脂肪酶活检测原理及方法

脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法.对硝基苯酚酯(4-Nitrophenylester)是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。.所需试剂有：CAS 碳链长度 出830-03-5C2N8130-1G2635-54-9C41956-10-1C821742-1G-F830-03-5C2N8130-1G2635-54-9C41956-10-1C821742-1G-F¥462对硝基苯乙酸酯N9876-1G¥570 对硝基苯丁酸酯¥435¥379对硝基苯月桂酸酯

对硝基苯棕榈酸酯¥435¥379对硝基苯月桂酸酯

对硝基苯棕榈酸酯1956-11-2 C1261716-1G1492-30-4C16 N2752-1G全部为色谱解试剂,基苯购脂sigma公司.标准曲线绘制:a.标准对硝基苯酚母液(2mM,2mmol/L):称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B(即不同pH的缓冲液)，置于棕色试剂瓶内,b.标准曲线绘制：分别取,，，，，的对硝基苯酚母液(2mM),用溶液B(即不同pH的缓冲液)稀释至4ml,分别测定在410nm处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是,，，，，，单位：mM)为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。b・标准曲线的绘制：

分别取0、、、、15、、30、45分别取0、、、、15、、30、45PL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、PL的异丙醇和（全部都是）的溶液B,40℃15min,95%乙醇，10000r/min,3min,测出标准曲线。2.0mMpNP（jiL）异丙葬底物缓冲液（风）95%乙薛（国力0 L375 3/75 7.5 15 225 306i.5 60.6255S.75 53 47-5 4。 323562.5 562.5 562.5 562.5 562.5 562.5 562,5M匕水浴耦内处理15min500 500 500 500 500 500 50010,000r/mm离心3min一线性（系列。D.8D.6D.4D.2y-14.474x+0.0272

R"2D.8D.6D.4D.20 0.02 0.04 0.06 0.08 0二上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义:在410nm下测定吸光值,以1min内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯（p-NPP）产生1Pmol对硝基苯酸（p-NP）公式y=+中x是p-NP的浓度（单位：mmol/l）,y是吸光值,、是反应系数，R2是相关系数。则，酶活计算公式为：酶活=1000*n*V*/其中n为稀释倍数,t为反应时间（单位：min）,V为反应体系的总体积（单位：L）、1000是mmol到口mol的比例。二、底物耐碱性测定及试验液配制.底物耐碱性测定种底物分别加至pH7,pH8的37℃的PBS缓冲液中（选择37℃培养箱），每隔5min检测一次颜色变化，拍照；种底物分别加至pH8,pH9的Tris-HCl缓冲液中（37℃），每隔5min检测一次颜色变化，拍照;c.分别加至pH9，pH10的Gly-NaOH缓冲液。.测酶活所需要试剂的配制，酶活测定方法方法一：（96孔板法，粗略，速度快）a,溶液的配制溶液A：溶液A:对硝基苯棕桐酸脂（p-NPP，Sigma，或者其他底物，mol，即*10-5mol）溶于异丙醇（浓度为*10-3M，或），4c棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml离心管）保存，每10ml可用于单个酶500次测定；溶液B:缓冲液（pH缓冲液，可更改）加入1滴TritonX-100,混匀，4℃保存。96孑L板（220PL）：A液（底物液）：18UL/+酶液（40UL+酶液（40UL）B液（pH缓冲液）:162UL此步骤中，底物再次被稀释，浓度为。方法二：（吸光度法，精准，速度慢）a.溶液的配制溶液A:对硝基苯棕桐酸脂（p-NPP,Sigma,或者其他底物）溶于异丙醇，4℃棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml离心管）保存，每10ml可用于单个酶8-10次测定，或用于8-10个酶一次测定，或用于一个酶4次密精测定；溶液B:缓冲液（pH缓冲液，可更改）加入1滴TritonX-100,混匀，4℃保存。b,脂肪酶的活力测定（以单个酶液做一个/两个对照为例）①准备试管30个，10个15ml离心管；②取1ml/溶液A加入到9ml/溶液B于离心管中，充分混匀，37℃水浴保温5min,分装至3/4个试管中，每个，即体系液；③向每个试管中加入适量酶液（粗酶液加300UL）,对照组中加入灭活酶液（沸水煮沸5巾防），加入酶液后即为反应液；④37℃反应10-15巾防，加入95%乙醇终止反应，在410nm下测定吸光值，每个样品重复2/3次，取平均值。三、96孔板装样方式：步骤一：温度不变，定为40℃,以pH和底物为变量，先在EP管内反应，后加入至96孔板中。其中每个孔是220UL体系。pH缓冲液分别采取PBS缓冲液（7、8）、Tris-HCl缓冲液（8、9）。a.该方法需要的总酶液量（每个酶的单次实验）：40*80=,其中需要灭活的是800UL。以方便计算以及加样，取4ml酶液，1ml用来灭活。b.该方法需要的单个底物的总量是（每个酶的单次试验）：18*16=288UL,以方便计算和加样，取300UL。c,以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例，需要每个酶液4ml,每个底物900UL。

表为96孔加样模式：C2等代表底物，后面的数字代表pH,红色字体表示一个空白对照和三个平行。蓝色字体中，pH8分别用了PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液，以便比较不同缓冲液对酶活的影响。123456789101112AC27空白C27平行C47空白C47C87空白C87C127空C127C167空C167BC27平行C27平行C47C47C87C87C127C127C167C167CC28空白C28C4空白C48C8空白C88C12空白C128C16空白C168DC28C28C48C48C88C88C128C128C168C168EC28Tri空白C28TriC48Tri空白C48TriC88Tri空白C88TriC128Tri空白C128TriC168Tri空白C168TriFC28TriC28TriC48TriC48TriC88TriC88TriC128TriC128TriC168TriC168TriGC29Tri空白C29TriC49Tri空白C49TriC89Tri空白C89TriC129Tri空白C129TriC169Tri空白C169TriHC29TriC29TriC49TriC49TriC89TriC89TriC129TriC129TriC169TriC169Tri步骤二：pH不变，以温度和底物为变量，先在EP管内反应，后加至96孔板中。其中每个孔是220口L体系。a.该方法需要的总酶液量（每个酶的单次实验）：40*60=,其中需要灭活的是600UL。以方便计算以及加样，取3ml酶液，750ml用来灭活。b.该方法需要的单个底物的总量是（每个酶的单次试验）：18*12=216UL,以方便计算和加

样，取250PL。c,以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例，需要每个酶液3ml,每个底物750PL。表为96孔加样模式其中C2等代表底物，后面的数字代表温度，红色字体表示一个空白对照和三个平行。40℃因已经在上个步骤中做过，不再重复。123456789101112AC230空白C230平行C430空白C430C830空白C830C1230空白C1230C1630空白C1630BC230平行C230平行C430C430C830C830C1230C1230C1630C1630CC250空白C250C450空白C450C850空白C850C1250空白C125