntimetabolitescyclosporinExtractionBiologicalsComplex&raremoleculesAnimalsourcepossibleInsulin HeparinsHumansourcenecessaryHGHCoag.FactorsAlbumin55WhyAreBiotechnologyProductsBiotechDrugsBetteryield&bettersafetyInsulinHGHModifiedmoleculesExtractionimpossibleErythropoietinInterferonInterleukinGrowthfactors56BiotechDrugsBetteryield&beManufacturingProcessesAreDifferentBiotechProductsProducedbypurificationStartingmaterialvariableManyin-processtestsEnd-producttestscomplexProcessisproduct-specificBatchsizessmall(gorkgoffinishedproduct)ConventionaldrugsProducedbyformulationStartingmaterialdefinedFewin-processtestsEnd-producttestssimpleProcessisproducttypespecific(generalizationspossible)57ManufacturingProcessesAreDiBiotechnologyDrugsUseofmicro-organisms(procaryoticoreucaryotic)geneticallymodifiedforproductionofcomplexmoleculesAfterpurification,theproductsareusedinhumanoranimaltherapeutics58BiotechnologyDrugsUseofmicrMedicinalProductsDerivedFromRecombinantDNAInsertionofnaturallyoccurringorsyntheticnucleotidesequenceintoavectorIntroducedintoasuitablehostorganismtoensuretheefficientexpressionofthedesiredgeneproduct59MedicinalProductsDerivedFroFiveFeaturesForaBiotechnologyDrugExpressionsystemofthegeneProductionsystemcompatiblewiththemicroorganismPurificationsystemNatureoftheactiveproductPharmaceuticalformulationandpresentation60FiveFeaturesForaBiotechnolFiveFeaturesForaBiotechnologyDrug

1.ExpressionSystem:Vector+HostIdentify,isolateandclonethegenecodingforthedesiredproteinConstructavectorcontaining:ThegeneTheexpressioncontrols(promoter,secretionsignal…)Insertthevectorintotheselectedmicro-organismEscherichiacoliSaccharomycescerevisiaeMammaliancellsGeneticallymodifiedplants61FiveFeaturesForaBiotechnolExpressionSystem:VectorConstruction+Host62ExpressionSystem:VectorConsFiveFeaturesForaBiotechnologyDrug

2.TheProductionSystemPurposeOptimizesurvivalconditionsforthegeneticallymodifiedmicroorganismSothatitproducesthedesiredproteinWithacceptableyieldMaterials&MethodsSelectionofcellculturemediumSelectionofcultureconditionsSelectionofcultureequipments:fermentor,cytocultor63FiveFeaturesForaBiotechnolFiveFeaturesForaBiotechnologyDrug

3.ThePurificationSystemPurposeextractproteinfromacomplexgrowthmediumAchievecloseto100%purityWithoutalteringtheprotein

Materials&MethodsSequenceofpurificationstepsFiltration/ultrafiltrationPrecipitation/resolubilizationChromatography(ion-exchange,affinity,etc.)64FiveFeaturesForaBiotechnolFiveFeaturesForaBiotechnologyDrug

4.NatureofActiveProductProteinsChainsofamino-acidsSequenceofamino-acidsencodedbygenesFoldedinto3-DconformationToobtainbiologicalactivityHost-dependentpost-translationalmodifications(sugars…)65FiveFeaturesForaBiotechnolFiveFeaturesForaBiotechnologyDrug

5.PharmaceuticalFormulationandPresentationPurposeMaintainbiologicalactivityBymaintainingactiveproteinconformationinsolutionMaterials&MethodsStabilization(albumin,glycerol)Storageatlowtemperature66FiveFeaturesForaBiotechnolBiotechnologyDrugs

PartI BasicconceptsPartII Process:Quality&SafetyissuesPartIII Achecklistforinspection67BiotechnologyDrugs

PartI BasProcessFlow-ChartHarvestPurificationPharmaceuticalfinishingStartingmaterialFermentation-culture68ProcessFlow-ChartHarvestPurifACellBankAcollectionofampoulesofuniformcompositionstoredunderdefinedconditions,eachcontaininganaliquotofasinglepoolofcells69ACellBankAcollectionofampTheMasterCellBank(MCB)Generallyderivedfromtheselectedcellclonecontainingtheexpressionconstruct.TheMCBisusedtoderiveallworkingcellbanks.70TheMasterCellBank(MCB)GeneTheManufacturerWorkingCellBank(MWCB)DerivedbyexpansionofoneormoreampoulesoftheMCBunderdefinedcultureconditionsTheworkingcellbankisusedfortheproductionofthebatches.71TheManufacturerWorkingCellTheLateExpandedCellBank(LECB)Obtainedinmultiplyingthecellsusedfortheproductionoftherecombinantprotein,severalpassageafterthepassageofproduction.Itisusedtorevealapotentiallowviralcontaminationandtostudygeneticstabilityofthetransgene.72TheLateExpandedCellBank(LCellBankSystemStartingmaterialParentalcelllineMastercellbank(MCB)Manufacturerworkingcellbank(MWCB)ProductionsubstrateLateexpandedcellbank(LECB)Genetictransformationexpandexpandexpand73CellBankSystemStartingParentCellBankSystem74CellBankSystem74ProcessFlow-ChartStartingmaterialFermentation-cultureVariousexpansionsystems(fermentor,rollerbottle,fermentingflasks,Cellculturesystems,airlift,hollowfiberVariousculturemedia(totallysyntheticorcontainingcomponentsofanimalorigin)75ProcessFlow-ChartStartingFermProcessFlow-ChartHarvestStartingmaterialFermentation-cultureDiscontinuousproductionsystem(fromfermentor)Continuousproductionsystem(severalharvestsofculturesupernatant)76ProcessFlow-ChartHarvestStartProcessFlow-ChartHarvestPurificationStartingmaterialFermentation-cultureVariousextractionstrategies(fromsupernatantorcelldisruption)Variouspurificationmethods(accordingtopotentialcontaminants)77ProcessFlow-ChartHarvestPurifPurification:PotentialContaminantsWhatcontaminantsmaybeencountered?Whatisthesourceofthecontamination?Howhazardousarethey?Howcantheyberemoved?Howcanweensuretheirremoval?78Purification:PotentialContamPurification:PotentialContaminantsProcess-relatedimpuritiesCellsubstratederivedCellculturederivedDownstreamderivedProduct-relatedimpuritiesTruncatedformsOthermodifiedformsaggregates79Purification:PotentialContamPurification:PotentialContaminantsMicrobiologicalcontaminants:adventitiousagentsPreventintheoriginalcellsorinthemastercellbankAdventitiousvirusesintroducedduringproduction80Purification:PotentialContamPurification:PotentialContaminantsHazards:ToxicityHeavymetals,cyanogenbromide,antibiotics,organicsolvents…AlteredpharmacologicalactivityAggregates,breakdownproductsImmunogenicityOncogenicityInfectiousdiseasesMycoplasmas,yeasts,viruses81Purification:PotentialContamPurification:ContaminantRemovalAsequenceofseveralmethods:PrecipitationFiltrationLiquidchromatographybasedondifferentphysicalorchemicalprinciplesAffinity,hydrophobicity,molecularweight,electricalcharge…82Purification:ContaminantRemoBiotechnologyDrugs

PartI BasicconceptsPartII Process:Quality&SafetyissuesPartIII Achecklistforinspection83BiotechnologyDrugs

PartI BasPurificationSystemShouldBe:AppropriateJustifiedValidated84PurificationSystemShouldBe:ProcessFlow-ChartHarvestPurificationPharmaceuticalfinishingStartingmaterialFermentation-cultureStabilization(accordingtoproteinanddeliverymode)Storge85ProcessFlow-ChartHarvestPurifAChecklistForInspectionFocusonchangesinthemanufacturingprocessDonotclassifyaprioriachangeintheprocessasminorormajorConsiderthepotentialconsequencesonthedrugproductintermsof:QualitySafetyEfficacy86AChecklistForInspectionFocuChangesIntheManufacturingProcessMainreasonsforintroducingchangesImprovementofproductqualityIncreaseofproductionyieldGlobalproductivityCostsavingsProductionscale-upNewproductionsites87ChangesIntheManufacturingPAChecklistForInspection1.Cellbanksystem2.Fermentation/cultureprocess3.Purificationprocess4.Drugsubstance5.Formulatingandfilling6.Drugproduct88AChecklistForInspection1.CeIssuesForInspection:

1.CellBankSystemGMPcompliantplantdesignDocumentationofcelloriginSetupconditionsforthe(Master),(working)and(lateexpanded)cellbanks:DocumentationofviralsafetyDocumentationofexpansionconditionsStorageconditionsMeasurestakenagainstcontamination89IssuesForInspection:

1.CellIssuesForInspection:

2.Fermentation/CultureProcessStartingmaterial(cells)NewsupplierSpecificationsAdditions/substitutionofnewmaterialCellcultureconditionspH,oxygen,temperature,time,%ofreagents,formulationofculturemedia…Scaleoffermentation/cellculturemodeEquipmentChangeofadditionalfermentationsiteorfacility90IssuesForInspection:

2.FermeIssuesForInspection:

3.PurificationProcessColumn/resinchangeSizeofcolumn,supplier,cleaningconditions,storageconditionsReagentsNewsupplier,specifications,replacementofrawmaterialPurificationprotocolsAddition/substitution/eliminationofspecificstepsScaleofthedownstreamprocessingequipment91IssuesForInspection:

3.PurifIssuesForInspection:

4.DrugSubstance(activeprinciple)BatchdefinitionStorageconditionsPoolingstrategy92IssuesForInspection:

4.DrugIssuesForInspection:

5.FormulatingandFillingExcipientEquipmentManufacturingprocessScaleChangeofsite/facilityStorage&shippingconditions93IssuesForInspection:

5.FormuIssuesForInspection:

6.DrugProduct(finalproduct)Controlof:IdentityPurityActivityStabilityGeneralsafetySterilitypyrogenicity94IssuesForInspection:

6.DrugIssuesForInspection:

SummaryCleanstartingmaterialWell-characterizedcell-line(cellbank)systemValidatedproduction&purificationprocessed(In-process)controlsSpecificfinalproductstestingCompliancetoGMPs95IssuesForInspection:

SummaryConclusionThegrowingnumberofbiotechnologyproductsrequireshighlyskilledprofessionalstoinspectcomplexandchangingproductionprocesses96ConclusionThegrowingnumbero基因工程的工具及方法限制酵素(restrictionenzyme)連接酵素(ligase)載體(vector)宿主(host)97基因工程的工具及方法限制酵素(restrictionenz限制酵素(restrictionenzyme)可從不同來源之DNA製造兩端帶有相同黏合端子(cohesiveend)之核酸序列片段。不同之限制酵素因認定序列(recognitionsite)之不同，分可切製200至數千個核甘酸之DNA，因而容許轉殖具有生物功能（基因）之核酸片段（通常一個基因約有1000個以上核甘酸）。以切割序列含有為七、六、五、四個核甘酸認定序列者，因切割後之DNA片段較大，較為有用。98限制酵素(restrictionenzyme)可從不同來源連接酵素(ligase)假如限制酵素是可切割特定DNA序列之“剪刀”，則連接酵素有如“漿糊”，可用來連接不同來源、不同大小但帶有相同黏合端序列之核酸片段。較常用之連接酵素有E.coliligase及T4ligase。這兩種ligases均可連接有黏合端子之雙股核酸片段，T4ligase更可連接bluntend之核酸片段。通常在基因轉殖之操作裡都使用可產生相同黏合端序列之限制酵素來切割質體及樣品DNA。因使用相同之限制酵素切割之DNA片段都有互補之黏合端序列，故連接酵素就可把質體及樣品DNA片段結合，製成所謂之重組核酸(recombinantDNA)。99連接酵素(ligase)假如限制酵素是可切割特定DNA序列之載體(vector)一個可在生物體中世代相傳，攜帶外來核酸片段之核酸個體。載體DNA的構造應含有的核酸序列：1.在宿主裡複製(replication)DNA之複製子(replicon)序列。2.帶有可供篩選重組核酸之標幟序列，如抗生素抗藥性或產生顏色反應之b-galactosidase等之標幟。3.帶有多種限制酵素切割之區域(multiplerecognitionsites)，以供轉殖不同限制酵素切割之核酸片段。100載體(vector)一個可在生物體中世代相傳，攜帶外來核酸片載體之功能分類具篩選標幟之載體(markervector):如pBR322,pUC等系列載體，都帶有可供迅速篩選之標記；如b-galactosidase,luciferase,抗生素抗藥性等可供迅速篩選重組核酸之標幟。轉運載體(shuttlevector)：如pMAN等載體，帶有能載細菌及動物間作核酸複製及基因表現之雙重功能，故可在不同生物間作基因轉移之操作。核酸序列分析之載體(sequencingvector)：如pUC/m13及pUC/f1，pGEM-3Ef系列載體，因其可製造單股DNA，以供分析核酸序列，或可用已知之primer來迅速作核酸序列分析。表現載體(expressionvector)：如pET,pGEM,pEX等載體，帶有如SP6,T7,T3,lac等優良之啟動子，或帶有兩個不同方向之T7,SP6之啟動子以供基因表現製造蛋白。101載體之功能分類具篩選標幟之載體(markervector)載體之功能分類(continued)特殊功能載體(specialpurposevector)：如pCAT-promoter,pCAT-enhancer可用於分析真菌細胞之加強基因(enhancer)及啟動子之功能。以l為基礎之載體：如lgt系列載體、EMBL系列載體，可供轉殖較大之核酸片段。可利用於植物基因轉移使用之Agrobacter的Tiplasmid等。若欲轉殖之核酸片段在10kb以下,則使用細菌載體(plasmid)，載10kb以上通常使用l系列之載體，若轉殖更大的片段則可使用黏接質體(cosmid)為載體。102載體之功能分類(continued)特殊功能載體(speci宿主(host)包括E.coli,真核細胞之酵母菌(yeast),昆蟲病毒系統(baculoviralsystem)及動物細胞系統(mammaliansystem).E.coli作為宿主之優點為可在很短時間以最便宜之培養基來大量表現基因、製造蛋白，其製造成本最低，其缺點為E.coli缺乏glycosylation等與蛋白活性相關之功能，並且在E.coli內大量產生之蛋白常形成內涵體(inclusionbody)之固體存在，缺乏生理活性，但以E.coli製造出來之製劑亦有：humaninsulin,a-interferon,IL-2.等以yeast製造成功之例子有：HBsAgvaccine,G-CSF等以動物細胞表現成功例子有：EPO,tPA,FactorVIII,FactorVII等103宿主(host)包括E.coli,真核細胞之酵母菌(ye各種使用於基因工程之宿主特點比較104各種使用於基因工程之宿主特點比較8ExpressionofhumaninsulininE.coli105ExpressionofhumaninsulininBacterialproductionofhumangrowthhormone106BacterialproductionofhumanBacterialproductionofhumangrowthhormone(b)107BacterialproductionofhumanProductionofasubunitvaccineinyeast108ProductionofasubunitvaccinSalvagePathway109SalvagePathway13Productionoftissueplasminogenactivator(tPA)110ProductionoftissueplasminogProductionofamonoclonalantibody(MAb)111ProductionofamonoclonalantAbispecificantibody112Abispecificantibody16基因工程之新應用113基因工程之新應用17全球生技藥品市場及成長率114全球生技藥品市場及成長率18生技藥品市場分配份額115生技藥品市場分配份額19不同研發階段之生技藥品116不同研發階段之生技藥品20紅血球生成素(Erythropoietin,EPO)EPO於1906年被發現，是一種醣蛋白荷爾蒙，其功能為調節人體紅血球的形成，它能促進骨髓內的紅血球前驅細胞(Erythroidprogenitorcells)，分化成為功能性的成紅血球細胞(Functionalerythroblasts)。人體內紅血球生成素的製造，有90%以上是由腎臟分泌，其他10%左右，可能由肝臟或血管母細胞瘤(Hemangioblastomas)等地方分泌產生。117紅血球生成素(Erythropoietin,EPO)EPO紅血球生成素之臨床應用RecombinantEPO於1985年即應用於臨床，1989年美國首先應用於治療慢性腎衰竭患者在透析後所引起的貧血。1990年美國首度通過治療AIDS患者使用AZT後所引起的貧血。1995年FDA核准recombinantEPO可用來治療癌症患者的貧血。臨床應用作為人血替代產品。118紅血球生成素之臨床應用RecombinantEPO於198EPO市場概況2005年全球銷售額達100億美元，約佔全球生技藥品市場的1/4強,主要由Amgen,Johnson&Johnson和Roche三家廠商瓜分市場。目前全美約有25萬名洗腎患者，並以每年6~8%的速率成長，在歐洲也有17萬名的洗腎患者，這二個市場為EPO藥品創造了巨大的商機。119EPO市場概況2005年全球銷售額達100億美元，約佔全球生干擾素(Interferons,IFN)1957年兩位美國科學家在研究病毒干擾現象發現了一種抗病毒的特效藥-IFN，它是少數幾種能抵禦病毒的天然防禦物質之一。IFN是一種重要的細胞因子，它是在人體受到病毒感染時，免疫細胞透過抗病毒應答反應，而產生的一組結構類似、功能相近的醣蛋白。IFN具有廣效的抗病毒、抗細胞分裂、免疫調節等多種生物學活性，現唯一種重要的抗病毒、抗腫瘤治療藥物。120干擾素(Interferons,IFN)1957年兩位美國干擾素之生產早期IFN是用病毒或誘導人體細胞產生，先由血液中提取白細胞(leukocyte)，然後用病毒去感染它，使白細胞產生干擾素，其產量每個細胞最多產生100~1,000個干擾素分子，純化後，便可供使用。1980年美國Genentech公司利用基因工程技術改造的大腸桿菌發酵生產，1～2天便可產生20萬個干擾素分子，因此現在大多數採用基因工程大規模工業化生產。121干擾素之生產早期IFN是用病毒或誘導人體細胞產生，先由血液中干擾素之臨床應用干擾素有多種亞型，包括18種,一種,一種和一種。IFN1b 病毒性疾病IFN2a 病毒性疾病，腫瘤IFN2b 病毒性疾病，腫瘤IFN 多發性硬化症IFN 類風濕性關節炎122干擾素之臨床應用干擾素有多種亞型，包括18種,一種,干擾素之市場分析干擾素約佔全球生技藥品市場的17%,銷售額達60億美元以上。PEG－干擾素上市，不僅延長產品的半衰期，且帶給病人更多的便利性。目前主要由Biogen,Schering及Serono三家廠商瓜分市場。123干擾素之市場分析干擾素約佔全球生技藥品市場的17%,銷售額達胰島素(Insulin)Insulin是由胰臟B細胞分泌，可控制血糖的貯存及移動。糖尿病患者正是缺乏適量的胰島素來移出血液中的葡萄糖，而使血糖增高，因此必需注射胰島素來控制血糖的濃度，以解除糖尿現象。124胰島素(Insulin)Insulin是由胰臟B細胞分泌，可胰島素製造方法化學合成法：成本高、過程繁複，只能在實驗室中小量地製造，而沒有真正商業化的推廣價值。動物胰臟萃取法：豬與人類的胰島素只差B30一個氨基酸，牛與人類差三個氨基酸，所以一些動物的胰島素也可以在人身上使用。但是萃取所得不純的胰島素會使病人有過敏反應，因此動物胰島素純化技術是影響市場的重要因素。半合成製造法：將豬B30的Alanine改成Threonine，可將豬胰島素轉換成人類胰島素。遺傳工程製造法。125胰島素製造方法化學合成法：成本高、過程繁複，只能在實驗室中小胰島素市場分析約佔全球生技藥品市場的13.2%。主要廠商為NovoNordisk及Lilly.126胰島素市場分析約佔全球生技藥品市場的13.2%。30單株抗體(monoclonalantibody)1975年Dr.GeorgeKohler及Dr.CesarMilstein發明融合瘤技術，生產單株抗體由單一細胞株(cellline)所製造出來之單一抗體稱之為單株抗體屬於第二代抗體。由於其具有特異性高、親和力強、效價高、血清交叉反應少等優點，已經在基礎研究、臨床診斷及治療、免疫預防等領域發揮了重要作用，在治療上單株抗體主要用於抗腫瘤、抗器官移植排斥反應、抗感染、解毒等。近年來單株抗體與毒素或化學藥物結合設計成目標導向藥物，用於癌症的治療成為近來研究的重點。127單株抗體(monoclonalantibody)1975年單株抗體技術演進老鼠單株抗體技術(Murinemonoclonalantibodies:100%老鼠）。 成功例子：OrthoClone(Johnson&Johnson)在1986年上市用於治療急性腎移植的排斥。為老鼠單株抗體作用於CD3受體。128單株抗體技術演進老鼠單株抗體技術(Murinemonocl單株抗體技術演進老鼠單株抗體技術(Murinemonoclonalantibodies:100%老鼠）。嵌合單株抗體技術(Chimericmonoclonalantibodies:30%老鼠及70%人類）。仿人類單株抗體技術(Humanizedmonoclonalantibodies:5%-10%老鼠和90%-95%人類）人類單株抗體技術(Humanmonoclonalantibodies:100%人類）129單株抗體技術演進老鼠單株抗體技術(Murinemonocl老鼠單株抗體技術(Murinemonoclonalantibodies)成功例子：OrthoClone(Johnson&Johnson)在1986年上市用於治療急性腎移植的排斥。為老鼠單株抗體作用於CD3受體。130老鼠單株抗體技術(Murinemonoclonalant老鼠單株抗體商品化的限制因素在50~80%的人體會產生人類抗老鼠抗體(ahumananti-mouseantibody,HAMA)，往往在尚未發生臨床效能前中和老鼠單株抗體。HAMA反應也會妨礙再用藥，因為第一次使用引發免疫系統確認老鼠單株抗體為外來物質，產生更快更有效率的第二次免疫反應，使第二次使用時效用更短甚至導致過敏性休克(anaphylacticshock)或更嚴重導致死亡。老鼠單株抗體在血中的半衰期過短，不超過20小時，往往未達到治療所需的劑量，就被代謝掉了。老鼠單株抗體的Fc區域並不能完全與人類Fc受體完全結合，無法有效的產生免疫反應。131老鼠單株抗體商品化的限制因素在50~80%的人體會產生人類抗嵌合單株抗體為增加效能並減少HAMA免疫反應，研究人員將老鼠抗體的Fc區域利用基因重組技術導入人類基因，產生嵌合單株抗體，嵌合單株抗體30%是老鼠抗體70%是人類抗體。嵌合單株抗體通常在10例患者中僅有1例產生了嵌合單株抗體的抗體，而且此例患者體內的嵌合單株抗體的功能並沒有降低。1994年Centocor的ReoPro是第一個上市的嵌合單株抗體，商業應用很成功，1997年IDEC/Genentech的Rituxan是另一個非常成功的嵌合抗體，銷售額超過10億美元。132嵌合單株抗體為增加效能並減少HAMA免疫反應，研究人員將老鼠仿人類單株抗體在嵌合單株抗體中，可變區100%都是鼠源的，對人體來說仍有一定的免疫抗原性。如果治療需要多次投藥進行的話，那麼抗體部份就必須採用人類抗體，以避免交叉免疫引起人的抗鼠反應。科學家繼續努力降低單株抗體中老鼠氨基酸的量，將老鼠抗體中CDR的部份移植到人類抗體中，此技術使老鼠氨基酸降到5~10%，稱為仿人類單株抗體。在人體中仍會產生抗體稱為抗仿人類單株抗體抗體(ahumananti-humanizedantibody,HAHA)，但發生機率很低約1~2%。19