分子生物学第六章基因重组

Chapter6Geneticrecombination遗传重组重组recombination:是已存在的遗传物质产生新的组合的过程。分子间或染色体间重组：离散的染色体混合时产生新的组合。如真核染色体减数分裂时的染色体独立分配。不依赖酶。分子内或染色体内重组：通过DNA的剪切和连接产生新的染色体类型。依赖酶。分子内重组同源重组homologicalrecombination：同源性依赖，非序列专一性依赖。在大肠杆菌由RecA蛋白指导。位点特异性重组sitespecificrecombination：序列专一性依赖，非同源性依赖。由位点特异性重组酶指导。转座transposition：非同源性依赖。由转座酶、整合酶指导。酶识别转座因子两端特异序列，但受体位点相对非特异。不正常重组或非常规重组illegitimaterecombination：很少或不需要同源性。一般使用不正常底物进行细胞正常加工。与癌症相关。人工重组artificialrecombination:体外进行DNA的剪切和连接引起的重组，即基因重组。一、同源重组功能：减数分裂时染色体分配、DNA修复、特定噬菌体的复制、酵母的交配型转换、真核基因组的遗传作图、基因导入模型：拷贝-选择：在DNA复制中，新生链延伸时转换为新的模板。如DNA修复。断裂-重新连接：重组没有在复制中产生，DNA链在双链间断裂、交换和重新连接。如减数分裂时染色体交换杂合模型：包括上面两种特征。修复损伤DNA的同源重组真核生物同源重组的断裂与重接模型

DarlingtongD.C.于1936年提出：减数分裂同源染色体联会时，非姊妹染色单体由于缠绕而产生张力，两个染色单体在同一位置断裂、重节，以消除张力，从而产生重组。证据：姊妹染色单体的交换

Diploideukaryotes:crossingover(双倍体染色体交换)Homologouschromosomeslineupinmeiosis(when)Thenonsisterchromatidsexchangeequivalentsections(what)同源重组发生在两条DNA双链之间重组酶能以任何的同源序列为底物重组的频率在整组基因中并不很频繁，但对整体和局部都有影响重组的总频率在精子和卵子中并不相同，在人类中女性是男性的两倍在整组基因内部，同源重组的频率与染色体的构象有关，例如，十字结构将阻止附近的DNA重组变异。染色体的重组包含部分的物理性的改变：破损与再联合细线期偶线期粗线期双线期终变期同化作用在DNA双链中制造一个破损两条DNA双链分子的联接作用是基因重组的关健环节同源染色体两对DNA双链在相应点产生nick，一条单链离开它的伙伴，与另一个双链分子的相应位置倒易位置，创造了两个DNA双链之间的连系，这种连接在一起的一对双链叫做交差分子。一个链与另一个链的连接点叫做重组关节。重组关关节能能沿着着DNA双双链分分子移移动，，这种种移动动叫做做枝状状迁移移在一条条链被被另一一条链链取代代的过过程中中，分分叉点点可以以沿任任一个个方向向移动动交差分分子旋旋转后后形成成一个个平面面结构构------Holliday结构构细菌基基国重重组中中的单单链同同化作作用single-strandassimilationDNA分子子的单单链部部分通通过碱碱基互互补配配对转转移到到另一一DNA双双链分分子中中，称称为单单链吸吸收或或单链链同化化。有三个个必备备条件件：◆其其中一一个DNA分子子必须须有单单链区区◆其其中一一个DNA分子子必须须有自自由3’端端◆单单链区区和3’端必必须设设置在在两分分子互互补区区内RecA催催化单单链的的同化化作用用RecA催催化单单、双双链DNA的反反应分分为三三个阶阶段：：◆RecA在在单链链DNA上上慢慢慢聚合合。◆单单链DNA与其其互补补物在在双链链上快快速配配对反反应，，产生生异源源双链链连接接◆单单链从从双链链中慢慢慢转转移，，产生生一个个长的的异源源双链链DNA区区带。。SSB(单链结结合蛋蛋白)的存在在刺激激了这这个反反应RecApromotestheassimilationofinvadingsinglestrandsintoduplexDNAsolongasoneofthereactingstrandshasafreeend.RecAcatalyzessingle-strandassimilationRecA介介导的的DNA修修复重组热热点重组起起始于于双链链破损损。双双链破破损在在轴素素形成成期产产生，，在联联会丝丝复合合物形形成阶阶断消消失(~60min)在染色色体上上容易易发生生双链链破损损的位位点，，称为为重组组热点点。Chi序列列刺激激它周周围附附近的的重组组与重组组有关关的基基因称称为Rec基因因Rec突变变体不不能进进行同同源重重组大约10～～20个与与重组组有关关的DNA位点点通过过E.coli的Rec基基因突突变体体鉴定定Chi序列列能刺刺激它它周围围附近近的重重组：：5’GCTGGTGG3’3’CGACCACC5’Chi序列列在大大肠杆杆菌中中每5—10kb出出现一一次Chi是一一个被被RecBCD基因因编码码的酶酶的作作用目目标。。RecBCD是是有强强烈降降解DNA能力力的核核酸酶酶，在在SSB存存在下下，有有解开开DNA双双链的的酶活活性和和ATP酶酶活性性，它它在重重组中中所起起的作作用便便是提提供带带有自自由3’端端的单单链DNA。Haploidprokaryotes(单倍倍体生生物原原核同同源重重组））BetweenthetwohomologousDNAduplex(where)partiallyduplicatedDNAofthechromosomebetweenchromosomalDNAand““foreign””DNANicksmadenearChi(GCTGGTGG/each4kb)sitesbyanucleasewithrecBCD.RecAbindstossDNAtoformRecA-ssDNA.How:Hollidaymodel3.RecA-ssDNAfilamentssearchtheoppositeDNAduplexforcorrespondingsequence(invasion).4.Sealthenicksandformafour-branchedHollidaystructure5.Branchmigration&resolvingHollidayjunctionHaploidprokaryotes(原核核同源源重组组）Haploidprokaryotes(原核核同源源重组组）ResolvingHollidayjunction二、位位点专专一性性重组组非序列列同源源性重组位位点特特异由识别别特异异重组组位点点的酶酶指导导导致DNA序列列发生生重排排举例：：l噬菌体体插入入细菌菌基因因组l噬菌体体从细细菌基基因组组中切切离l-encodedintegrase(Int整整合酶酶):makesstaggeredcuts交错错切点点inthespecificsites（（15bpseq））IntandIHF(integrationhostfactorencodedbybacteria):recombinationandinsertionl-encodedexcisionase(XIS):excisionofthephageDNASite-specificrecombination:(位位点专专一性性重组组）bacteriophagelinsertion整合过过程要要求在在attp和attB之之间进进行识识别；；而移移除过过程则则需要要在attL和和attR之间间进行行识别别重组过过程是是可逆逆的，，但反反应条条件不不同：：整合合反应应需要要int产产物和和IHF因因子；；移除除反应应还需需要噬噬菌体体xis基基因产产物。。xis基因因产物物决定定噬菌菌体是是否进进行复复制整合的的过程程:A.具具有对对特异异性DNA强烈烈亲和和力的的Int与与attP和attB位位点结结合；；B.Int的拓拓扑异异构酶酶活性性，使使两条条双链链各自自断开开一条条单链链，瞬瞬间旋旋转然然后交交换连连接，，形成成Holliday中间间提，，C.在在另两两条单单链之之间发发生同同样的的断裂裂重接接，从从而完完成双双链间间的重重组。。位点专专一性性重组组的核核苷酸酸序列列1.attP:POP’’:O为15bp(核心心)富富含A-T的非非对称称序列列；P为-160~O的的160bp序序列P’为为O~80的80bp序序列共240bp2.attB:BOB’’:B为-11~O序序列B’为为O~11序序列共23bp重组后后形成成BOP’’(attL,91bp)和和POB‘‘(attR,171bp)特异性性重组组可以以在体体外进进行特异性性重组组可以以通过过Int和和IHF在在体外外进行行，它它包括括在缺缺少任任何DNA合成成下的的破损损与再再结合合，两两个臂臂的功功能可可以通通过在在两侧侧产生生缺失失来研研究attp发发挥作作用要要240bp，，而attB只只需要要由-11到+11的23bp的的片断断即可可发挥挥作用用，在在这个个片段段中，，核心心两侧侧只有有4bp通路克克隆系系统gatewaycloningsystem一种位位点特特异的的DNA重重组技技术，，包括括LR和BP两两个反反应体体系。。可简简单表表示为为：attBXattPattLXattR用途：：PCR产物物的定定向克克隆DNA片断断高效效、广广泛的的亚克克隆氨基或或羧基基末端端的融融合蛋蛋白表表达LR反反应和和BP反应应LR反应：：通路路克隆隆的主主要反反应,LR克隆酶酶(整整合酶酶(Int)和整合合宿主主因子子(IHF)蛋白)识别别attL和attR重组位位点后后,催化入入口克克隆(entryclone)的外源源DNA及其两两端部部分位位点取取代目目标载载体(destinationvector)的ccdB基因及及其两两端部部分位位点(灰色),形成表表达克克隆(expressionclone)。BP反应：：与LR反应反反向,BP克隆酶酶混和和物(Int、IHF和切除除酶(Xis))催化化表达达载体体attB间的目目的基基因转转到供供体载载体中中,形成新新的入入口克克隆,此克隆隆又可可与其其它目目标载载体重重组产产生新新的表表达载载体。。PCR产物物的BP反反应三、转转座重重组特点：：1.自自身携携带有有转座座酶基基因，，末端端有反反向重重复序序列;2.转转座过过程中中出现现共联联体；；3.转转座以以后,可以以造成成原来来转座座子位位置的的DNA缺缺失(非复复制转转座)，也也可以以依然然保持持在原原位，，而在在靶序序列上上复制制了一一个转转座子子(复复制转转座);4.转转座完完成以以后可可以在在靶序序列上上造成成同向向重复复序列列5.转座子子插入入后可可影响响所在在位置置的基基因的的表达达转座子子转座子子指能能将自自身插插入基基因组组中其其它位位置的的一段段DNA序序列。。插入入位置置与转转座子子序列列没有有相关关性。。病毒、、细菌菌和真真核细细胞的的质粒粒或基基因组组中都都含有有转座座子。。多数转转座子子在插插入新新位点点的过过程中中依赖赖其特特异的的插入入序列列去完完成。。原核生生物转转座因因子包包括：：插入入序列列；转转座子子；转转座噬噬菌体体ISelement基因组组的进进化既既赖于于获得得新的的序列列又赖赖于重重排目目前的的序列列。转座子子可引引起其其它基基因组组顺序序的重重排，，提供供基因因组里里变异异的主主要来来源。。重排排可以以产生生新的的序列列和改改变目目前序序列的的作用用。细菌、、噬菌菌体、、病毒毒(尤尤其是是逆转转录病病毒)可可以通通过传传染传传递遗遗传信信息。。转座子子的特特征性性结构构是它它的末末端具具有反向重重复序序列，而两两侧宿宿主DNA的邻接接末端端是短的同同向重重复序序列。当考查查DNA序列时时，这这种结结构类类型是是判断转转座子子的鉴鉴别特特征，并且且是这这种序序列起起源于于转座座作用用的初初步证证据。。转座因因子IS线型宿宿主DNA插入后后引起起目标标序列列产生生同向向重复复Tn10插插入入环状状DNA内内Tn10再再移移动时时可能能从两两个方方向移移动，，产生生新的的转座座子Nonreplicativetranspositiondescribesthemovementofatransposonthatleavesadonorsite(usuallygeneratingadouble-strandbreak)andmovestoanewsite.Replicativetranspositiondescribesthemovementofatransposonbyamechanisminwhichfirstitisreplicated,andthenonecopyistransferredtoanewsite.复制转转座非复制制转座座转座产产生的的效应应Recombinationbetweendirectrepeatsexcisesthematerialbetweenthem同向重重复序序列之之间重重组造造成重重复间间序列列缺失失转座产产生的的效应应Recombinationbetweeninvertedrepeatsinvertstheregionbetweenthem.反向重重复序序列之之间重重组造造成重重复间间序列列倒位位Transpositionisinitiatedbynickingthetransposonendsandtargetsiteandjoiningthenickedendsintoastrandtransfercomplex.转座机机制：：在转转座酶酶作用用下，，在转转座子子和目目标序序列的的反式式位点点产生生缺刻刻，转转座子子通过过末端端联会会插入入到目目标序序列中中，形形成共共合体体Transpositionmayfuseadonorandrecipientrepliconintoacointegrate共合体体.Resolutionreleasestworeplicons复制子子,eachcontainingacopyofthetransposon.复制转转座：：在共共合体体分解解时转转座子子产生生两个个拷贝贝缺刻重组复制断裂重重接则则造成成非复复制转转座NonreplicativetranspositionproceedsbybreakageandreunionEachcontrollingelementfamilyhasbothautonomousandnonautonomousmembers.Autonomouselementsarecapableoftransposition.Nonautonomouselementsaredeficientintransposition.Pairsofautonomousandnonautonomouselementscanbeclassifiedin>4families.Controllingelements控控制因子子inmaizeformfamiliesoftransposons可用于转座座子插入突突变自主转座子子非自主转座座子Theroleoftransposableelementsinhybriddysgenesis杂种不育带有P因子子P品系的精精子DNA释放到卵卵细胞中时时，精子基基因组上的的P因子被被激活，发发生转座，，引起突变变TheretrovirallifecycleproceedsbyreversetranscribingtheRNAgenomeintoduplexDNA,whichisinsertedintothehostgenome,inordertobetranscribedintoRNA.Theretrovirus反转录录病毒lifecycleinvolvestranspositionlikeeventsLTRisanabbreviationforlong-terminalrepeat.自然界中的的其它基基因转移与与重组现象象一、接合作作用(conjugation)二、转化(transformation)和和转导(transduction)三、转染(transfection)四、免疫分分子的多样样性接合作用：：当细胞与与细胞、或或细菌通过过菌毛相互互接触时，，质粒DNA就可以以从一个细细胞（细菌菌）转移至至另一细胞胞（细菌））的方式。。一、接合作作用(conjugation)转化：通过自动获获取或人为为地供给外外源DNA，使细胞胞或培养的的受体细胞胞获得新的的遗传表型型。二、转化(transformation)转导：当病毒从被被感染的供供体细胞释释放出来，，再次感染染另一受体体细胞时，，发生在供供体细胞与与受体细胞胞之间的DNA转移移及基因重重组即为转转导作用转导(transduction)三、转染(transfection)转染是转化化的一种特特殊形式。。由transformation（转转化）和infection（感染染）两词构构成。原指将噬菌菌体、病毒毒或以其为为载体构建建的重组子子导入受体体细胞的过过程。通过感染方式将外来DNA引入宿主细细胞，并导导致宿主细细胞遗传性状改改变的过程称为为转染。将任何类型型DNA转转移至动物物细胞内的的过程均可可叫转染。。思考题解释:recombination;single-strandassimilation;同源重组在在生命活动动和基因工工程中的作作用是什么么?同源重组的的断裂重接接模型的基基本内容是是什么?(提示:考考虑断裂和和重接的机机制)位点专一性性重组有哪哪些主要特特点?基因因工程中是是如何利用用其原理进进行基因克克隆的?转座子的特特征性结构构是什么?转座可产生生哪些的生生物学或遗遗传学效应应?自然界中存存在哪些基基因转移与与重组现象象?（至少少写出5种种以上）试比较同源源重组、位位点专一性性重组、转转座重组和和人工重组组间的异同同点。四、免疫分分子的多样样性◘体液免疫反反应免疫球蛋白白（Immunoglobulin）：高度特异性性、庞大多多样性L链（214aa））－－VL、CLκ和λ两种种，对一个个Ig唯一一H链（426aa））－－VH、CH1、CH2、CH3恒定区的序序列有γ、α、μ、δδ和ε五种种类型VL和VH内有高变区区－－真正抗原结结合部位负责抗体分分子对抗原原的识别互补决定区区－－CDRIgG、IgA、、IgM、、IgD和和IgE（（人体））免疫球蛋白白基因的组组织◘Ig基因有有三个独立立的基因家家族分别编编码两个轻轻链（κ和λ）、、一个重链（（小鼠6、16和和12号染染色体）◘轻链基因家家族的组成成：L、V、J、C四类基因因片段L－－leadersegmentV－－variablesegmentJ－－jioningsegmentC－－constantsegment◘重链家族：：L、V、、D、J、、C五类片片段D－－diversitysegment高高变区◘J和C之间间有增强子子◘种系中基因因数目变动动较大FamilyVGenesCGenesManMouseManMouseLambda<3002>64Kappa<300~100011Heavy~300>100098人的重链基基因簇包括括了所有组组织重链的的基因信息息（重链恒恒定区九种种C片段、、两个假基基因）λ家族V基基因后跟随随着几个以以J片段作作为前导的的C基因k家族（人人和老鼠））的组成：：V基基因（人<300、、鼠～1000）、5个J（一个个假基因））、1个个C基因因免疫球蛋白白基因形成成过程中的的重组机制制◘除淋巴细胞胞外，所有有细胞免疫疫球蛋白基基因簇的结结构都是相同的－－－种系结构构◘骨髓干细胞胞在分化为为成熟B淋淋巴细胞时时出现免疫疫球蛋白基因的体细细胞重排◘即－－淋巴巴细胞中重重组产生活活性基因使使免疫系统统为基因组组的改变提供供了广泛的的基础－－抗体分分子的多样样性1、轻链基基因V和J片段的重重组a）λ链的重组组◘每个C片段段前有J跟随◘只发生一次次重组在V和J-C之间(V和J的的重组)b）κ链的重组◘κ基因簇只只有一个C◘V与C之间间5个J（一个假基基因）◘用到的每个个J都可以成成为V的外元终终端整合J右边边的J片段段作为含子子被剪切整合J左边边的每个J片段都会会缺失掉◘重链的可变变区由V和J基因及第三个个D基因片段段编码◘重链的可变变区重组有两两个阶段D-J重组组、VH和DJ重组组2、重链基基因V、D和J片段段的重组◘一一个指定的的B淋巴细细胞产生λλ、κ其中中之一轻链链同重链结结合◘轻链中表现现为同型性性项斥（isotypicexclusion））往往只有κ链基因重重组失败，，才发动λλ链基因重重组◘抗抗体中大部部分轻链是是κ链，λλ链往往占占少部分人类有约60%的轻轻链是κ链链，约40%为λ链链。老鼠有有95%的B细胞表表达κ类型型的轻链◘单特异性－－单个B细胞只产产生一种抗抗体基因◘淋巴细胞为为二倍体－－－H、κ和λ都有有两个等位位基因－－－重组表现为为等位基因因排斥（allelicexclusion）3、重组的的