南农-生物技术制药-第二章基因工程药物课件

第二章基因工程与药物蛋白生产

GeneticEngineeringinMedicineandIndustry第二章基因工程与药物蛋白生产

GeneticEngineeSometherapeuticproductsforusedinhumansSometherapeuticproductsforGenentech公司1976年，27岁的风险投资人RobertSwanson与UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！Genentech公司1976年，27岁的风险投资人RobGenentech的骄人业绩1976Genentech创立1977首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素1978克隆了人胰岛素基因1979克隆了人生长激素素基因1980公司上市，募集$35million1982第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给Lilly公司）1984第一个VIII因子，转让给CutterBiological1985第一个自己生产的产品（人生长激素）1987生产组织纤溶酶原激活剂（tPA）1990生产interferon1

1990与瑞士Roche医药公司合并（$2.1billion）Genentech的骄人业绩1976Genentech创立1美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）中文名称商品名称英文名缩写开发公司胰岛素HumulinNovolinHumalogInsulinlispoinsulinLillyNovoNordiskLilly人生长激素ProtropinHumatropeNutropinAQrhuGHGenentechLillyGenentech干扰素IntronAReferonAAvonixBetaseronActimmuneAlferon-NrhuIFNa2brhuIFNa2arhuIFN

rhuIFN1brhuIFN1brhuIFNa3ScheringRocheBiogenChironGenentechInterferonScience美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）中文名称商品名称白细胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒细胞集落刺激因子NeupogenrhuG-CSFAmgen粒细胞巨噬细胞集落刺激因子LeukinerhuGM-GSFImmunex红细胞生成素EpogenProcritrhuEPOAmgenOrtho组织溶纤原激活剂ActivaserhuTPAGenentech生长激素SerostinsomatotropinSerono促生长素NutropinSaizenGenotropinNorditropinBio-TropinsomatopinGenentechSeronoPharma/UpjohnNovoNordiskBiotechGeneral白细胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒细胞抗血友病因子VIIIKogenateRecombinateFactorVIIIBayerBaxter葡萄脑苷脂酶CerezymeglucocerebrosidaseGenzyml脱氧核糖核酸酶PulmozymedomaseGenentech乙型肝炎疫苗RecombivaxHBEngerixBComraxHepatitisBvaccineMerckSmithKlineMerck甲型肝炎疫苗HavrixHepatitisBvaccineSmithKline抗血友病因子VIIIKogenateFactorVIII体内用单克隆抗体ReoproOrthoOKT-3OncoScintCR/OVOncoScintOC103OncoScintCR103ProstascintMAB,bloodclotsMAB,KidneysupMAB,diaginjectCentocorOrthoBiotechCytogenCytogenCytogenCytogen鼠单克隆抗体PanorexMurineMABGlaxoWelcome1体内用单克隆抗体ReoproMAB,bloodclots中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）药品名缩写开发生产公司批准时间适应症rhuINFa1b(外用）rhuINFa1brhuINFa2a长春生研所上海生研所深圳兴科长春生研所长生药业三生药业1989试1996正1996正1996正1997正1997正病毒性角膜炎HBV,HCVHBV,HCV尖锐湿疣，疱疹等HBV,HCVHBV,HCVrhuIFNa2b新大洲药业里亚哈尔华立达安科华新1997正1996正1997正1997试1997试HBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCV中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）药品名缩写开发rhuINF

上海生研所克隆丽珠生物工程1994试1995试1995试类风湿类风湿类风湿rhuIL2长春生研所长春药业四环制药华新三生药业深圳兴科中华合通金丝利康利制药1997正1997正1997正1997正1997正1997正1995试1995试1995试癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗rhuINF上海生研所1994试类风湿rhuIL2rhuG-CSF九源1997试化疗生白血病rhuGM-CSF特宝1997试化疗生白血病rSK医大实业1996试心梗溶栓rhuEPO华欣永铭维沃1997试1997试再生障碍性贫血再生障碍性贫血bFGF（外用）珠海东大1996试创伤，烧伤rhuG-CSF九源1997试化疗生白血病rhuGM-CSF一、基因工程与医药卫生1、生产基因工程药品

（1）传统的某些药品（如动物激素）生产：控制某种物质合成基因转基因“工程菌”基因工程药品基因表达产物基因工程发酵分离提取从动物组织中提取，生产量小，价格昂贵。（3）基因工程生产的药品重组人生长激素重组人白细胞介素重组人干扰素重组人胰岛素发酵罐（2）基因工程方法生产药品的方法：一、基因工程与医药卫生1、生产基因工程药品控制某种物质合成基1313二、基因工程菌大肠杆菌表达系统一：大肠杆菌表达外源基因的优势二大肠杆菌表达载体的基本组成三常用的大肠杆菌表达载体四真核基因在大肠杆菌中的表达五大肠杆菌表达真核基因存在的问题六基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制七.人胰岛素的生产方法二、基因工程菌大肠杆菌表达系统一：大肠杆菌表达外源基因的优势一：大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin)periplasmheterogous一：大肠杆菌表达外源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的劣势pe二大肠杆菌表达载体的基本组成一个良好的大肠杆菌表达载体：有抗菌素抗性基因决定载体拷贝数的复制起点(ori)供外源基因插入的多克隆位点。参与控制转录与翻译的必不可少的原件外源基因在原核寄主细胞中表达,它的编码结构必须是连续的,不间断的,处于寄主启动子有效控制下。二大肠杆菌表达载体的基本组成一个良好的大肠杆菌表达载体：外1启动子可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件1)强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上2)应能呈现出一种低限的基础转录水平3)应该是诱导型的,能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。Accountforinducible1启动子Accountforinducibleb:如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子,那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。2终止子

a

:如果在克隆基因编码区的3末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子

c:转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性,大大提高蛋白质产物水平。b:如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子,那在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子,阻止核糖体跳跃(skipping)现象。大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA,当其后连上一个U而形成四联核苷酸的情况下,转译终止效率便会得到进一步加强。在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子,阻止3转译起始序列mRNA的5末端之独特的结构特征,是决定mRNA转译起始效率的主要因素。在构建外源基因的高效表达载体时,需认真选择有效的转录起始序列。未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构initiationfactorconservedsequenceuniversial3转译起始序列mRNA的5末端之独特的结构特征,是决定4、reportergene其编码产物可被快速测定的功能单元。追踪某些特定的DNA结构(重组质粒)是否已经导入寄主细胞同任何一种目的启动子连接,其表达活性可作为检测启动子功能的依据。usageβ－半乳糖苷酶基因lacZ、碱性磷酸酶基因、荧光素酶基因(luciferase)基因、半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性(乙酰转移酶)基因(cat)四环素抗性基因(tetr)alkalinephosphatase4、reportergene其编码产物可被快速测定的功能单三常用的大肠杆菌表达载体启动子广泛使用的大多数质粒表达载体启动子λ噬菌体的PL启动子大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子色氨酸操纵子trp启动子pBR322质粒的beta－内酰胺酶启动子LactoseOperon三常用的大肠杆菌表达载体启动子广泛使用的大多数质粒表达载体图1-1在大肠杆菌中基因表达的3个重要信号启动子核糖体结合位点基因终止子DNARNA转录核糖体结合mRNA位点图1-1在大肠杆菌中基因表达的3个重要信号启动子核糖图1-2基因转录起始位点上游序列的比较TTGACATATAATPu>Py-35区-30-70正调控区-20负调控区+1-10区GC区….CAAT区TATAAATPuAPy-40-110+1-20-30增强子CCGCCC或GGGCGG或GGCCAATCTTA原核真核图1-2基因转录起始位点上游序列的比较TTGACATATA图1-3通过表达载体在大肠杆菌中被表达PRTTPRTPRmRNA蛋白质表达载体外源基因将外源基因插入限制性酶切位点转化大肠杆菌图1-3通过表达载体在大肠杆菌中被表达PRTTPRTPRm图1-4杂交基因的构建和融合蛋白的合成PRTPRT插入外源基因｝ATATTA正确融合N端C端不正确融合外源基因不被翻译表达ATATTA

GGAGCTGGAGC融合蛋白亲和层析法纯化化学试剂除去大肠杆菌肽段图1-4杂交基因的构建和融合蛋白的合成PR图1-5在大肠杆菌中表达外源基因长遇到的问题翻译转录PRTT转录大肠杆菌不能切除内含子转录提前终止图1-5在大肠杆菌中表达外源基因长遇到的问题翻译转录P图1-6真核细胞表达载体常用的4种启动子P半乳糖转录GAL10P甲醇转录乙醇氧化酶基因（a）GAL启动子（b）AOX启动子（c）葡萄糖水解酶启动子（d）纤维二糖水解酶启动子P纤维素转录纤维素二糖水解酶基因P淀粉转录葡萄糖淀粉酶基因木糖不转录图1-6真核细胞表达载体常用的4种启动子P半乳糖转录GAL四真核基因在大肠杆菌中的表达三种表达部位各有不同的优缺点//

而且对克隆基因表达产物的制备有很大关系。在细胞质中表达在细胞周质中表达以分泌到细胞外的形式表达。1外源基因在大肠杆菌中表达蛋白质位置cytoplasmperiplasm四真核基因在大肠杆菌中的表达三种表达部位各有不同的优缺点1)细胞质中表达expressedincytoplasm包含体是存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构。在表达中应尽可能限制包含体产生,并促进形成天然三维结构的蛋白质。多采用与分子伴侣共表达的方法,可能是增加外源蛋白的可溶性和折叠能力的一种有效途径。insolublechaperon1)细胞质中表达expressedincytopl周质:指大肠杆菌一类G-菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。在大肠杆菌中,已成功的使用了各种不同类型信号肽,将细胞质中蛋白的蛋白质转运至周质。周质中表达外源蛋白质优点:A:周质中蛋白质种类少,周质中表达的外源蛋白质能够被有效的浓缩和纯化。b:周质氧化环境有利于蛋白质按正确的方式折叠c:在周质中蛋白质降解不广泛。来自原核、真核的外源基因都成功的在大肠杆菌细胞周质中实现了有效表达。2)周质中表达expressedin

periplasm周质:指大肠杆菌一类G-菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结3)分泌表达使在大肠杆菌中表达的外源蛋白质分泌到胞外培养基中进行分离纯化,这种研究思路称为外源蛋白质的分泌表达。3)分泌表达目的蛋白稳定性高:目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整将外源基因与大肠杆菌信号肽编码序列重组在一起进行分泌表达,其N端的甲硫氨酸残基可在信号肽剪切过程中被有效除去这些真核基因在大肠杆菌中表达时,蛋白质甲硫氨酸残基往往不能被切除。分泌表达优点

:重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中,其稳定性大约是在细胞质中的10倍许多真核生物成熟蛋白N端不含有甲硫氨酸残基。intactexcise目的蛋白稳定性高:将外源基因与大肠杆菌信号肽编码序列重组在一外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达;外源基因分泌表达的表达率通常要比包涵体形式低很多分泌表达缺点相对其它生物细胞,大肠杆菌蛋白分泌机制不健全。目前产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌工程菌很少Perfectsound外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达;分泌表达缺点分泌型重组蛋白具有较高比例正确构象，对蛋白酶不敏感蛋白质的分泌机制原核细胞周质中有多种分子伴侣,可阻止分泌蛋白随机折叠分泌至细胞周质或培养基中重组蛋白很少形成分子间二硫键与包涵体相比randomSulferinnerouter分泌型重组蛋白具有较高比例正确构象，蛋白质的分泌机制原核细胞重组大肠杆菌--目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表达系统构建有些G-能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白

,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶,导致细菌内外膜的通透性增大。将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化受体细胞完全分泌型受体细胞转化permeabilitybacteriocin重组大肠杆菌--目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表达系统构建二种类型由报告基因编码序列和另一个基因启动子及其它的调节序列构成。用于研究启动子功能及调控作用分子机理。由一种异源蛋白质基因编码序列同寄主细胞诱导型启动子构成。用于生产新型融和蛋白。2融和蛋白质表达将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起,并作为一个开放型阅读框架进行表达。这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。

2.1融和基因二种类型2融和蛋白质表达将外源基因与受体菌自身的蛋白质编attention外源基因应装在受体蛋白编码基因下游,为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下,并不需要完整的受体结构基因2.2融和蛋白的表达策略融合蛋白表达质粒的构建原则受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要,它直接决定融合蛋白的裂解。两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架在DNA水平上，人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点,可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白Baseonconsistentattention外源基因应装在受体蛋白编码基因下游,为使克隆外源基因有效转译有效转译：取决于核糖体的结合位点,

受到编码区起点核苷酸序列影响。可使蛋白质产物稳定,免受寄主胞内酶的降解作用,因此可以得到较高的产率。可能构成一种信号肽指导大肠杆菌蛋白质分配到细胞的正确位置。能够使用亲和层析技术分离纯化融合蛋白。2.3表达融合蛋白质的优点ribosome使克隆外源基因有效转译2.3表达融合蛋白质的优点ribos3整合型异源蛋白的表达工程菌在没有选择压力存在下,可以连续培养而不丢失目的基因表达盒,

这对以改良物种遗传性状为目的的基因工程特别有意义3.1整合形式表达目的蛋白的特点目的基因稳定表达目的基因表达率低整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA一起复制,

在大多数情况下相当稳定单拷贝整合的目的基因表达率受到限制,此时可通过强化表达元件加以补偿replicate/stabilitySpecies/improvementintensify3整合型异源蛋白的表达工程菌在没有选择压力存在下,可以连转位因子依赖型的体内重组同源序列依赖型的体内重组3.2DNA体内重组的基本原理转位因子依赖型的体内重组同源序列依赖型的体内重组3.2D生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子,不同生物种群拥有结构不同的转位因子噬菌体G片段(G-Fragment)原核微生物插入顺序(IS)真核微生物转座子(Tn、Ty)高等植物可移动因子(Ac、Ds)高等动物跳跃基因(mobilegene)转位因子transposon转位因子依赖型的体内重组生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子,噬转位因子的结构transposonpalindromerepressorinversionregion转位因子的结构transposonpalindromerep整合形式整合形式

同源整合同源序列依赖型的体内重组同源整合一般地说,距离越远、长度越长、同源性越高,重组的频率也就越高,反之亦然。同源整合

1基因结构存在很大差异。大多数真核基因含有内含子，细菌细胞中没有除去内含子机制；五大肠杆菌表达真核基因存在的问题2转录信号不同。真核基因转录的mRNA分子不具有结合细菌核糖体所必须的SD序列。细菌RNA聚合酶不能识别真核生物启动子3mRNA的分子结构有所差异。绝大多数真核mRNA分子的3末端有poly(A)尾巴，在5末端有一个帽结构。影响mRNA在细菌中的稳定性及与细菌核糖体相结合的能力，阻止正常的转录和转译。4真核生物的蛋白质有些是通过前体分子加工来的。在细菌中不存在这种修饰作用。5细菌的蛋白酶可以识别和降解真核生物的蛋白质产物1基因结构存在很大差异。大多数真核基因含有内含子，细菌细胞中结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失六基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制1工程菌遗传不稳定性表现形式基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳性,具有下列两种表现形式分配不稳定性整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸segregativeinstabilitydomainDeletionregionrearrange结构不稳定性六基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制1工程受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解2工程菌遗传不稳定性的产生机制外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应，关闭合成途径，启动降解重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配是重组质粒逃逸的基本原因受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排Deletion受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解2工程以构建稳定性高质粒:

将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中:其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞3改进载体、受体系统正确设置载体上的多克隆位点:禁止DNA片段插在稳定区内将受体细胞的致死性基因安装在载体上，并构建条件致死性的相应受体系统。

eg:大肠杆菌的ssb基因(DNA单链结合蛋白编码基因)以构建稳定性高质粒:3改进载体、受体系统正确设置载体上根据载体上的抗药性标记,向培养系统中添加相应的抗生素(药物和食品生产时禁止使用抗生素)4施加选择压力根据载体上的营养缺陷型标记,向培养系统中添加相应的营养组份(培养基复杂,成本较高)correspond根据载体上的抗药性标记,向培养系统中添加相应的抗生素(药使用可控型启动子控制目的基因定时表达及表达程度5控制目的基因过量表达使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数(优化基因工程菌的培养工艺)培养基组成:限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度:较低培养温度有利于重组质粒的稳定replicon使用可控型启动子控制目的基因定时表达及表达程度5控制目的1982年,美国ElyLiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素,成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年,Novo公司,成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年,Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。七.人胰岛素的生产方法基因工程法生产人胰岛素体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别具有无免疫原性、注射吸收迅速。充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。potentialimmunogenic1982年,美国ElyLiLi公司首先使用重组大肠杆菌SHSHSHSHCCCC

COO_SHSHN

CCS.S.Pre-pro-insulinSSSSCCCC

COO_SSCCS-SPro-insulinNSSSSCCCCCOO_CCS

SS-SinsulinNSHSHSHSHCCC基因工程菌的构建战略：化学合成A链和B链的编码序列表达重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和B链分别表达法1synthesis基因工程菌的构建战略：化学合成A链和B链的编码序列表达重组人南农-生物技术制药--第二章基因工程药物课件由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低,通常只有10%-20%.采用这条工艺路线生产正确配对率较低,采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。A链和B链分别表达法生产技术评价为了进一步降低生产成本,美国ElyLiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对基因工程菌的构建战略

人胰岛素原表达法proinsulin基因工程菌的构建战略人胰岛素原表达法proinsulin表达产物后处理路线B链中第22位上的Arg和第29位上的Lys,由于良好折叠的原因,对胰蛋白酶不敏感表达产物后处理路线在人胰岛素原表达工艺中,由于C肽的存在,胰岛素原能形成良好的空间构象,三对二硫键的正确配对率也相应提高,折叠率高达80%以上。生产技术的评价目前美国ElyLiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。虽然这条工艺路线不比AB链分别表达法更为简捷,而且还要使用两种高纯度的酶制剂,但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷,使得每克最终产品的成本仅50美元。在人胰岛素原表达工艺中,由于C肽的存在,胰岛素原能形南农-生物技术制药--第二章基因工程药物课件

一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与beta-內酰胺酶基因拼接,beta-內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性,为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。分泌型重组人胰岛素表达法上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌beta-半乳糖苷酶基因拼接的方法,所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强,但不能分泌,只要以包涵体的形式存在于胞质中。一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素什么叫蛋白质工程指通过改造与蛋白质相应的基因中的碱基顺序，或设计合成新的基因，将它克隆至受体细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质（酶）技术。这是一门从改变基因入手，定做新的蛋白质的技术。故有人将其称为“第二代基因工程”

1983年，美国生物学家额尔默首先提出了“蛋白质工程”的概念。蛋白质工程和基因工程蛋白质类药物什么叫蛋白质工程蛋白质工程和基因工程蛋白质类62

1、蛋白质工程的理论设计：包括活性设计、专一性设计、框架（构象）设计等。由于对蛋白质的结构与功能之间的关系认识还不系统，目前的蛋白质设计仅仅是对天然蛋白质的修饰。如：异常血红蛋白的氨基酸取代去羧基端胰岛素等。

蛋白质工程的一般技术根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质。

蛋白质工程的一般技术根据需要合成具有特定氨基酸序列和632、基因修饰——点突变法蛋白质结构的改变通过基因修饰来完成基因修饰的方法：⑴基因的全化学合成按照所需蛋白质的氨基酸顺序，先后合成结构基因、转录的起始信号及终止信号、限制酶切位点等核酸片段，然后用连接酶将各片段连接起来，通过基因工程转移到细菌中进行目标蛋白质的表达。目前用此法已合成了：人血细胞干扰素、胰岛素、生长激素释放抑制激素等基因。

2、基因修饰——点突变法64调节基因启动基因结构基因终止基因连接酶完整基因调节基因启动基因结构基因终止基因连接酶完整基因65⑵基因直接修饰法将连接于质粒上的某一蛋白质的基因用酶法去除一小段，然后用合成的核苷酸片段接上，从而获得新的突变体。已修饰过的酶有：内酰胺酶、酪氨酰tRNA合成酶、二氢叶酸还原酶等酶蛋白。⑵基因直接修饰法66限制性内切酶外源DNA限制性内切酶退火重组质粒转化受体细胞筛选表达带重组体的细胞目的产物质粒目的基因酶切割蛋白基因核苷酸片段新突变质粒限制性内切酶外源DNA限制性内切酶退火重组质粒转化受体细胞筛67⑶盒式突变

1985年Wells提出的一种基因修饰技术，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。蛋白质工程的运用蛋白质或肽类药物的改造和新药的研制

⑶盒式突变68酶切割蛋白基因核苷酸片段新突变质粒同时获得多个突变体酶切割蛋白基因核苷酸片段新突变质粒同时获得多个突变体69图3-1胰岛素的分子结构和从前胰岛素原合成胰岛素的简要过程30个氨基酸B链21个氨基酸A链胰岛素利于重组生产的特点前导序列BCA前胰岛素原（胰岛素原=BCA——无前导序列）胰岛素∣S∣S∣∣S∣S∣BA剪切-S-S--S-S-LBAC自发折叠蛋白质工程的应用图3-1胰岛素的分子结构和从前胰岛素原合成胰岛素的简要过程370图3-2由人工合成的A,B链的基因合成重组胰岛素lac启动子lacZ’A基因运载人工合成的A基因的载体B基因运载人工合成的B基因的载体(a)人工合成的基因(b)合成胰岛素蛋白ABmetβ-半乳糖苷酶片段A链胰岛素纯化A链和B链二硫键连接metB链溴化氰处理pBR322pBR322转化的大肠杆菌合成AB融合蛋白图3-2由人工合成的A,B链的基因合成重组胰岛素lac启动71图3-3重组促生长素抑制素的合成lac启动子lacZ’人工促生长素抑制素基因metβ-半乳糖苷酶片段促生长素抑制素融合蛋白转化大肠杆菌促生长素抑制素（14氨基酸）溴化氰图3-3重组促生长素抑制素的合成lac启动子lacZ’人工促72图3-4重组生长素的合成密码子01911912424024HaeⅢ保留除去（a）生长素cDNA片段的准备过程（b）表达024合成前导序列191cDNAlac启动子插入表达载体合成生长素转化大肠杆菌图3-4重组生长素的合成密码子01911912424024H73图3-5凝血因子Ⅷ基因及其翻译产物外显子（26）内含子（25）（a）凝血因子Ⅷ基因（b）凝血因子Ⅷ的翻译后的加工初级翻译产物（2351个氨基酸）ABCAC成熟的凝血因子Ⅷ蛋白加工图3-5凝血因子Ⅷ基因及其翻译产物外显子（26）内含子（274重组凝血因子Ⅷ合成的几种方法在哺乳动物细胞中合成（仓鼠细胞）利用活体动物生产（猪）利用表达载体Ag启动子SV40聚腺甘酸化序列凝血因子Ⅷ的cDNA导入仓鼠细胞重组蛋白重组凝血因子Ⅷ合成的几种方法在哺乳动物细胞中合成（仓鼠细胞）75干扰素的合成干扰素分子结构干扰素生产车间干扰素的合成干扰素分子结构干扰素生产车间76图3-7利用分离的病毒壳体蛋白作疫苗的原理分离的病毒壳体蛋白壳体蛋白的特异抗体注射到血液循环抗体包围整个病毒被完整病毒感染图3-7利用分离的病毒壳体蛋白作疫苗的原理分离的病毒壳体77图3-8重组牛痘病毒可能用途的基本原理乙型肝炎表面抗原基因牛痘病毒启动子重组牛痘病毒基因组牛痘病毒乙型肝炎病毒抗乙型肝炎抗体抗牛痘病毒抗体注射重组牛痘病毒颗粒到血液循环免疫系统合成抗牛痘病毒和乙型肝炎病毒的抗体图3-8重组牛痘病毒可能用途的基本原理乙型肝炎表面抗原基因78表3-2在重组牛痘病毒中表达的外源基因

基因恶性疟原虫表面抗原流行性感冒病毒衣壳蛋白狂犬病病毒G蛋白乙型肝炎主要表面抗原单纯疱疹糖蛋白人类免疫缺陷病毒（HIV）表面蛋白水泡性口炎衣壳蛋白仙台病毒蛋白BACK表3-2在重组牛痘病毒中表达的外源基因7980（inclusionbodiesIBs)基因工程包含体的纯化基因工程菌培养液不同表达形式的前处理胞外分泌型表达：离心,收集液相→浓缩→纯化。胞内表达：胞内可溶性表达：离心,收集菌体→细胞破碎→离心，收集上清→纯化胞内周质表达：离心,收集菌体→低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物→离心,收集上清液→纯化。不溶性包涵体：离心,收集菌体→细胞破碎→离心,收集沉淀→包涵体洗涤→目标蛋白变性溶解→复性→纯化。80（inclusionbodiesIBs)基因工程包81外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白产物占菌体总蛋白外源蛋白的积累人胰岛素50%形成包涵体β-丙酰胺酶20%在细胞间区γ-人体干扰素25%形成包涵体凝乳酶原形成包涵体牛生长激素>30%形成包涵体β-内酰胺酶形成间区包涵体人胰岛素原5%~26%形成包涵体81外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白产物占菌体总蛋白外源蛋白的82包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；②蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；③蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；④表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态⑤蛋白质自身不稳定。包含体的构成82包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等83基因工程包涵体的纯化方法收集菌体细胞细胞破碎包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性包含体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。83基因工程包涵体的纯化方法收集菌体细胞细胞破碎包涵体的洗涤841）包涵体的洗涤细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。841）包涵体的洗涤85

2）目标蛋白的变性溶解

包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。常用变性剂：▲

5-8mol/L盐酸胍和6-8mol/L尿素,作用：破坏离子间相互作用；▲

表面活性剂如1-2％SDS，作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。▲

PH>9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。852）目标蛋白的变性溶解86原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。复性方法：稀释法除变性剂－加入大量水或缓冲液。膜分离法除变性剂－透析、超滤、电渗析。层析法：凝胶层析，高效疏水层析3）目标蛋白的复性86原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高87

蛋白质复性影响因素：变性剂浓度目标蛋白浓度；pH和离子强度；氧化还原条件。

还原剂：

二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽；氧化剂：氧化型谷胱甘肽;碱性下通空气。

复性区

多聚物生成区

絮凝沉淀区盐酸胍浓度mol/L红血球碳酐酶复性操作中变性剂与蛋白质浓度对复性的影响蛋白质浓度mol/L87蛋白质复性影响因素：盐酸胍浓度mol/L红血球碳酐酶复88肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在E.coli中的高密度发酵过程中以两种形式表达：◆细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目标蛋白的30%）◆无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的70%）。悬浮破壁PBS洗涤离心硫铵沉淀亲和层析阳离子交换层析溶解复性亲和层析湿菌体发酵液干净菌体上清液包涵体纯品活性检测破壁液离心离心液洗涤举例：TRAIL的分离纯化88肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在E.coli中的高密度891.包涵体的洗涤①粗制包涵体用50mM磷酸盐缓冲液，含150mMNaClpH=7.4(1:3w/v)洗涤2-3次；②用含有1MNaCl的磷酸缓冲液洗涤1次(1:3w/v)，将粘附其表面的大部分蛋白及水溶性杂质除去；③用6M尿素及0.5%TritonX-100联合洗涤1次(1:3w/v)，去除另一些杂蛋白，这时得较纯包涵体（纯度达80%左右）；④用SDS电泳检测纯度。2.包涵体的变性溶解①洗涤后包涵体用含有30mMDTT及5mol/l盐酸胍的Tris缓冲液pH=8.0(1:5w/v)变性溶解→室温搅拌2h，95%以上的包涵体可被溶解；②离心，13000rpm，20min→弃沉淀得到溶解液。891.包涵体的洗涤2.包涵体的变性溶解903.包涵体复性（间歇式流加稀释复性法）以含DTT和ZnSO4的Tris-HCl为复性缓冲液，再添加0.4ML-Arg，0.5M尿素，0.5MNaCl作为蛋白聚集抑制剂，变性溶解液可多次流加，每次流加的时间是以上一次流加蛋白已达到部分复性为准。本实验中，流加间隔时间确定为90min，每次流加浓度为150mg/L，变性液流加次数可高达6次，最终浓度可达到1mg/ml，4℃缓慢搅拌一段时间，对50mMTris-HCl，300mMNaCl，0.1M尿素及0.2mMZnSO4混合液透析过夜，透析后离心除去复性过程中聚集的蛋白，超滤浓缩（也可用硫酸铵沉淀进行浓缩）得复性蛋白液。903.包涵体复性（间歇式流加稀释复性法）915.复性后纯化复性浓缩后蛋白金属亲和层析吸附洗涤：40mmol/L咪唑，洗除非特异性吸附的杂蛋白洗脱：100mmol/L咪唑目标蛋白

纯度达95%以上（由SDS和RP-HPLC鉴定）收率75%915.复性后纯化92包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）92包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）93

来自发酵罐的菌体经过离心除去培养液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、EDTA和促进剂以除去脂蛋白和未破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进行变性溶解，溶解剂为6mol/L盐酸胍。溶解的同时通入空气氧化以打断错误连接的双硫键。离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲液进行透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀用离心除去。包含体产物分离工艺

（牛生长激素分离提取）93来自发酵罐的菌体经过离心除去培养液后

质谱在蛋白质、多肽分析中的应用

质谱在蛋白质、多肽分析中的应用质谱在蛋白质、多肽分析中的应用分子量的测定蛋白质、多肽纯度的鉴定肽质量指纹谱肽序列测定技术蛋白质的翻译后修饰鉴定其他蛋白质鉴定质谱在蛋白质、多肽分析中的应用分子量的测定蛋白质鉴定分子量的测定用ESI-MS和MALDI-TOF-MS测定蛋白质和多肽的分子量，精确度可达0.1％～0.01％，这远比其它方法(如SDS、凝胶过滤、超离心等）精确。正确测定蛋白质的分子量，可以提供很多信息，如确定分子大小，从氨基酸组成分析的结果求得准确的氨基酸组成，验证已测定的一级结构是否正确等。分子量的测定用ESI-MS和MALDI-TOF-MS测定蛋白分子量测定实例采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，高效凝胶过滤色谱以及电喷雾离子化质谱三种方法对新发现的一种蛋白质（来源于福建尖吻蝮蛇蛇毒,是一种具有类凝血酶活性的弱酸性蛋白质）的分子量进行了测定。测定方法分子量非还原SDS-PAGE26.2kDa(二硫键未打开)还原SDS-PAGE29kDa(二硫键被还原)HPGFC24.5kDaESI-MS30298Da分子量测定实例采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，高效凝胶过滤色谱以及电分子量测定实例天花粉蛋白的一级结构测定，在86年时曾出现差错，当时测定的结果表明它是由234个氨基酸残基组成，分子量为25682Da。90年，我们发现结构测定有误，重新修正了其一级结构。它应由247个氨基酸残基组成，正确分子量为27141.32Da。93年，用MALDL-TOF-MS和ESI-MS测定了天花粉的分子量。分子量测定实例天花粉蛋白的一级结构测定，在86年时曾出现差错天花粉蛋白（TCS）的MALDI-TOF-MS的分子量图谱天花粉蛋白（TCS）的MALDI-TOF-MS的分子量图谱天花粉蛋白（TCS）的ESI-MS的分子量图谱天花粉蛋白（TCS）的ESI-MS的分子量图谱分子量测定实例β-苦瓜子蛋白的一级结构计算(包括糖部分)的分子量为29156Da，用MALDI-TOF-MS测定的分子量为29074Da，二者相差82Da。这种差异可能是个别氨基酸测定的差错造成，估计整个结构测定不会有大错误。分子量测定实例β-苦瓜子蛋白的一级结构计算(包括糖部分)的分分子量测定实例β-苦瓜子蛋白其C端用羧肽酶的方法测定为-S-T-A-D-E-N，但尚不能完全确定。苦瓜子蛋白在190位有一个色氨酸，我们用BNPS-Skatole降解色氨酸，降解后的肽用HPLC分离，得到含有C端的一段小肽(59个氨基酸残基)用MALDI-TOF-MS测定其分子量为6443与计算得到的59肽的分子量为6442.9非常相符，因此也就证明了C端59个氨基酸残基的顺序是正确的。

分子量测定实例β-苦瓜子蛋白其C端用羧肽酶的方法测定为-Sβ-苦瓜子蛋白Trp降解C端肽分子量β-苦瓜子蛋白Trp降解C端肽分子量蛋白质、多肽纯度的鉴定

根据质谱测定分子量的作用，质谱还可用来作蛋白质、多肽纯度的鉴定。只要质量有差异的杂质都可以被检出，此方法灵敏度高，用量少(pmol水平)、速度快，并有独到之处。蛋白质、多肽纯度的鉴定根据质谱测定分子量的作用，质谱还可用蛋白质、多肽纯度的鉴定实例1：天花粉蛋白C-端微观不均一，即有二个C末端，一个多一个Ala(即247个氨基酸残基)，一个少一个Ala(即246个氨基酸残基)，用ESI-MS完全能够分辨出来

蛋白质、多肽纯度的鉴定实例1：天花粉蛋白C-端微观不均一，即实例2：如猪胰岛素和人胰岛素混在一起，用MALDI-TOF-MS也能够清楚地分出二个峰。两者的差异仅在猪胰岛素B链的第30位为Ala(89.09Da)，而人胰岛素相应的位置为Thr(119.12Da)，两者相差30Da（如图13-11）。这些差异用其他方法是很难检出的。

实例2：蛋白质鉴定肽质量指纹谱+基于串联质谱多肽测序蛋白质鉴定蛋白质鉴定肽质量指纹谱+基于串联质谱多肽质量指纹谱由于各种蛋白质的氨基酸序列(一级结构)不同，蛋白质被酶解后产生的肽段序列也各异，肽混合物质量数亦具特征性，称为肽质量指纹谱(peptidemassfingerprint,PMF)，可用于蛋白质的鉴定。

肽质量指纹谱由于各种蛋白质的氨基酸序列(PMF流程PMF流程肽质量指纹谱

MALDI-TOF-MS是最有效的分析肽混合物的质谱仪，肽混合物不需分离可直接分析，基质辅助激光电离方法能耐受一定浓度的盐，仪器灵敏度高，标准样品1pmol的量就足够，质量数准确度可达0.1‰～0.01‰，且操作简单，分析速度快，依仪器型号不同一次可分析十几个到几十个样品。肽质量指纹谱MALDI-TOF-MS是PMF实例蓖麻毒素(ricin)

利用MALDI-TOF生物质谱技术结合肽质量指纹谱方法，经过数据库检索，建立了鉴定检测Ricin的新方法。PMF实例蓖麻毒素(ricin)MALDI-TOF质谱的测定，得到Ricin的分子量为62925DaMALDI-TOF质谱的测定，得到Ricin的分子量为629Ricin的肽质量指纹谱，共检出22条肽谱峰Ricin的肽质量指纹谱，共检出22条肽谱峰将这些肽片段的质谱数据用MASCOT搜索引擎在SwissProt数据库中进行PMF检索，检索参数如表1所示。返回前5个检索结果，如表2所示。其中符合要求的结果(置信区间为得分大于66分)只有一种蛋白即蓖麻毒素:Ricinprecursor(P02879，RICI_RICCO)，得分107，匹配肽段13条，肽谱的实验值与理论值的对比见表3，其余未检出的肽段中有4条经过与理论值对照也找到了归属。将这些肽片段的质谱数据用MASCOT搜索引擎在SwissPr肽序列测定技术

两种经典测序方法：

DNA顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基酸残基的修饰的问题；

Edman降解不能解决N端封闭的测序的问题。肽序列测定技术两种经典测序方法：

蛋白梯形测序

(proteinladdersequencing)①使用少量链终止剂，进行快速分步降解，在人为控制下产生一系列肽段，其中每个肽段于下一个之间只相差一个残基；②用MALDI-TOF-MS读出肽段信息。用此方法可在磷酸肽中定位磷酸丝氨酸残基。研究N-端封闭的肽和蛋白，必须了解其C-端序列的信息。蛋白梯形测序

(proteinladderseque蛋白梯形测序

(proteinladdersequencing)蛋白梯形测序

(proteinladdersequenc肽测序一般方法（MS/MS）使用串联质谱，利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基。其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂。肽测序一般方法（MS/MS）使用串联质谱，利用待测分子在电离基于串联质谱的肽序列测定用特定蛋白水解酶作用于蛋白质，将得到的肽段送入一级质谱，产生前体离子，经过一定选择的前体离子在碰撞室发生CID。结果是前体离子肽骨架酰胺键的特异性断裂，并产生了一系列可用于确定氨基酸序列的y型和b型等离子。获得CID二级质谱图后可算出肽序列。基于串联质谱的肽序列测定用特定蛋白水解经过MS/MS分析的多肽片段

经过MS/MS分析的多肽片段N端和C端多肽GFPNAGFPNAGFPNAGFPNAGFPNAN-terminalpeptidesC-terminalpeptides415

486

30115457

71185332429N端和C端多肽GFPNAGFPNAGFPNAGFPNAGFP理论质谱图理论质谱图理论质谱图与实际质谱图理论质谱图与实际质谱图理论质谱图与实际质谱图理论质谱图与实际质谱图标准肽Glu-fib的MS/MS图谱

标准肽Glu-fib的MS/MS图谱MS/MS优点

MS/MS质谱测序可对N端封闭的肽进行测序;并可以通过CID得到部分至完全的序列信息后，做出MS肽谱，这可对修饰的氨基酸残基定性，并确证其位置，包括二硫键的分布。而且质谱技术与分离技术直接相连也可相互验证，同时还可对混合肽进行测序。另外它还有快速、灵敏的优点。MS/MS优点MS/MS质谱测序可对N基于MS/MS蛋白质鉴定获得二级质谱图后可通过下列方法鉴定蛋白质：①较常用的肽序列标签鉴定方法（peptidesequencetag，PST：从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列，用于数据库查寻；②肽碎片离子搜索：直接用前体离子产生的未解析的CID图谱与数据库中的CID图谱比较，如Sequest、Mascot、Sonat等算法；③从头测序法（denovosequence），通过直接解释MS/MS数据识别肽序列，这类系统和算法有Lutefisk、SHERENG、PEAKS、AuDeNS等。

基于MS/MS蛋白质鉴定获得二级质谱图后可通过下列方法鉴定蛋基于MS/MS的蛋白质鉴定基于MS/MS的蛋白质鉴定串联质谱在蛋白质组学中的应用串联质谱在蛋白质组学中的应用测序其它方法先用几种不同的蛋白水解酶对蛋白质进行酶解，胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶嗜热菌蛋白酶(thermolysin)SV8酶(staphylococcusaureusV8)各种酶解片段用HPLC等分离得到的纯肽或简单的混合肽，可用MS/MS测定其各组分的顺序，然后从不同蛋白水解酶酶解片段顺序，找到其重叠部分，即可得到整个蛋白质顺序。测序其它方法先用几种不同的蛋白水解酶对蛋白质进行酶解，蛋白质的翻译后修饰鉴定磷酸化修饰糖基化修饰巯基和二硫键定位氨基的乙酰化泛素化修饰蛋白质的翻译后修饰鉴定磷酸化修饰磷酸化修饰已知的磷酰氨基酸的类型有四种：

1．O-磷酸盐，通过羟氨酸的磷酸化形成的，如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。

2．N-磷酸盐，通过精氨酸，赖氨酸或组氨酸中的氨基的磷酸化形成的。

3．乙酰磷酸盐，通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。

4．S-磷酸酯，通过半胱氨酸的磷酸化形成的。

磷酸化修饰已知的磷酰氨基酸的类型有四种：磷酸化肽富集分离技术有：双向磷酸多肽谱图(2D-PP)；高分辨率的凝胶电泳(2DE)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)。对于32P标记的磷酸化肽或蛋白可用放射自显影或磷储屏检测，提取后可以高灵敏度MALDI-MS分析；如果32P标记不可行，就要用LC-MS/MS分析，常用HPLC与质谱联用。

常用的富集方法有：固定金属亲和色谱(IMAC)；抗体免疫沉淀；化学修饰。磷酸化肽富集分离技术有：双向磷酸多肽谱图(2D-PP)；高分质谱检测磷酸化肽和确定磷酸化位点的方法

①

MALDI-TOF-MS可以通过肽指纹谱(PMF)鉴定蛋白质，与磷酸酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点。

原理：磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化，MALDI-TOF-MS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点。质谱检测磷酸化肽和确定磷酸化位点的方法

②串联质谱(MS/MS)进行前体离子扫描，这一方法是通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在。

原理：磷酸化肽经CID后会产生磷酸基团的特异性片段，这些特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的“报告离子”。

质谱检测磷酸化肽和确定磷酸化位点的方法质谱检测磷酸化肽和串联质谱还可进行中性丢失扫描，这种方法是用MS/MS检测经CID后发生中性丢失H3PO4(98u)的肽段。LC-MS/MS分析磷酸化位点傅立叶变换质谱进行电子捕获解离

质谱检测磷酸化肽和确定磷酸化位点的方法质谱检测磷酸化肽和糖基化修饰蛋白质糖基化可分为4类:N-糖基化

O-糖基化

C-甘露糖化聚糖磷脂酰肌醇锚(GPI-anchor)糖基化糖基化修饰蛋白质糖基化可分为4类:糖蛋白糖苷内切酶还原、烷基化、蛋白酶解MALDI-TOF-MS糖含量相对分子质量ESI串联质谱MALDI-TOF-MS凝集素提取氨基酸序列糖基化位点糖肽片段糖蛋白结构分析示意图糖蛋白糖苷内切酶还原、烷基化、蛋白酶解MALDI-TOF-M糖基化位点确定先用蛋白酶将糖蛋白酶解成含有和不含有糖链的肽片段，获得糖蛋白的肽质量指纹谱，再用糖苷内切酶将肽链切除，PMF发生变化，原含有糖肽段的质量由于糖链的丢失在质谱图上发生位移，通过网上数据库检索可以得到位移肽片段的氨基酸序列，而在这个序列中必含有糖基化位点，由此我们可以确定糖蛋白分子中的糖基化位点。糖基化位点确定先用蛋白酶将糖蛋白酶解成糖基化分析用糖苷内切酶将糖链切除，将反应前后的质谱图进行比较，就能直接表述糖链的平均质量，而糖蛋白的平均含糖量可由糖链的平均质量占糖蛋白平均相对分子质量的百分比来表示。应用ESI，对PMF中的肽片段进行分析，可以得到蛋白某中间片段的序列，对已知蛋白，依靠此序列，判断其归属，从而对糖蛋白的氨基酸序列加以证实。不同的质谱方法可以产生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞诱导解离(CID)谱，这可以给出有关糖的序列，分支及糖间的连接等信息。

糖基化分析用糖苷内切酶将糖链切除，将反应前后的质谱图进行比较南农-生物技术制药--第二章基因工程药物课件糖基化修饰常用的糖蛋白质分离富集技术有:凝集素亲和技术、肼化学富集法、亲水相互作用色谱法、β消除麦克尔加成反应。基于质谱的糖蛋白质鉴定及糖基化位点确定方法有:PNGaseF酶法、EndoH酶法、β-消除麦克尔加成反应、三氟甲基磺酸法。糖基化修饰常用的糖蛋白质分离富集技术有:凝集素亲和技术、肼化巯基和二硫键定位

原理：利用碘乙酰胺、4-乙烯吡啶、2-巯基苏糖醇等试剂对蛋白质进行烷基化和还原烷基化,结合蛋白酶切、肽谱技术,利用生物质谱的准确分子量测定,可实现对二硫键和自由巯基的快速定位与确定。这在含有多二硫键结构的活性多肽与蛋白质研究中有重要用途。巯基和二硫键定位原理：利用碘乙酰胺、4-乙烯吡啶、2-巯基泛素化修饰原理：由于泛素的C末端是Arg-Gly-Gly结构，经胰蛋白酶水解后，Gly-Gly留在被修饰蛋白质的肽链上，使肽段质量增加114

，起到质量标记泛素化位点的作用，进而通过串联质谱鉴定泛素化位点。泛素化修饰原理：由于泛素的C末端是Arg-Gly-Gly其他翻译后修饰乙酰化甲基化脂基化谷胱甘肽化其他翻译后修饰乙酰化质谱的其他应用蛋白质的折叠抗原决定部位指认蛋白和蛋白、低聚核苷酸及金属之间的作用细胞和病毒分析等药物代谢鉴定质谱的其他应用蛋白质的折叠蛋白质类药物的体外聚乙二醇修饰（PEG化）(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤(2)阻碍蛋白酶的降解作用(3)屏蔽药物的免疫位点(4)增加药物在体液中的溶解度(5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物

+蛋白或多肽偶联物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH蛋白质类药物的体外聚乙二醇修饰（PEG化）(1)增大药物分子国际上PEG修饰技术的研究进展美国Rutgers大学Davis教授70年代的工作甲氧基PEG的应用美国Enzon公司美国最早从事PEG修饰蛋白质药物的公司美国Shearwaters公司各种PEG修饰剂的生产商美国罗氏、先灵宝雅、安进PEG药物：PEG-INF，PEG-G-CSF其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝。。。国际上PEG修饰技术的研究进展美国Rutgers大学Davi国内PEG修饰技术的研究进展国家863重大机密项目：人工血液代用品的研制，1997-2000中国科学院重点项目：血液代用品和血液净化，2001-2005国家重大科技专项课题《创新药物和中药现代化》：长效基因工程蛋白质和多肽制剂关键技术，2002-2005国家863重点项目课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术，2007-2010PEG修饰血红蛋白：I期临床（中科院过程所、凯正公司）PEG修饰G-CSF：III期临床（格兰百克）国内PEG修饰技术的研究进展国家863重大机密项目：人工血液修饰粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF） 延长半衰期修饰人肿瘤坏死因子 消除副作用修饰白介素I受体拮抗剂（rhIL-1Ra） 延长半衰期修饰牛胰核糖核酸酶（RNase） 提高抗肿瘤活性修饰超氧化物歧化酶（SOD） 提高半衰期修饰天冬酰氨酶（Aspartase） 克服免疫原性 提高半衰期修饰人干扰素（IFN） 提高半衰期修饰血红蛋白（Hb） 血液代用品修饰胰岛素 提高半衰期我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作Sc-PEG专利分析以PEG-OH