中国HIV感染长期不进展者相关免疫指标的研究

中国HIV感染长期不进展者相关免疫指标的研究【内容摘要】目的：研究中国hiv感染长期不进展者(longtermnonprogressors,ltnp)相关免疫指标的变化。方法：收集284例未经抗hiv治疗的ltnp、典型进展的hiv感染者和aids病人及130例hiv抗体阴性的抗凝全血，应用流式细胞仪分析技术对cd8+t淋巴细胞、nk细胞及dc细胞进行测定。结果：ltnpcd8+t淋巴细胞绝对值［〔1104.51±511.81〕个/μl］高于aids病人［〔678.40±295.39〕个/μl，p0.05］。ltnpnk细胞的绝对值［〔377.59±289.23〕个/μl］显著高于hiv感染者［〔292.49±445.87〕个/μl］和aids病人［〔153.62±110.36〕个/μl，p0.05］。ltnpcd123+dcs细胞绝对值［〔6.76±3.74〕个/μl］高于hiv感染者［〔5.30±3.16〕个/μl］和aids病人［〔3.32±2.09〕个/μl，p0.05］。ltnpcd11c+dcs细胞绝对值［〔21.73±11.92〕个/μl］高于hiv感染者［〔14.51±9.53〕个/μl］和aids病人［〔7.27±3.74〕个/μl，p0.05］。结论：ltnpcd8+t淋巴细胞、nk细胞和dc细胞高于典型进展的hiv感染者和aids病人，是延缓疾病进程的主要因素。【本文关键词语】hiv长期不进展者cd8+t淋巴细胞nk细胞dc细胞studyonimmunologicalexaminationinhivlongtermnonprogressorswangyanan,diaoyingying,jiangyongjun,gengwenqing,liujing,zhangmin,zhangzining,hanxiaoxu,daidi,shanghong.keylaboratoryofimmunologyofaids,ministryofhealth,thefirsthospital,chinamedicaluniversity,shenyang110001,china［abstract］objective:studyonimmunologicalexaminationinhivlongterms:bloodsamplesfrom284hivinfectedltnp,typicalprogressors(hivandaidspatients)and130healthycontrolsweredrawnintosterileedtacoatedtubes.cd8+tlymphocytes,nkcellsanddcscellswereinvestigatedbyflows:thecd8+tcellsinltnp［(1104.51±511.81)cell/μl］werehigherthaninaidspatients［(678.40±295.39)cell/μl,p0.05］.nkcellsinltnp［(377.59±289.23)cell/μl］werehigherthaninthehivinfected［(292.49±445.87)cell/μl］andaidspatients［(153.62±110.36)cell/μl,p0.05］.cd123+dcsinltnp［(6.76±3.74)cell/μl］werehigherthaninthehivinfected［(5.30±3.16)cell/μl］andaidspatients［(3.32±2.09)cell/μl,p0.05］,cd11c+dcsinltnp［(21.73±11.92)cell/μl］werehigherthaninthehivinfected［(14.51±9.53)cell/μl］andaidspatients［(7.27±3.74)cell/μl,p0.05］.conclusion:thecd8+tlymphocytes,nkcellsanddccellsinchineseltnparemuchhigherthanthoseofthehivtypicalprogressors,whicharetheimportantfactorsinpreventionofhivdiseaseprogression.［keywords］hiv；ltnp；cd8+tlymphocyte；nkcell；dcs自我们国家初次发现艾滋病病毒感染者以来，到2005年9月底，全国累计报告艾滋病病毒感染者135630例，其中艾滋病病人31143例，累计死亡7773例，对艾滋病病人的救治已迫在眉睫。然而hiv感染后，不同个体疾病进程呈现明显的不均一性。研究发现大约有5%的hiv感染者病程跨越10年以上，未经抗逆转录病毒治疗，cd4+t细胞仍维持正常水平，身体健康，未出现艾滋病指征性症状，称为hiv感染疾病长期不进展者〔longtermnonprogressors，ltnps〕［1］。对ltnp疾病不进展的机制研究将提示人类天然抗艾滋病病毒的能力，为艾滋病防治工作提供新思路。本文对长期不进展者及典型进展者〔hiv感染者和aids病人〕进行了cd8+t淋巴细胞、nk细胞、树突状细胞〔dendriticcells,dcs〕等指标的检测，比较了疾病不同进展水平各指标的变化，为正确运用临床实验室检测指标，断定疾病进展水平和临床疗效奠定坚实基础。1材料与方法1.1研究对象由中国医科大学艾滋病研究所及辽宁、吉林和河南省疾病预防与控制中心艾滋病确认实验室用genelab公司蛋白印迹试剂盒确以为hiv抗体阳性的病例284人，其中男性153例，女性131例，平均年龄为42岁〔23～68岁〕。所有标本均在未承受抗病毒治疗前收集。根据cd4+t细胞数量和感染时间进行分组，cd4+t细胞数量大于或等于500个/μl，未经抗逆转录病毒治疗，无艾滋病指征性症状，感染时间跨越10年者为hiv感染疾病长期不进展者〔ltnp〕；cd4+t细胞数量小于500个/μl，大于或等于200个/μl，无明显艾滋病指征性症状者为hiv感染组；cd4+t细胞数量小于200个/μl为艾滋病组。284例中ltnp62例、典型进展的hiv感染者165例、艾滋病病人57例。130例hiv抗体阴性健康对照，来自健康体检门诊和实验室工作人员及家属，血液惯例及肝肾功能检查结果正常，无免疫系统疾病史。1.2cd4绝对值计数所用仪器和试剂均购自bd公司。将20μlcd4/cd8/cd3三色单抗参加绝对计数管中，参加50μl抗凝全血，室温避光15分钟，参加免洗溶血素450μl，室温避光15分钟，facscalibur流式细胞仪检测，multiset软件自动分析，得到cd4+、cd8+、cd3+淋巴细胞绝对值、百分比及cd4/cd8比值。1.3天然杀伤细胞〔nk〕绝对值计数所用仪器和试剂均购自bd公司。将20μlcd3/cd16+cd56/cd45三色单抗参加绝对计数管中，参加50μl抗凝全血，室温避光15分钟，参加免洗溶血素450μl，室温避光15分钟，facscalibur流式细胞仪检测，multiset软件自动分析，得到nk细胞绝对值。1.4树突状细胞〔dc〕绝对值计数所用仪器和试剂均购自bd公司。将20μllin1fitc、10μlcd123pe/cd11cpe及10μlhladrpercp试剂参加绝对计数管中，参加100μl抗凝全血，震动混匀，室温避光15分钟，参加免洗溶血素900μl，室温避光15分钟，应用facscalibur流式细胞仪检测20万个细胞，cellquest软件分析。1.5病毒载量测定bd公司edta3k负压采血管收集血液，3000g离心20分钟，采集血浆冻存于-70℃冰箱。采取rtpcr方法，用瑞士roche公司的cobasamplicor自动载量仪及相应试剂测定病毒载量。1.6统计学分析所有数据使用spss11.0软件进行方差分析或pearson相关性分析。2结果2.1cd8+t淋巴细胞研究对ltnp、hiv感染者、aids病人及健康对照同时进行了cd8+t淋巴细胞百分比、绝对数量的测定，结果表示清楚，cd8+t淋巴细胞百分比在健康对照〔40.72%±10.48%〕、ltnp〔57.35%±11.60%〕、hiv感染者〔68.65%±11.11%〕和aids病人〔81.62%±7.15%〕各组逐步升高，且它们之间有显著差异不同〔p0.05〕，见图1。cd8+t淋巴细胞绝对值在ltnp［〔1104.51±511.81〕个/μl］、hiv感染者［〔1038.85±562.53〕个/μl］、aids病人［〔678.40±295.39〕个/μl］各组逐步降低，且ltnp和hiv感染者均显著高于aids病人和健康对照［〔660.44±290.10〕个/μl，p0.05］，但ltnp和hiv感染者之间〔p=0.639〕、aids病人和健康对照之间〔p=1.000〕均无显著差异不同，见图1。2.2nk细胞研究对ltnp、hiv感染者、aids病人及健康对照进行了nk细胞绝对数量测定，结果表示清楚，nk细胞绝对值在各组间逐步降低，依次为健康对照［〔407.22±222.96〕个/μl］、ltnp［〔377.59±289.23〕个/μl］、hiv感染者［〔292.49±445.87〕个/μl］和aids病人［〔153.62±110.36〕个/μl］，但健康对照与ltnp之间无显著差别〔p=0.193〕，其它各组差别显著〔p0.05〕，见图2。nk细胞绝对值与cd4+t淋巴细胞绝对数量明显呈正相关(r=0.383,p0.01)，与病毒载量呈负相关(r=-0.198,p0.01)。2.3dc细胞研究对ltnp、hiv感染者、aids病人及健康对照的cd123+dcs细胞进行了测定，结果表示清楚，cd123+dcs细胞的绝对值在各组间逐步降低，依次为健康对照［〔7.93±3.14〕个/μl］、ltnp［〔6.76±3.74〕个/μl］、hiv感染者［〔5.30±3.16〕个/μl］和aids病人［〔3.32±2.09〕个/μl］，健康对照和ltnp明显高于hiv感染者、aids病人，而健康对照和ltnp之间无明显差异不同〔p=0.194〕，见图3。cd123+dcs细胞绝对值与cd4+t淋巴细胞绝对数量明显呈正相关(r=0.389,p0.01)，与病毒载量呈负相关(r=-0.228,p0.01)。cd11c+dcs细胞绝对值在各组间逐步降低，依次为ltnp［〔21.73±11.92〕个/μl］、健康对照［〔16.53±2.60〕个/μl］、hiv感染者［〔14.51±9.53〕个/μl］和aids病人［〔7.27±3.74〕个/μl］，见图3。健康对照和ltnp明显高于hiv感染者、aids病人，而健康对照和ltnp之间无明显差异不同〔p=0.928〕。cd11c+dcs细胞绝对值与cd4+t淋巴细胞绝对数量明显呈正相关(r=0.521,p0.01)，与病毒载量呈负相关(r=-0.197,p0.01)。3讨论对ltnp疾病长期不进展的机制研究是揭示人类天然抗hiv的机制主要途径,为艾滋病治疗和疫苗研究提供有力手段，是当前艾滋病研究领域的热门之一。cd8+t淋巴细胞是特异性细胞免疫的效应细胞,通过分泌各种细胞因子,杀死被病毒感染的靶细胞，它是机体抗hiv病毒最重要的免疫细胞［2］。本研究表示清楚，ltnp和hiv感染者体内的cd8+t淋巴细胞的数量远高于aids病人和健康对照，且ltnp的均值略高于hiv感染者，这说明ltnp体内cd8+t淋巴细胞能够发挥细胞毒作用杀灭病毒，是疾病进展缓慢的原因之一。而ltnp组cd8+t淋巴细胞的百分比低于hiv感染者和aids病人，cd8+t淋巴细胞的百分比随着疾病进展逐步上升，这可能是由于cd4+t淋巴细胞由于凋亡等多种因素的影响造成数量减少，所以虽然aids病人体内cd8+t淋巴细胞的数量也鄙人降，但相对于cd4+t淋巴细胞其数量减少的水平小，因此百分比增长。nk细胞是天然免疫系统中的主要细胞,它能补充cd8+t淋巴细胞的杀伤作用［3，4］。国外学者们对hiv感染后nk细胞的变化进行了一些初步的研究，但到当前为止,nk细胞数量和功能在hiv感染者/aids病人体内的变化尚处于争辩中［57］。本文通过对284例ltnp、hiv感染者和aids病人的研究表示清楚，nk细胞的数量与cd4+t淋巴细胞呈正相关，ltnp体内的nk细胞高于hiv感染者和aids病人,这说明nk细胞杀伤作用亦是延缓疾病进展的可能机制之一。dc细胞是免疫系统中抗原提呈细胞，能刺激初始t细胞〔naivetcells〕增殖，启动首次t细胞免疫应答，在先天性免疫和获得性免疫经过中均有主要作用［8，9］。近期国外有研究报道hiv感染者dc数量减少，功能受损。但亦有学者报道hiv感染后dc数量和功能均不受影响,其中cd123+dcs是人体内产生ifnα的重要细胞，在控制hiv感染中可能发挥主要作用［914］。通过我们大量的实验数据表示清楚，ltnp体内的dc细胞高于hiv感染者和aids病人，可能与疾病进程相关。总之，我们实验数据表示清楚，ltnpcd8+t淋巴细胞、nk细胞和dc细胞高于hiv感染者和艾滋病病人，与cd4+t淋巴细胞呈正相关，与病毒载量呈负相关，故与延缓疾病病程相关,因而，定期监测这些指标能够作为临床分期和疾病进展的主要指标。【以下为参考文献】1haynesbf,pantalcog,faucias.towardanunderstandingofthecorrelatesofprotectiveimmunitytohivinfection［j］.science,1996;271:324328.2paulme,shearerwt,parisonofcd8+tcellsubsetsinhivinfectedrapidprogressorchildrenversusnonrapidprogressorchildren［j］.jallergyclinimmunol,2001;108(2):258-264.3millerj.thebiologyofnaturalkillercellsincancer,infectionandpregnancy［j］.experimnetalhematology,2001;29:11571168.4bironca,brossayl.nkcellsandnktcellsininnatedefenseagainstviralinfections［j］.currentopinionimmunology,2001;13:458464.5peruzzim,azzaric,rossimeetal.inhibitionofnaturalkillercellcytotoxicityandinterferongammaproductionbytheenvelopeproteinofhivandpreventionbyvasoactiveintestinalpeptide［j］.aidsreshumretroviruses，2000;16(11):10671073.6azzonil,papasavvase,chehimijetal.sustainedimpairmentofifngammasecretioninsuppressedhivinfectedpatientsdespitematurenkcellrecovery:evidenceforadefectivereconstitutionofinnateimmunity［j］.jimmunol,2002;168(11):57645770.7galianimd,aguadoe,tarazonaretal.expressionofkillerinhibitoryreceptorsoncytotoxiccellsfromhiv1infedtedindividuals［j］.clinexpimmunol,1999;115(3):472476.8iramellman,steinmanrm.dendriticcells:specializedandregulatedantigenprocessingmachines［j］.cell,20