生物化学实验Km

酶Km值的测定1酶的概念由活细胞产生的、具有催化功能的生物大分子。2酶与医学健康的关系3

又称先天性代谢缺陷病：

----编码酶蛋白的基因发生突变导致合成的酶结构或数量改变所引发的机体代谢紊乱。遗传性酶病4遗传性酶病发病机制控制某一酶合成的基因发生突变，或者控制其结构基因的调控基因发生突变，引起酶在质或者量上发生改变，其催化作用也随之发生改变，从而间接导致代谢紊乱，引起机体代谢障碍。5遗传性酶缺陷引起的物质代谢途径受阻示意图6（一）苯丙酮尿症(PKU)我国发病率1/165000病因：苯丙氨酸羟化酶（PAH)基因突变导致PAH缺乏，使苯丙氨酸不能合成酪氨酸。×③7经典型苯丙酮尿症(PKUI)苯丙氨酸对中枢神经毒性作用抑制大脑正常发育酪氨酸多巴神经功能智力低下黑色素毛发皮肤变浅×苯丙酮酸8基因定位：PAH基因：12q24.1突变类型广泛，呈现明显的遗传异质性（一）苯丙酮尿症(PKU)9临床表现：出生时正常，进奶以后，一般在3-6个月时，即可出现症状，1岁时症状明显。外貌因黑色素足，在生后数月毛发皮肝和虹膜色泽变浅，皮肤干燥，有的伴有湿疹，由于尿和汗液中排出苯乙酸，呈特殊的鼠尿臭味神经系统症状早期可有神经行为异常，如兴奋不安，多动或嗜睡，精神萎靡.（一）苯丙酮尿症(PKU)10诊断本病为少数可治性遗传性代谢病之一，上述症状经饮食控制治疗后可逆转，但智能发育落后难以转变，应力求早期诊断治疗，：以避免神经系统的不可逆损伤。由于患儿早期症状不典型，必须借创实验室检测。11

1、新生儿期筛查

新生儿喂奶3日后，采集足根末梢血，吸收再生厚滤纸上，晾干后邮寄到筛查中心，采用Guthrie细菌生长抑制试验半定量测定，其原理是苯丙氨酸能促进已被抑制的枯草杆菌重新生长，以生长圈的范围测定血中苯丙氨酸的含量。

122、尿三氯化铁试验

用于较大婴儿和儿童的筛查。将三氯化铁滴入尿液，如立即出现绿色反应，则为阳性，表明尿中苯丙氨酸浓度增高。3、血浆氨基酸分析和尿液有机酸分析

可为本病提供生化诊断依据，同时，也可鉴别其他的氨基酸、有机酸代谢病。

4、尿蝶呤分析

应用高压液相层析（HPLC）测定尿液中新蝶呤和生物蝶呤的含量，鉴别各类PKU。

13诊断酶学诊断PAH仅存在于肝细胞，需经肝活检测定，不适用于临床诊断。其他3种酶的活性可采用外周血中红、白细胞或皮肤成纤维细胞测定。DNA分析该技术近年来广泛用于PKU诊断、杂合子检出和产前诊断。但由于基因的多态性，分析结果务须谨慎。

14治疗诊断一旦明确，应尽早给予积极治疗，主要是饮食疗法。开始治疗的年龄愈小，效果愈好。低苯丙氨酸饮食主要适用于典型PKU以及血苯丙氨酸持续高于1.22mmol/L的患者。由于苯丙氨酸是合成蛋白质的必需氨基酸，完全缺乏时亦可导致神经系统损害，因此对婴儿可喂给特制的低苯丙氨酸奶粉，到幼儿期添加辅食时应以淀粉类、蔬菜、水果等低蛋白食物为主。

15预防避免近亲结婚。开展新生儿筛查，以早期发现，尽早治疗。对有本病家族史的孕妇必须采DNA分析或检测羊水中蝶吟等方法对其胎儿进行产前诊断。16酶的应用用酶进行疾病的诊断用酶进行疾病的预防和治疗用酶制造各种药物生物工程091黄晨子17根据体内酶活性的变化诊断疾病酸性磷酸酶酸性磷酸酶是一种在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的水解酶。人血清酸性磷酸酶的最适PH为5~6，最适作用温度37˚С。正常人血清中的酸性磷酸酶来源于骨、肝、肾、脾、胰等组织。前列腺癌患者以及出现肝炎、甲状旁腺功能亢进、红细胞病变等疾病时，血清中酸性磷酸酶的活性都会升高。18根据体内酶活性的变化诊断疾病碱性磷酸酶碱性磷酸酶在碱性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的水解酶。人血清碱性磷酸酶的最适PH为9.5~10，最适作用温度37˚С。碱性磷酸酶在体内分布广泛，特别是骨骼组织、牙齿、肾脏、和小肠中含量较高等组织。主要由造骨细胞产生，对于佝偻病、骨骼软化症、骨瘤、骨骼广泛性转移癌等骨骼疾病患者，以及甲状旁腺功能亢进、黄疸型肝炎疾病患者，血清中碱性磷酸酶的活性都会升高。19用酶进行疾病的预防和治疗尿激酶、链激酶：溶血栓剂，治疗血栓病。酪氨酸酶生产（神经递质），多用于治疗帕金森综合症。溶菌酶（黏多糖溶解酶）：破坏革兰氏阳性菌细胞壁而杀死细菌。抗菌、止血消肿、加快伤口愈合，也用于治疗鼻炎、咽喉炎、口腔溃疡等。20用酶制造各种药物核苷磷酸化酶制造阿糖腺苷无色杆菌蛋白酶制造人胰岛素多核苷酸磷酸化酶生产聚肌胞青霉素酰化酶制造半合成抗生素β—酪氨酸酶制造多巴21酶Km值的测定2223242526碱性磷酸酶酚在碱性条件下与酚试剂（酚试剂同时也是酶反应的终止液）反应，其光吸收与磷酸底物浓度成正比。

故以1/A取代1/v作为纵坐标作图。27试剂(ml)1234560.5mM磷酸苯二钠0.10.20.30.40.50.5蒸馏水0.40.30.20.1--碱性缓冲液0.250.250.250.250.250.25混匀后，370C水浴5min碱性磷酸酶液0.10.10.10.10.1-冰上混匀后，370C水浴15min（准确计时）酚试剂0.150.150.150.150.150.15冰上碱性磷酸酶液-----0.110％Na2CO30.30.30.30.30.30.3混匀后，37℃水浴15min，以第6管调节零点，在660nm波长处进行比色，读取各管A值。28管号A6601/A660[S]1/[S]123456处理结果以1/A660对1/[s]按Lineweaver-Burk作图法作图，求出碱性磷酸酶的Km29分光光度计的使用30分光光度计的使用分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比。31有效数字的处理实验重复有效数字32标准曲线的绘制标准曲线（standardcurve）是指通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的性质的数值曲线。标准曲线是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的函数关系。建立标准曲线的目的是推导待测物质的理化属性。在分析化学实验中，常用标准曲线法进行定量分析。3334标准曲线的要素变量可信度有效范围35变量标准曲线的横坐标(X)表示可以精确测量的变量(如标准溶液的浓度)，称为普通变量。纵坐标(Y)表示仪器的响应值(也称测量值，如吸光度、电极电位等)，称为随机变量。

36可信度37有效范围（线性范围）标准物质的物理/化学属性有一定的有效范围。仪器存在一定的相应范围。因此标准曲线存在一定的有效范围38标准曲线的制作图表名称坐标字体大小公式、相关系数39实验报告的撰写实验方法与步骤及以上略实验结果 结果的呈现要清晰、规范，计算过程清楚，作图要规范。分析讨论 简单分析实验结果 讨论实验方法（如测定生物分子含量的方法、标准曲线的原理与应用以及数据处理等）。实