烟草遗传转化体系的建立

湖南农业大学生物安全科学技术学院全日制普通本科生毕业论文烟草遗传转化体系的建立Genetictransformationsystemfortobacco学生姓名：索尼克学号：200741632年级专业及班级：2007级动植物检疫（3）班指导老师及职称：谭新球博士生导师学院：生物安全科学技术学院湖南·长沙提交日期：2011年6月湖南农业大学生物安全科学技术学院全日制普通本科生毕业论文（设计）诚信声明本人郑重声明：所呈交的本科毕业论文（设计）是本人在指导老师的指导下，进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，本论文（设计）不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体在文中均作了明确的说明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。毕业论文（设计）作者签名：年月日烟草遗传转化体系的建立学生：指导老师：(湖南农业大学东方科技学院，长沙410128)摘要：烟草是植物转基因研究技术最成熟的植物之一。而农杆菌介导(AgrobacteriunOmediated)的间接转化方法已成为目前主要的遗传转化技术，烟草也成为植物遗传转化研究的模式植物。关键词：烟草；转化；农杆菌；体系；前言烟草与植物转基因的概念烟草是植物转基因研究技术最成熟的植物之一。1985年，Horsch等[1]用烟草叶片作为根癌农杆菌转染对象，获得转基因的烟草植株，并首创了简单高效，且易于采纳的叶盘法。而农杆菌介导(AgrobacteriunOmediated)的间接转化方法已成为目前主要的遗传转化技术，烟草也成为植物遗传转化研究的模式植物[2]。转基因植物的研究主要在于改进植物的品质，改变生长周期或花期等提高其经济价值或观赏价值；作为某些蛋白质和次生代谢产物的生物反应器，进行大规模生产；研究基因在植物个体发育中，以及正常生理代谢过程中的功能。以植物作为生物技术的实验材料有其特定的优点，那就是植物细胞大部分都有全能性(t-otipotency)，可以用单个细胞分化发育出整个植株。这样，经过基因工程改造的单个植物细胞有可能再生成一棵完整的转基因植株。这些植株还可通过有性生殖过程把改变了的性状遗传给下一代。植物基因工程用作外源基因的转化受体有许多种，包括胚性愈伤组织(cai-lus)、分生细胞、幼胚、成熟胚、受精胚珠、种子和原生质体等。从这些受体细胞都可获得再生的转基植株。而植物基因转化方法主要有：农杆菌介导法、直接转入法、原生质体融合、花粉管通道法等。本文主要是以农杆菌介导法来转化烟草。农杆菌介导法是农杆菌的Ti质粒可以作为载体。在Ti质粒上有两个区域，一个是T-DNA区，这是能够转移并整合进植物受体的区段；另一个是Vir区，它编码实现质粒转移所需的蛋白质。将待转化的外源基因先克隆在大肠杆菌质粒上，然后将此质粒转入不会引起冠瘿瘤的农杆菌(这种菌的Ti质粒已除去了T-DNA)，使外源基因通过同源重组整合在Ti质粒上；然后用带有外源基因的这种农杆菌去转化植物细胞，将外源基因转入植物细胞的基因组。近代中国转基因植物研究与产业化发展迅速，在国家“863”高新技术研究与发展计划及国家科技攻关计划的资助下，我国转基因植物的研究和开发取得了显著的进展，有些研究已经达到国际先进水平。据1996年国生物技术学会统计，我国投入研究和开发的转基因植物达47种，涉及各类基因103种。近年来有近20种转基因植物进入了田间试验或环境释放阶段。至1999年，农业部批准可进行商业化生产的国内研制的转基因植物有5种，它们分别是：抗虫棉花、改变花色的矮牵牛、延熟番茄、抗病毒的甜椒和番茄。在植物抗虫基因工程方面：在国家“863”计划的支持下，中国农业科学院生物技术研究所成功地人工合成和改造了植物抗虫害的Bt基因，获得了高抗棉铃虫的转基因棉花品种和品系。此外，中国农业科学院棉花所、南京农业大学和山西省农科院棉花所等单位还以转基因抗虫棉为亲本，育成了一批抗虫能力在80％以上，单产比主栽品种高15％以上的转基因抗虫杂交棉组合。拥有我国自主知识产权的抗虫棉花的育成和大面积推广应用，标志着我国转基因植物研究开始进入产业化发展阶段。为了有效控制水稻害虫的危害，中国农业科学院生物技术研究所和华中农业大学合作成功地获得了转Bt基因杂交水稻，对二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟的毒杀效果达到95％。浙江农业大学（现已并入浙江大学）也成功地将Bt基因导入水稻早稻品种。目前转Bt基因抗螟虫水稻已进入环境释放阶段。中国科学院遗传所研制成功的转ＣpTI基因抗虫水稻也分别获准在北京、福建和山西进入中间试验和环境释放。此外，中国农业大学研制的转基因抗玉米螟玉米、复旦大学遗传所研制的转基因抗褐习虱水稻、中国科学院微生物研究所和中国林业科学院林研所研制的抗虫转基因杨树也都进入环境释放阶段。在抗病基因工程方面：中国农业科学院生物技术研究所已成功地人工合成和改造了来自天蚕蛾的抗菌肽基因，并导入我国马铃薯主栽品种米拉，获得抗病性提高Ⅰ—Ⅲ级的抗青枯病的转基因株系，现已经农业部批准在四川省进行环境释放。目前抗菌肽基因已经供给国内10多家研究单位，进行抗水稻白叶枯病、马铃薯软腐病、花生和番茄的青枯病、大白菜软腐病、柑桔细菌性溃疡病、桑树和桉树青枯病、樱桃根肿病等抗细菌病基因工程研究。白叶枯病也是危害水稻生产的最为严重的病害之一。中国农业科学院生物技术研究所与国外合作研制成功的转Xa21基因抗白叶枯病水稻明恢63株系已分别在安徽省和海南省进行环境释放；华中农业大学和中国科学院遗传所研制的转Xa21基因抗白叶枯病水稻也分别进入中试阶段。真菌病也是严重影响农作物生产的一类病害。中国农业科学院生物技术研究所与中国科学院上海植物生理研究所等单位合作，成功地克隆和修饰了植物来源的几丁质酶基因和葡萄糖氧化酶基因，通过花粉管通道法分别将这两个基因导入棉花，获得了抗黄萎病和枯萎病和枯萎的转基因棉花，这些株系在病圃中表现良好，现已进入中试阶段。在抗病毒的基因工程方面:国内也取得了很好的进展。北京大学克隆了烟草花叶病毒CMV、黄瓜花叶病毒CMV、马铃薯X病毒等中国株系以及水稻矮缩病毒的外壳蛋白基因，研制成功的抗黄瓜花叶病毒甜椒和番茄都已经分别在云南和福建进入中试或环境释放。中国农业科学院油料研究所研制的转基因抗条纹病毒花生、北京市农林科学院蔬菜研究中心育成的抗芜菁花叶病毒白菜和新疆农科院核技术生物技术所获得的抗黄瓜花叶病毒转基因甜瓜都已分别进入中试。此外，国内一些研究单位还获得了抗环斑病毒（PRSV）的番木瓜，抗黄矮病和黄花叶病毒的小麦等抗病毒病的基因工程植株。植物抗逆基因工程我国在抗盐基因工程上已取得了一些进展，先后克隆了脯氨酸合成酶（proA），山菠菜碱脱氢酶（BADH），磷酸甘露醇脱氢酶（mtl）及磷酸山梨醇脱氢酶（gutD）等与耐盐相关基因，通过遗传转化获得了而1％NACL的苜蓿、耐0.8％NACL的草莓及耐2％NACL的烟草，这些转基因植物已进入田间试验阶段。中国科学院遗传所将BADH基因导入水稻，获得的转基因水稻有交较高的耐盐性，并能在盐田中结实。植物品质改良的基因工程北京大学已将编码必需氨基酸的基因转入马铃薯，获得含高必需氨基酸的马铃薯品系，这些品系已在内蒙试种，正准备进入中试开发。中国农业大学成功地将高赖氨酸基因导入玉米，获得的转基因玉米中赖氨酸含量比对照提高10％。在控制植物发育的基因工程中，较为成熟的技术延迟成熟番茄的研究。华中农业大学和中国科学院植物所分别获得了这种转基因番，贮存时间可延长1-2个月，有的可达80多天。1997年农业部基因工程安全委员会已批准这种耐储存番茄进行商业化生产。中国农业大学利用反义基因技术培育的耐储存番茄新品种已进行环境释放。北京大学成功地将与植物花青素代谢有关的查而酮合酶基因导入花卉植物矮牵牛，转基因矮牵牛的花色呈现自然界没有的变异，提高了花卉的观赏价值。转基因兰花和转基因非洲菊的研究工作正在进行中。植物叶绿体基因工程中国农业科学院生物技术研究所在国内较早开始进行植物叶绿体遗传转化研究。1996年建立了烟草叶绿体遗传转化体系，并成功地将Ｂt基因导入烟草叶绿体中，转基因植物杀虫效果显著。他们还将固氮酶基因（nifH和nifM）、抗剂基因（bar基因）和绿色荧光蛋白（GFP）基因导入了烟草叶绿体。植物生物反应器利用转基因植物作为生物反应器生产药用蛋白的研究逐渐受到各国的重视，研究探索的热点之一是利用转基因植物生产口服疫苗。中国农业科学院生物技术研究所的科研人员将乙型肝炎病毒表面抗原基因导入马铃薯和蕃茄，饲喂小鼠试验检测到较高的保护性抗体，浓度足以对人类产生保护作用。该所还进行了利用植物叶绿体作为生物反应器生产药用蛋白的探索，目前已将丙肝病毒（HCV）抗原基因导入衣藻叶绿体。利用转基因植物生产口服疫苗可以大大降低疫苗的生产成本，在发展中国家更有良好的发展前景。材料及原理材料实验菌种及材料根癌农杆菌，本氏烟，三生烟实验试剂电泳缓冲液，KT激动素，潮霉素，头孢霉素，NAA，电泳缓冲液实验仪器压力蒸汽灭菌器LDZX-50FB上海申安医疗器械厂上皿电子天平JA3003上海精科天平净化工作台SWCJ-A上海新苗医疗器械制造恒温培养振荡器ZHWY-211B上海智城分析仪器制造精密型酸度计PHS-818贵阳学通仪器仪表电泳仪JY600C北京君意东方电泳设备凝胶成像分析系统GIS-2008天龙科技（上海）双光束紫外可见分光光度计TU-1901北京普析通用仪器培养基MS培养基（固体）：蔗糖30g/L、PlantAgar0.7%/L、MurashigeandSkoog(MS)4.47g/L，用KOH调PH至5.7-5.9,121℃灭菌20min.MS培养基（液体）：蔗糖30g/L、MurashigeandSkoog(MS)4.47g/L，PH调至5.7-5.9,121℃灭菌20min.YEP培养基：酵母提取物10g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCL5g/L，用NaOH调PH至7.0-7.2，121℃灭菌30min.生根培养基配方：MS固体培养基+Kan100ug/ml+cef/ml.原理感受态原理：在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。转基因技术的原理：就是把基因分离克隆出来，在生物体外进行操作，并把它转到一个目标植物中，使这个目标植物获得新的性状。农杆菌介导法就是用农杆菌的Ti质粒作为载体。将待转化的外源基因先克隆在大肠杆菌质粒上，然后将此质粒转入进去，使外源基因通过同源重组整合在Ti质粒上。然后用带有外源基因的这种农杆菌去转化植物细胞，将外源基因转入植物细胞的基因组。实验内容1）农杆菌感受态细胞的制备

（1）挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含链霉素Sm100ug/ml）中，28°C振荡培养过夜；

（2）取过夜培养菌液500ml接种于50mlYEB(Sm100ug/ml)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；

（3）5,000rpm,离心5min；

（4）加10ml0.15MNaCl悬浮农杆菌细胞，5,000rpm,离心5min；

（5）1ml预冷的20mMCaCl2悬浮细胞，冰浴，分装成100l，液氮中速冻1分钟，置-80°C保存备用。

2）植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化

取200ml感受态细胞，加入1mg构建好的质粒DNA（35S和Ubi），液氮中速冻1分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1mlYEB培养基，28℃慢速振荡培养4小时；1,000rpm离心30sec，弃上清，加入0.1mlYEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100ug/mlKan和125ug/mlSm的YEB平板上，28℃培养约48小时。农杆菌介导的烟草转化将携带目的基因的根癌农杆菌菌株在含有相应抗生素(链霉素和卡那霉素)的YEP平板上划线，置于28℃恒温培养箱内培养(约1.5-2d)，挑取单菌落，接种于含相应抗生素的YEP液体培养基中，在28℃，200r/min条件下培养过夜。1：取-80℃保存的农杆菌菌液或者是单菌落，接种到5ML培养液中（YEP+相应抗生素），28℃摇培过夜。2：将2ML过夜培养物接种至50ML培养液中（YEP+相应抗生素），继续28℃摇培过夜。3：收集过夜摇培物，用MS液体重悬。4℃，5000RPM离心10分钟。重复两次。4：将农杆菌重悬于20mL的MS液体中,至0D0.6-0.8，加入乙酰