预防-卫生化学高效液相

第十四章高效液相色谱法第一节

概

述

高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography,HPLC）又称高压液相色谱法，是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论，于20世纪60年代末迅速发展起来的一种新型分离分析技术。

高效液相色谱法以经典液相色谱法为基础，但又不同于经典液相色谱法。与经典液相色谱法相比较，高效液相色谱法的优点是高效、高速、高灵敏度、高自动化。

高效是指分离效率高，由于它使用各种新型键合固定相，且固定相颗粒极细、更均匀，使柱效可达每米105理论塔板数；

高速指流动相流动速度快、分析速度快，由于采用高压泵输送流动相，使流动相流速最高可达10ml/min，且一般分离分析几分钟或几十分钟就能完成；

高灵敏度是指借助紫外、荧光、电化学及质谱等高灵敏度检测器，可以检测到的最低组分含量为10-9～10-11g；

高自动化是指依靠仪器配备的微机系统，不仅可以自动采集和处理数据，而且可以优化选择和控制分离操作条件。

高效液相色谱法是在气相色谱法的理论和实验技术基础上发展起来的，与气相色谱法相比较，它的突出优点是应用范围广。

高效液相色谱法不受样品挥发性和热稳定性的影响，只要把样品制成溶液便可进行分析，特别是一些生物大分子例如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、脂类、维生素等，都可应用高效液相色谱法进行分析测定。

气相色谱法采用的流动相是惰性气体，仅起载带作用，而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，参与对组分的分配作用，使分离效率提高。此外，高效液相色谱法分离分析后的样品馏分易于收集。高效液相色谱法的缺点是仪器复杂、价格昂贵，并且使用有机溶剂，不仅使用费用较高，而且对人体健康有害、对环境有污染。第二节

高效液相色谱仪

高效液相色谱仪依据其性能和用途不同可分为分析型、制备型和专用型三类。同样由五大部分组成：另外，还配有辅助装置，如梯度洗脱装置，自动进样装置等，如图

高压输液系统进样系统分离系统检测系统记录和数据处理系统压力表贮液器高压泵图1高效液相色谱仪结构示意图记录仪检测器色谱柱进样器馏分收集器梯度洗脱装置一、高压输液系统

高压输液系统一般由贮液器、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻尼器等组成，其中高压输液泵是高效液相色谱仪的核心部件。高压输液泵（highpressurepump）高压输液泵的作用是提供动力，以便流动相被连续不断的送入色谱柱。高效液相色谱使用的色谱固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，如果没有足够的动力，流动相很难较快流动。一个好的高压输液泵应符合下列要求：

（1）密封性好，耐腐蚀；（2）有足够的输出压力，使流动相能顺利通过色谱柱，其压力范围通常为30~50Mpa；（3）输出压力平稳，脉冲小；（4）输出流量恒定，可调范围宽，其流量精度在1%~2%之间；（5）泵室体积小（＜0.5ml），易于清洗，便于迅速更换溶剂。

高压输液泵分为恒流泵和恒压泵。恒流泵输出流量恒定，不受色谱柱阻力和流动相粘度等的影响。恒压泵输出压力恒定，而流量则随色谱系统阻力的变化而变化，因此保留时间的重现性差。另外，更换恒压泵的溶剂或对其进行清洗均较麻烦。已逐步被恒流泵取代。恒流泵分为柱塞往复泵和螺旋注射泵。目前高效液相色谱仪广泛使用的是柱塞往复泵。这种泵的泵室体积小，一般只有几毫升，易于清洗和更换溶剂，适合于梯度洗脱操作。缺点是输出液流脉动大，需要外加脉动阻尼器。其结构如图123654电动机87图柱塞往复泵示意图转动凸轮2.柱塞3.密封垫4.出口单向阀5.入口单向阀6.液缸7.流动相入口8.流动相出口二、进样系统

高效液相色谱法对进样要求较严。进样方式有注射器和六通阀两种。前者与气相色谱法类似，此法的缺点是隔膜的穿刺部分在高压情况下容易漏液，而且进样量有限，重现性差，有时需停泵进样。目前普遍采用的进样方式是六通阀进样，如图24531143装样进样图六通阀进样示意图66进样口2.定量管3.流动相入口4.色谱柱5.可转动阀芯6.废液口

此法的优点是进样时可保持系统的高压，进样方式简便、易操作，而且由于进样量可由定量管的体积严格控制，进样准确，重现性好，自动化程度高，适于作定量分析。三、分离系统

分离系统包括色谱柱、恒温器及连接管等。色谱柱是高效液相色谱仪的心脏部件，由柱管和固定相组成。柱管多采用耐高压、耐腐蚀的不锈钢管制成，且管内壁要求光洁度很高，否则会引起柱效降低。色谱柱分为分析型和制备型两类。

分析型色谱柱长50～300mm，内径1～5mm，固定相粒径2.5～10μm柱子通常是直型的，以利于装填和提高柱效。

制备型色谱柱长50～500mm，内径10～50mm,固定相粒径5～10μm。为了保持色谱柱的性能，通常在分析柱前要使用一个短的保护柱。一般保护柱内填充物应与分析柱中的固定相一致，这样不仅可以将样品和流动相中的有害污染物被保留，延长柱子的寿命，而且在液液色谱中，还可以使洗脱液在经过保护柱时就被固定相饱和，使分析柱内不产生固定液流失。HPLC常在室温下进行，但由于柱温能显著影响组分的保留值，所以近年来生产的仪器一般都配备恒温器（柱温箱），以保证分析时温度恒定。

现在国内外许多公司都有商品柱出售，可根据分析要求选购。四、检测系统HPLC检测器的种类很多，按其应用范围分为通用型和专用型（选择性）检测器两大类。通用型检测器是连续地测量流出物（包括溶质和溶剂）总体特性变化的检测器。这类检测器测量的是任何液体都共有的物理量，所以应用范围广。但由于它对溶剂本身有响应，因此易受温度变化、流量波动等因素的影响，造成较大的噪声和漂移，灵敏度较低，不适于痕量分析，并且不能用于梯度洗脱。属于这类检测器的有示差折光检测器等。专用型检测器是仅对分离组分的物理或物理化学特性有选择性响应，又称溶质性质检测器，属于这类检测器的有紫外、荧光检测器等。因为这类检测器仅对某些被测的物质响应灵敏，而对流动相本身没有响应或响应很小，所以灵敏度高，受外界影响小，并且可用于梯度洗脱。１．紫外-可见检测器（ultraviolet-visibledetectorUVD或UV）

紫外检测器是高效液相色谱仪应用最广泛的检测器，用于检测对紫外及可见光有吸收的物质。在高效液相色谱分析中，大约80％的样品可以使用这种检测器。紫外检测器的工作原理和结构与一般的紫外分光光度计一样，所不同是将样品池改为体积很小（5～12µl）的流通池（如图所示），以对色谱流出样品进行连续检测。11223光路Z型H型

紫外检测器可分为固定波长型、可调波长型和二极管阵列检测器。

固定波长型紫外检测器一般以低压汞灯作光源，检测波长固定在254nm或280nm，许多有机官能团可吸收这些波长，可用此检测器进行分析。此类检测器光学系统结构简单，但灵敏度和应用范围受限。

可调波长型紫外可见检测器是以钨灯和氘灯作为光源，检测波长从190～800nm连续可调，样品可以选择在最大吸收波长处进行检测，灵敏度高。因此，该类检测器应用广泛。需要注意的是所使用的流动相溶剂在测定波长下应无吸收。

二极管阵列检测器特点是对整个紫外—可见光谱区波长同时进行检测，获得三维的色谱——光谱图形，对每一个色谱峰都给出光谱定性信息。如图。YXZ

吸光度波长时间光谱平面色谱平面图

三维色谱－光谱图紫外检测器的特点是：①灵敏度高，最小检测浓度为10-10g/ml，可准确方便地进行定量分析；②线性范围宽；③对温度和流动相流速波动不敏感，可用于梯度洗脱；④应用范围广泛。2.荧光检测器（fluorescencedetectorFD）

可对具有荧光特性的样品定量检测。其特点：灵敏度更高，比紫外检测器高3～4个数量级，检测限可达10-12～10-14g/ml；对温度和流动相流速的变化不敏感；可以进行梯度洗脱。3.电化学检测器（electrochemicaldetectorED）

电化学检测器种类较多，有电导、库仑、极谱、安培、电位等检测器。常用的是安培检测器，它是一种选择性检测器，是利用组分在氧化还原反应过程中产生的电流来对样品进行检测。4.蒸发光散射检测器（electrochemicaldetectorED）通用型检测器它是利用在一定条件下基体粒子的数量不变，光散射强度正比于由溶质浓度决定的粒子数目而进行测量的。将流出色谱柱的组分及流动相引入已通气体（N2或空气）的蒸发室，加热除去流动相。4.蒸发光散射检测器（electrochemicaldetectorED）样品组分在蒸发室形成气溶胶，然后进入检测室。用强光或激光照射气溶胶产生丁铎尔效应，测定光强度而获得组分的浓度信号。主要用于糖类、高分子化合物、糖苷等的测定。5.

示差折光检测器（differentialreflactiveindexdetectorDRID）

示差折光检测器是利用纯流动相和含有被测组分的流动相之间折光率的差别进行检测的。它操作简便，灵敏度不高，是一种通用型检测器。主要缺点是对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。五、辅助装置

脱气、梯度洗脱、恒温、自动进样、馏分收集等装置均为辅助装置。其中梯度洗脱装置是高效液相色谱仪中最重要的辅助装置。

梯度洗脱（gradientelution）对于一些组分复杂或容量因子k范围很宽的样品的分离尤为重要。梯度洗脱是在分离过程中，按一定程序不断改变流动相的配比，使溶剂极性、离子强度或pH值改变，从而改进复杂样品的分离，改善峰形、缩短分析时间，以提高分离效率。

梯度洗脱装置分低压梯度洗脱装置和高压梯度洗脱装置。

低压梯度洗脱装置结构简单，只需一台高压泵，它是在常压下将不同溶剂按一定比例混合，然后通过高压泵，将混合后的流动相送入色谱柱中。其缺点是不便改变流动相的配比，溶剂消耗量大，自动化程度低。

高压梯度洗脱装置一般采用二台或多台高压泵，按设定的流量比例将各种溶剂送入混合室，在高压下进行混合，然后进入色谱柱。其优点是能得到任意形式的梯度曲线，梯度重复性和精度高，自动化程度高。但需要多台泵，仪器造价也高。第三节

HPLC的固定相和流动相

一、固定相

色谱分离的关键部分是色谱柱中的固定相，高效液相色谱按分离机理可分为吸附、分配、离子交换、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法和手性色谱。不同类型的高效液相色谱所用的固定相各不相同。

液固色谱所使用的固定相多数是有吸附活性的吸附剂，如常用的硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。按其结构可分为表面多孔型和全多孔微粒型两类，如图。（一）液－固吸附色谱固定相1～2m玻璃核30m5m表面多孔型全多孔微粒型图两种类型固定相示意图

1．表面多孔型又称薄壳型，这种固定相是在直径约为30m的实心玻璃微球表面涂一层很薄（约1～2m）的多孔色谱材料（如硅胶、氧化铝等）烧结制成的。其特点是：传质速度快、填充紧密均匀、渗透性好、柱效高。但由于比表面积小，柱容量少、进样量小，因此需要高灵敏度的检测器。2.全多孔微粒型它是一种颗粒直径很小（一般为2.5～10m）且形态不一（无定型或球型）的色谱柱填料。具有粒度小、比表面积大、孔穴浅、柱效高、容量大等优点，特别适合复杂混合物分离及痕量分析。目前高效液相色谱法大多采用直径3～5m的球型填料。（二）液-液分配色谱法固定相液-液分配色谱的固定相由固定液和担体组成。早期的固定相为机械涂层固定相，是将固定液机械地涂渍在全多孔微粒型和表面多孔型载体上,这样涂渍的固定液极易溶解于流动相中，造成固定液流失，进一步导致色谱柱上保留行为的改变及引起分离样品的污染。

为了解决固定液流失的问题，改善固定相的功能，人们用化学方法把有机分子键合到载体或硅胶表面，形成化学键合固定相。

用来制备化学键合固定相的载体，几乎都是硅胶。按基团与硅胶相结合的化学键类型，分为酯化型（Si—O—C）和硅烷化型（Si—O—Si—C）等。酯化型是最先用于液相色谱的键合固定相，醇与硅羟基（Si—OH）直接进行酯化反应，生成具有Si—O—C键的固定相。反应式为这类键合固定相具有良好的传质特性，但易水解、醇解、热稳定性差，因此仅适用于使用不含水或醇、极性小的流动相，来分离极性化合物。

硅烷化型是利用氯硅烷与硅羟基进行硅烷化反应，生成具有Si—O—Si—C键的固定相。制备反应如下：

这类键合固定相具有热稳定性好，不易吸水，耐有机溶剂等优点。能在70℃、pH2～8.5范围内正常工作，应用范围广泛。

按有机基团的性质，可分为极性、非极性和离子交换键合相等几类。1.极性键合相硅胶表面键合极性有机基团的称为极性键合相，因常使用比键合相本身极性小的流动相冲洗，故也叫正相键合相。2.非极性键合相硅胶表面键合烃基硅烷，所得到的就是非极性键合相。非极性键合相通常用于反相色谱，亦称为反相键合相。其烷基配基可以是不同链长的正构烷烃或苯基，其中以含十八个碳原子的烷基键合物（即C18简称ODS）应用最广泛。化学键合固定相的优点是：①传质速度比一般液体固定相快得多，因此柱效高；②固定液不流失，从而增加了色谱柱的稳定性和使用寿命；③由于可以键合不同性质的官能团，改善固定相的性能，所以提高了选择性；④可以利用梯度洗脱，提高分析效率，得到好的分离结果。（三）离子交换色谱法固定相离子交换色谱法早期使用的固定相是高分子聚合物，如以苯乙烯－二乙烯苯为基体的离子交换树脂。这些高分子聚合物遇溶剂易膨胀，不耐压，传递速度慢，不适合HPLC，目前已基本被离子交换键合相代替。离子交换键合相也是以薄壳型或全多孔微粒硅胶为载体，然后在其表面键合上各种离子交换基团。常用的离子交换基团有阳离子键合相交换基团和阴离子键合相交换基团两种，由此构成了阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交换树脂分为强酸和弱酸性树脂，阴离子交换树脂分为强碱和弱碱性树脂。其中强酸性和强碱性离子交换树脂较稳定，因此在高效液相色谱中应用较多。（四）尺寸排阻色谱法固定相尺寸排阻色谱法的固定相应用最多的是多孔性凝胶。根据机械强度的不同可分为软质、半硬质和硬质凝胶三类。软质凝胶（如葡聚糖）不耐压，不适宜用在高效液相色谱中；半硬质凝胶（如聚苯乙烯）可用于HPLC，但流速不宜过快；硬质凝胶（如多孔硅胶、多孔玻璃）可用于HPLC，但填充不易紧密，柱效较差。（五）亲和色谱固定相

亲和色谱是一种基于分离物与配体间特异的生物亲和作用来分离生物大分子的技术。配体以共价键结合到载体上，当含有亲和物的复杂混合试样随流动相流经固定相时，亲和物就与配体结合而与其它组分分离。广泛应用于生物化学各种酶、辅酶、激素、糖类、核酸和免疫球蛋白等的分离和纯化。（六）

手性固定相手性对映异构体具有完全相同的化学性质和物理性质，使用通常的反相、正相和离子交换高效液相色谱技术很难分离。但它们之间在分子的某个化学基团的空间构型上有差异，光学性质有所不同。手性固定相法是利用键合在固定相上的手性识别剂，与对映体反应形成非对映复合物，然后进行分离测定。二、流动相

高效液相色谱流动相的作用，一是携带样品通过色谱柱，二是给样品提供一个分配相，进而调节选择性，使混合物实现分离。

可以用作高效液相色谱流动相的溶剂很多，如有机溶剂、水、无机盐的水溶液。流动相分为单一流动相和混合流动相。混合流动相是由两种或两种以上溶剂按不同比例组成的混合液。流动相选择的合适与否直接影响样品的分离度和分析速度。（一）对流动相的基本要求

1.对被分离的样品有适宜的溶解度，使组分的分配系数K介于1～10之间。

2.与样品及固定相不发生不可逆化学反应，即保持柱效或柱子的性质长期不变。3.粘度小，否则液相传质速度慢，柱压升高，柱效低。

4.与检测器匹配，如使用紫外检测器时，流动相在检测波长下不应有吸收。

5.纯度高（色谱纯）。（二）流动相的选择

与气相相比，流动相选择的灵活性是它的一个特点。流动相的选择虽有一般的指导原则，但更多的需要实际经验和实验。显然，溶剂的极性是重要依据。溶剂极性的强弱通常采用Snyder提出的溶剂强度参数来衡量（见表12-2）。1.液-固吸附色谱流动相的选择液-固吸附色谱中流动相称作洗脱剂。选择原则是待测组分的极性和洗脱剂的极性一致，即分离极性大的试样选用极性强的洗脱剂；分离极性弱的试样选用极性弱的洗脱剂。2.液-液分配色谱流动相的选择在液-液分配色谱中，要求流动相与固定相的极性有显著不同，以防止固定液流失。

对于正相分配色谱，一般先选用中等极性溶剂作为流动相，若组分的保留时间太短，说明流动相极性太大，需改用极性较弱的溶剂；若组分保留时间太长，说明流动相极性太小，需改用极性较强的溶剂。经过多次实验后，才能确定最适宜的流动相溶剂。

在反相色谱中，一般采用水为流动相的主体，再加入不同比例的有机溶剂作调节剂。3.离子交换色谱流动相的选择离子交换色谱流动相大多是具有一定PH和离子强度的缓冲溶液。4.尺寸排阻色谱流动相的选择尺寸排阻色谱流动相选择的依据是：流动相能完全溶解样品，必须与凝胶本身非常相似以便润湿凝胶，粘度要小。总之，最佳流动相体系必须通过多次实验优化确定，是HPLC重要条件之一。（三）流动相的处理高效液相色谱的流动相必须经过一定的处理后才能使用，主要包括纯化和脱气。1.纯化为了满足检测器的要求，获得重现性好的色谱数据，要求流动相必须达到一定的纯度。例如使用水作流动相时，要求使用高纯水。使用有机溶剂要选用色谱纯试剂。2.脱气在流动相中常溶解有一些气体，这些气体在泵输液过程中进入泵体，会妨碍柱塞及单向阀的正常工作，导致输液不准、脉动及压力波动，从而影响组分保留时间和峰面积的重现性。气泡进入检测器还可引起光吸收和电信号的变化，造成基线波动及漂移，出现有规律、不正常的尖峰或平顶大峰。如果使用荧光检测器，溶解的氧气还会导致荧光猝灭，影响测定结果及测定的重现性。脱气的方法较多，例如减压脱气、煮沸脱气、超声波震荡脱气等。如果是多组分的流动相，最好采用超声波震荡脱气，这样不会造成组分的变化，超声震荡时间一般为15～20min。

（四）洗脱方式高效液相色谱法有等度洗脱和梯度洗脱两种洗脱方式。

等度洗脱，即自始至终溶剂配比都保持恒定。

梯度洗脱是指在分离过程中流动相的组成随时间改变而改变。流动相组成的改变，将导致流动相的极性、离子强度或pH值等发生改变，使被测组分的相对保留值得以改变，这样既能使复杂样品达到很好的分离，又可以缩短分析周期，提高分析速度。第四节

影响色谱峰扩展的因素及分离操作条件的选择

高效液相色谱法与气相色谱法的基本理论一致，塔板理论、速率理论、保留值、分离度等概念和术语同样适用于高效液相色谱。由于流动相不同，在分析速率理论（即VanDeemter方程）各项动力学因素对色谱峰展宽的影响时，必须考虑气体和液体之间在粘度、扩散系数等方面的差异。在高效液相色谱中影响色谱峰扩展的因素，可分为柱内因素和柱外因素，下面分别予以介绍。一、柱内扩展及分离条件的选择（一）影响柱内扩展的因素在气相色谱速率理论中，范氏方程已经概括了影响柱效的各种动力学因素，将范氏方程加以部分修改后即可用于高效液相色谱1.涡流扩散项A

即用粒度小而且均匀的固定相，柱填充均匀，可以提高柱效，减小A。由于高效液相色谱采用了比气相色谱粒度更小、更均匀的球形固定相，故涡流扩散项很小。2.纵向扩散项B/u

是由于组分分子在柱内存在浓度梯度而引起的。分子在流动相中的扩散系数

由于流动相为液体，其粘度比气体大得多，分子在液相中的扩散系数比它在气相中的小4～5个数量级。为了加快分析速度，一般流动相的流速不是很小。所以纵向扩散在高效液相色谱中很小，它对柱效的影响可以忽略不计。

3.传质阻力项Cu

传质阻力为固定相传质阻力和流动相传质阻力之和。当组分分子在流动相的携带下经过固定相时，组分分子不断地在流动相和固定相之间进行质量交换。由于Dm较小，分子在流动相中的传质速度受到了限制，而流动相的流速又较快，因而经常会引起局部不平衡，从而使色谱峰扩展。

（1）固定相传质阻力Hs是在组分分子从流动相进入到固定液内进行质量交换的传质过程中产生的。Hs取决于固定液膜的厚度df和组分分子在固定液中的扩散系数Ds，其含义与气相色谱中液相传质阻力的含义一致。（2）流动相传质阻力是组分分子在流动相中的传质过程中产生的阻力，有两种形式：在流动的流动相中的传质阻力Hm和在静止的流动相中的传质阻力Hsm。Hm

当流动相携带试样分子流经色谱柱时，流路中央的流动相流速较快，而靠近色谱柱中填充物颗粒的流动相流速缓慢，从而引起峰扩展。这种影响引起板高的变化与线速度u、固定相粒度dp的平方成正比，与试样分子在流动相中的扩散系数Dm成反比。Hsm

由于固定相的多孔性，会使部分流