白喉疫苗工艺流程菌种课件

细菌性疫苗杨丽华2011年3月细菌性疫苗杨丽华1.死疫苗2.活疫苗

3.蛋白类疫苗4.多糖类疫苗

5.多糖蛋白结合疫苗

细菌性疫苗国药长春所1.死疫苗2.活疫苗3.蛋白类疫苗4.多糖类疫苗细菌性疫苗种类23白喉破伤风百日咳疫苗……451霍乱伤寒副伤寒百日咳疫苗……卡介苗鼠疫布氏杆菌伤寒痢疾霍乱疫苗……脑膜炎伤寒vi肺炎流感嗜血杆菌多糖疫苗……AC脑膜炎球菌多糖结合疫苗HIB……脑膜炎伤寒vi流感嗜血杆菌多糖疫苗……国药长春所细菌性疫苗种类23白喉451霍乱卡介苗脑膜炎AC脑膜炎球菌多百日咳疫苗

伤寒疫苗结合疫苗

白喉疫苗国药长春所百日咳疫苗伤寒疫苗结合疫苗白喉疫苗国药长春所白喉疫苗一、白喉概述二、病原学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学四、白喉毒素五、白喉类毒素六、生产工艺七、类毒素的质量检定国药长春所白喉疫苗一、白喉概述国药长春所外毒素对神经系统损害细菌产生的外毒素对心肌损害外毒素对肾脏损害白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病主要临床表现为上呼吸道发炎，常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，白喉疫苗国药长春所外毒素细菌产生外毒素白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。主要白喉流行特点1.传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌没有中间宿主，病人及带菌者是唯一的传染原。2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通过被污的器具和食物传播。3.易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿1岁时白喉易感性达高峰。国药长春所白喉流行特点1.传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌国二、病原学1.细菌形态

白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈棒状，有着色较深的异染颗粒，革兰氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚膜，不形成芽孢。国药长春所二、病原学1.细菌形态国药长春所白喉棒状杆菌显微镜下形态国药长春所白喉棒状杆菌显微镜下形态国药长春所国药长春所白喉棒状杆菌显微镜下形态国药长春所白喉棒状杆菌显微镜下形态2.培养特性白喉杆菌是需氧菌，最适温度为34～35℃。能分解葡萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原硝酸盐，不产生吲哚，不消化蛋白。3.抵抗力⑴.白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和红霉素极敏感。⑵.对消毒剂抵抗力弱，3％苯酚10min可将该菌杀死⑶.不耐热，58℃10mi或100℃1min即可被杀死。国药长春所二、病原学2.培养特性国药长春所二、病原学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学1.致病力自然界中动物不感染白喉，只能在敏感动物中造成人工感染。猴、马、家兔和豚鼠对白喉敏感实验室常用的动物是家兔、豚鼠和NIH小鼠。2.毒素产生遗传学白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的。白喉杆菌的产毒基因是由β嗜菌体携带。β嗜菌体感染无毒白喉杆菌后嗜菌体DNA与细菌DNA整合，形成溶原性白喉杆菌而获得产毒能力（PW8株目前用于白喉类毒素生产)。国药长春所三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学1.致病力国药长春所四、白喉毒素1.白喉外毒素为棒状杆菌β-噬菌体tox基因表达产物,可与细胞表面的特异性受体结合,干扰蛋白质的合成，对人和动物都引起致死性毒性，如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均受到损害。2.白喉毒素是单一多肽，由560个氨基酸组成，分子量为62kDa,等电点pH4.1，在pH6时加热55℃很快失活。3.通过物理和化学方法将其纯化。国药长春所四、白喉毒素1.白喉外毒素为棒状杆菌β-噬菌体tox基因表达细菌毒素甲醛类毒素毒素经甲醛处理后去除毒性而保留免疫原性五、白喉类毒素国药长春所细甲醛类毒素毒素经甲醛处理后去除毒性五、白喉类毒素国药长春甲醛浓度温度PH脱毒影响脱毒因素国药长春所甲醛温度PH脱毒影响脱毒因素国药长春所温度、pH和甲醛浓度等均影响脱毒效果１.温度越高脱毒越快，超过40℃影响抗原性，一般37～38℃。２.在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，在保存过程中由于甲醛的继续作用，可导致脱毒过甚，并影响毒素的稳定性；在碱性时脱毒快，但抗原性损失较大，一般采用弱碱性。３.甲醛浓度大则脱毒快，但抗原损失大。国药长春所温度、pH和甲醛浓度等均影响脱毒效果国药长春所温度升高游离甲醛的浓度低毒素纯度高易发生毒性逆转提高甲醛浓度、脱毒pH、脱毒温度和延长脱毒时间；增加非蛋白氮含量（于精制毒素中加入赖氨酸、精氨酸等）防止或减轻毒性逆转类毒素的毒性逆转国药长春所易发生毒性逆转提高甲醛浓度、脱毒pH、防止或减轻毒性逆转类毒六、白喉疫苗工艺流程

菌种（PW8株）

传代扩增3～4代

发酵罐培养34～35℃培养对数生长末期收获，甲苯杀菌。离心去菌体收集清液超滤浓缩

硫酸铵两段盐析除盐除菌氨离子及无菌检查脱毒甲醛液37℃脱毒试验（家兔）原液检定（浓度、纯度、安全等）

Al(OH)3吸附

成品检定（安全、效价等）国药长春所六、白喉疫苗工艺流程七、类毒素的质量检定1絮状单位（Lf）

是毒素或类毒素与抗毒素的结合单位，只能代表“量”而不能完全代表活性。使用抗毒素絮状单位标准品来测定类毒素的絮状单位。

絮状单位测定

毒素或类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度反应时间等条件下可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉眼可见的絮状凝集反应，根据抗毒素絮状单位标准品可测定类毒素的絮状单位（Lf）值。2纯度：≥1500Lf/mgPN3安全性试验（豚鼠）国药长春所七、类毒素的质量检定1絮状单位（Lf）国药长春所七、类毒素的质量检定4效价测定

类毒素刺激机体产生特异性抗体的免疫应答和对相应抗体的特异性结合反应。⑴小鼠Vero细胞法将标准和待检类毒素2倍稀释3～5个稀释度，皮下免疫NIH小鼠8只（0.5ml/只)，免疫5周采血，根据vero细胞生长情况，以标准品的效价为标准，用平行线分析法进行结果计算。⑵豚鼠毒素攻击法皮下免疫豚鼠10只（1ml/只），免疫4周后用毒素攻击，观察5天根据存活率以标准品的效价为标准，用平行线分析法进行结果计算。国药长春所七、类毒素的质量检定4效价测定国药长春所百日咳疫苗一、百日咳概述二、病原学三、百日咳疫苗发展简史四、无细胞百日咳疫苗㈠、生产工艺流程㈡、质量检定㈢、APV的效果㈣、接种不良反应国药长春所百日咳疫苗一、百日咳概述国药长春所急性脑炎、呕吐、痉挛和昏迷，死亡或脑损伤并发症肺炎形成肺气肿肺不张，甚至死亡。营养缺乏症百日咳是对儿童威胁非常大的传染病，它是由百日咳杆菌引起的一种呼吸道传染病。典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾声或伴有呕吐，可持续数月。百日咳概述国药长春所急性脑炎、呕吐、痉挛和昏迷，死亡或脑损伤并发症肺炎营养缺百日百日咳流行特点1.传染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳病人是传染原。2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通过被污的器具和食物传播。3.易感人群：主要传染对象是6岁以下儿童，1岁以内婴幼儿发病率50%。国药长春所百日咳流行特点1.传染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳二、病原学㈠细菌形态百日咳菌呈革兰氏染色阴性，短杆状或椭圆形国药长春所二、病原学㈠细菌形态国药长春所㈡生长特性1.百日咳菌可分四种相变，Ⅰ相菌毒力最强有免疫原性；Ⅳ相菌毒力消失，无免疫原性；ⅡⅢ相菌介于Ⅰ

Ⅳ相之间。2.百日咳菌是需氧菌，最适温度为35～36℃,最适pH6.8-7.0。3.不发酵任何糖类、不分解糊精，尿素盐，不液化明胶不产生吲哚，不利用枸橼酸盐。国药长春所㈡生长特性1.百日咳菌可分四种相变，Ⅰ相菌毒力最强有免国作用PTFHAAggsPRNACTCTHLT呼吸道粘附作用＋＋＋＋－＋－--细胞毒性＋＋－－＋＋＋＋＋免疫原性＋＋＋＋＋＋＋--1百日咳Ⅰ相菌有两大类抗原菌体O抗原表面K抗原（荚膜物质）2百日咳菌可产生外毒素(PT)内毒素其他生物活性物质，据报道有25种之多。㈡、主要抗原和生物学活性作用PTFHAAggsPRNACTCTHL百日咳菌粘附在上呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖↑↓重患

(FHAPTPRNAgg)下呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖↓细菌不进入组织和血液循环

①干扰吞噬细胞功能AC分泌大量PT②麻痹上皮细胞功能TCT①产生血细胞增多③损伤支气管血管周HLT细胞代谢发生变化②组织胺致敏性增强围组织③分泌胰岛素增强和血糖降低.

㈢、致病机理国药长春所百日咳菌粘附在上呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖㈢、致病机三、百日咳疫苗发展简史㈠粗制百日咳灭活疫苗

第一次世界大战时期，在对病原菌的生物学构造及其与致病机理间的关系缺乏认识的前提下，凭经验制造的灭活疫苗，工艺粗造、含量不确定。㈡全菌体百日咳疫苗(WPV)

以标准化方式生产的，制造疫苗的菌株必须含有123型凝集原（Agg1、Agg2、Agg3）。经过50多年的临床应用证明该疫苗的免疫效果是肯定的，但接种后的不良反应问题一直未解决。㈢无细胞百日咳疫苗(APV)

20世纪80年代初期，对百日咳菌的成分及其所引起生物学作用的认识，产生了APV。㈣基因工程疫苗正在研究中。国药长春所三、百日咳疫苗发展简史㈠粗制百日咳灭活疫苗国药长春所四、无细胞百日咳疫苗1981年日本的佐藤教授等人在纯化出PT和FHA两种抗原的基础上，在世界上第一次研制成功了含有两种抗原成分的无细胞百日咳疫苗，并且与白喉和破伤风类毒素联合制成无细胞百白破联合疫苗。该疫苗在日本开始正式使用，目前日本已经全部取代了菌体百白破疫苗。1992年美国正式批准使用日本生产的无细胞百日咳疫苗。美国获得生产许可证的APV还含有Agg2和PRN。目前WHO已经将其作为儿童预防免疫推荐用疫苗。我国是于80年代中期开始研制无细胞百白破联合疫苗，90年代中期获得正式生产文号。近期的临床试验证明含有5种保护性抗原（PTFHAPRNAgg2

Agg3）的APV效果最佳。国药长春所四、无细胞百日咳疫苗1981年日本的佐藤教授等人在纯化出PT

冻干百日咳菌种（Ⅰ相CS菌株）↓接种血培养基大管培养↓36℃48-72小时培养传代接种发酵罐培养（综合培养基）↓培养≤48小时收集培养物↓第一段硫酸铵盐析及浸提↓第二段硫酸铵盐析及浸提↓透析↓密度梯度离心↓戊二醛脱毒↓透析↓超声↓无细胞百日咳原液㈠、生产工艺流程国药长春所

检测项目标准蛋白含量——抗原纯度测定PT和FHA不低于总蛋白质含量的85%热原测定符合规定毒性试验小鼠体重减轻试验不高于10BWDU/ml小鼠白细胞增多试验不高于0.5PLU/ml小鼠组胺致敏试验不高于0.8HSU/ml毒性逆转试验不高于0.8HSU/ml效价测定（脑腔保护力试验）不低于4.0IU/剂量㈡、质量检定国药长春所检测项目标准蛋白含量——日本和中国的APV和DTPa按以上主要检定项目进行质量控制。美国、欧洲一些国家及WHO推荐的毒性和效价测定方法等与之不同。毒性试验仅要求做HST，效价测定采用ELISA法检测疫苗注射小鼠后百日咳抗体应答水平。用小鼠脑腔保护力试验（MPT）评价疫苗效果，WPV的效价明显高于APV，而且并非所有的APV均可通过MPT试验。因此还没有令人满意的针对APV疫苗的效价试验方法。免疫原性试验在衡量制品的一致性方面是有用的，但与临床保护之间还缺乏相关性。国药长春所效价测定方法探讨日本和中国的APV和DTPa按以上主要检定项目进行质量国药接种种类免疫人数病例数发病率（%）报道时间WPV56814.31983APV36411.3_584882.8APV30310.01988_423780.0APV2613.81988_271762.9APV6223.21990_373081.0表明APV的保护效果是肯定的，能够达到WPA的保护水平。㈢、APV的效果国药长春所接种种类免疫人数病例数发病率（%）报道时间WPV56814.疫苗种类发热(%)持续性喊(%)红晕(%)肿胀(%)疼痛(%)APV0.8-2.84.5-9.01.4-5.51.2-5.51.4-4.8WPV6.620.59.515.420.8表明APV的不良反应明显低于WPV。㈣、接种不良反应国药长春所疫苗种类发热持续性喊红晕肿胀疼痛APV0.8-2.84.5-伤寒疫苗一、概述二、病原学三、伤寒疫发展简史四、伤寒Vi疫苗国药长春所伤寒疫苗一、概述国药长春所1.伤寒病是一种急性全身性感染，感染网状内皮细胞系统，肠道淋巴组织及胆囊，病原是伤寒沙门氏菌。2.传播途径是食入被污染的食物或水源。3.学龄儿童发病率最高，两岁以下儿童和35岁以上成人发病率低。一、概述国药长春所1.伤寒病是一种急性全身性感染，感染网状内皮细胞系统，肠道淋1潜伏期为7～21天病期为一个月，恢复缓慢。3表情迟钝脉搏相对缓慢，肝脾肿大和白细胞减少。2长期发热、持续高烧达10～14天、腹部不适、头痛等。2长期发热、持续高烧达10～14天、腹部不适、头痛等。典型的临床症状国药长春所1潜伏期为3表情迟钝2长期发热、2长期发热、典型的临床症状二、病原学1.细菌形态伤寒沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，能运动。国药长春所二、病原学1.细菌形态国药长春所伤寒沙门氏菌革兰染色国药长春所伤寒沙门氏菌革兰染色国药长春所伤寒沙门氏菌电镜形态国药长春所伤寒沙门氏菌电镜形态国药长春所2.培养特性在肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜培养基上以易生长，需氧，适宜温度35-37℃，适宜的pH为7.0～7.2。发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇均产酸不产气；不发酵乳糖、蔗糖；氧化酶试验阴性。2.培养特性1.鞭毛（H）抗原：为蛋白质，煮沸破坏，不受（1％）甲醛影响。2.菌体（O）抗原：细胞壁部份，耐热，为脂多糖（LPS）－由多糖（重复寡糖和核心寡糖）和类脂A组成。3.莢膜（Vi）抗原:即荚膜多糖（CPS）,是伤寒杆菌细胞外壁的一种荚膜抗原,Vi抗原与其致病性有关

Vi来源于毒力的缩写。抗原结构国药长春所1.鞭毛（H）抗原：为蛋白质，煮沸破坏，不受抗原结构国血清学诊断

1.肥达氏试验（widaltest）选择抗原的方法：⑴.测定O抗体用伤寒0901株（没有H和Vi抗原）

用加热杀菌破坏H抗原（不耐热）

⑵.测定H抗体用伤寒S株（没有O菌体抗原）

用甲醛处理伤寒沙门氏菌破坏O抗原

2.酶联免疫试验国药长春所血清学诊断1.肥达氏试验（widaltest）国药1234全菌体灭活疫苗口服Ty21a减毒活疫苗伤寒Vi多糖疫苗伤寒结合疫苗二、伤寒疫苗的发展简史国药长春所1234全菌口服伤寒伤寒二、伤寒疫苗的发展简史国药长春所1甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗2.加热杀菌石碳酸防腐疫苗3.丙酮杀菌疫苗㈠、全菌体灭活疫苗国药长春所1甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗2.加热杀菌石碳酸防腐疫苗3.丙酮杀甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗50年代初期学自前苏联，为伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗。用１％甲醛杀菌，0.5％石炭酸生理盐水制成。每毫升含伤寒沙门氏菌体原为1０亿-５亿；副伤寒甲乙由每毫升各５亿-２.5亿，细菌总量原三联疫苗为20亿-10亿。国药长春所甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗50年代初期学自前苏联，为伤寒、加热杀菌石碳酸防腐疫苗此法历史最久，1896年首创的伤寒疫苗即为此法制成，只用56℃水浴30ｍin杀菌加石碳酸防腐制成。美国仍用此法制作标准品。国药长春所加热杀菌石碳酸防腐疫苗此法历史最久，1896年首创的伤丙酮杀菌疫苗1921年创制，认为对稳定Vi抗原有益，系将一份菌液加三份丙酮处理，然后抽气干燥制成。1943年首次在意大利使用，经世界卫生组织做现场考核，认为效果最好。国药长春所丙酮杀菌疫苗1921年创制，认为对稳定Vi抗原有益，系观察组观察人数中强反应百分率(%)第一组1408856.05第二组131315111.50合计27212368.75伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗接种反应

实践证明，菌体疫苗预防伤寒效果肯定的，但接种后的严重反应一直困扰着人们。国药长春所观察组观察人数中强反应百分率(%)第一组1408856.05㈡、口服Ty21a疫苗

70年代末期研究成功的口服伤寒疫苗Ty21a活疫苗，是以Ty21伤寒毒株作为出发株，用亚硝基胍诱变所得的突变株。国药长春所㈡、口服Ty21a疫苗70年代末期研究成功的口服伤寒疫口服Ty21a疫苗的特点1.减毒活疫苗此突变株缺少尿苷二磷酸半乳糖-4-异构酶半乳糖激酶和半乳糖1-磷酸尿苷酰转移酶的活性降低约80％。且没有Vi抗原。所以其毒力减低，但此突变株有完整的O抗原LPS，并具有免疫原性，能诱导较好的免疫保护性反应。2.经过多年观察证明有效，反应也较轻。一些国家批准应用。国药长春所口服Ty21a疫苗的特点1.减毒活疫苗国药长春所口服Ty21a疫苗的特点3.Ty21a菌株营养要求苛刻，生长缓慢，产量很低，不易批量生产。4.目前无可靠的检定指标。5.基因背景不够清楚，因为它是用强诱变剂处理而得，作为活疫苗这是它的最大的弱点。国药长春所口服Ty21a疫苗的特点3.Ty21a菌株营养要求苛刻，生长地区疫苗制剂效果效果比较埃及液体＋NaHco3

96%智利肠溶衣胶囊／明胶囊66％ECC、19％明胶ECC＞明胶智利液体／胶囊35%ECC、76%液体液体＞ECC印尼液体／胶囊42%ECC、53%液体液体＞ECC口服Ty21a减毒活疫苗的免疫效果

国药长春所地区疫苗制剂效果效果比较埃及液体＋NaHco396%智利肠㈢、伤寒Vi多糖疫苗1.伤寒Vi多糖疫苗的概述2.伤寒Vi多糖疫苗的免疫效果3.伤寒Vi多糖疫苗不良反应观察结果4.伤寒Vi多糖疫苗的制造工艺5.伤寒Vi多糖疫苗的特点国药长春所㈢、伤寒Vi多糖疫苗1.伤寒Vi多糖疫苗的概述国药长春所伤寒Vi多糖疫苗概述由于Vi抗原是一种表面抗原，是由C3位乙酰化的N-乙酰-D-半乳糖醛酸（1－4）连接的同聚体。在美国NIH的Robbins等重新认识伤寒Vi抗原的免疫原性后，并受流脑多糖疫苗的启发，用与之类似的方法提取Vi抗原，以不伤害其抗原结构，保持它的免疫原性，制备了伤寒Vi多糖疫苗。国药长春所伤寒Vi多糖疫苗概述由于Vi抗原是一种表面抗原，是由C3位乙伤寒Vi多糖疫苗概述早期提取Vi抗原时为了降低LPS的含量，采取1mol/L乙酸100℃处理24h，使O-乙酰基和N-乙酰基脱落造成Vi抗原结构变化，导致其免疫原性发生变化。新方法是用十六烷基三甲基溴化铵处理伤寒沙门氏菌，所得Vi抗原可以保留O-乙酰基和N-乙酰基，使其不变性。国药长春所伤寒Vi多糖疫苗概述早期提取Vi抗原时为了降低LPS的含量观察地区疫苗人数观察时间（月）保护率（％）尼泊尔伤寒Vi3457（5～44岁）1772南非伤寒Vi5692（5～16岁）2164伤寒Vi多糖疫苗的免疫效果国药长春所观察疫苗人数观察保护率（％）尼泊尔伤寒Vi34571772疫苗局部反应发热率(%)疼痛红肿硬结流脑A+C多糖（50μg/人）N=12989（69％）23（18％）21（16％）2（2％）伤寒Vi（25μg/人）N=12778（61％）10（8％）2（2％）1（1％）伤寒Vi（50μg/人）N=12686（68％）9（7％)9（7％）0伤寒Vi多糖疫苗不良反应观察结果国药长春所局部反应发热率疼痛红肿硬结流脑A+C多糖8923212

（Ty2株）

细菌培养生物反应液体培养（8～10h）对数生长期末收获,甲醛液灭活离心去菌体，收上清液浓缩多糖上清加10%十六烷基三甲基溴化铵离心收集沉淀，加氯化钙溶液振荡解离除去核酸加95%乙醇至25%浓度收集上清上清中加95%乙醇至80%浓度沉淀粗制多糖，抽干除去蛋白加1：10饱和中性醋酸钠溶液溶解多糖按1：2加冷酚提取3次，离心收集上清液并透析沉淀多糖透析液加95%乙醇至80%沉淀多糖用无水乙醇和丙酮各洗3次原液注射用水溶解多糖并除菌注射用水稀释分装成品伤寒Vi荚膜多糖疫苗工艺流程国药长春所（Ty2株）伤检定项目检定指标固总测定％蛋白含量＜10mg/g核酸含量＜20mg/gO－乙酰基含量≥2mmol/gKd值≤0.25Kd值＜0.25回收率＞50%热原检查0.025μg/kg伤寒Vi多糖疫苗检定项目及检定指标国药长春所检定项目检定指标固总测定％蛋白含量＜10mg/g核酸含量＜2伤寒Vi多糖疫苗的特点安全有效副反应较菌体疫苗轻，但却有其大致相同的免疫效果。稳定性好即可以为液体制剂，也可以为冻干制品，耐热，易于运输与保存。使用方便注射一针，即可以有一定的保护力，易于用理化方法标准化。同其他多糖疫苗一样对婴幼儿免疫效果差。国药长春所伤寒Vi多糖疫苗的特点安全有效副反应较菌体疫苗轻，但却结合疫苗一、结合疫苗的特点二、免疫机理三、用于制备结合疫苗的多糖抗原四、用于制备结合疫苗的蛋白载体五、结合化学制备结合疫苗的主要要素六、结合疫苗应具备的两个共同特征七、结合疫苗的使用和发展现状八、结合疫苗的研究方向九、存在问题国药长春所结合疫苗一、结合疫苗的特点国药长春所一、结合疫苗的特点1.抗原物质（多糖和蛋白质）经化学共价结合形成了具有一定空间构象的结合物。抗原物质还包括多肽、甾族激素、脂肪胺、核苷等小分子物质。2.它能使多糖抗原的T细胞非依赖性转化为T细胞依赖性,产生具有记忆特征的IgG抗体,提高多糖疫苗的免疫原性和免疫持久性。3.能够在婴儿产生免疫应答。国药长春所一、结合疫苗的特点1.抗原物质（多糖和蛋白质）经化学共价结合二、免疫机理1.胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）2.胸腺依赖性抗原（TD-Ag）国药长春所二、免疫机理1.胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）国药长春所胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）细菌脂多糖、荚膜多糖等。TI-Ag分子结构呈长链，O-乙酰基、丙酮酰基、糖苷键和磷酸脂键等抗原表位重复排列而成簇，对每种表位来将可视为多价的，能与B细胞表面受体结合形成“帽状现象”。可单独触发B细胞产生抗体，不需T辅助性细胞辅助。与TI-Ag发生应答的是B细胞的抗原识别受体IgM（B细胞成熟的标志），产生的抗体仅为IgM,且抗体效价低、无Ig类型转换。不诱导细胞免疫应答，也不引起免疫记，即使再次采用相同抗原刺激也不能引起初次免疫应答，更无抗体亲和力成熟过程。国药长春所胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）细菌脂多糖、荚膜多糖等。国药TI－AgBIgM无记忆B细胞（Bm）形成，不产生加强应答，因而免疫原性弱。B细胞对（TI-Ag）应答特点国药长春所TI－AgBIgM无记忆B细胞（Bm）形成，不产生加强应答胸腺依赖性抗原（TD-Ag）绝大多数天然抗原（蛋白质）都是TD-Ag。TD-Ag分子量大，结构复杂，表位种类多且不均匀(就每种表位而言它是单价的)。此类抗原含有T细胞和B细胞决定簇，蛋白质通过单价表位的相互作用与B细胞表面IgM受体结合，但不诱导“帽状现象”，不足以激活B细胞,但被B细胞胞饮、水解后肽表位与T细胞受体结合诱导TH细胞产生细胞因子。TD-Ag需TH细胞产生细胞因子并激活B2细胞产生抗体,浆细胞在产生抗体中发生Ig类型转换，合成IgG和IgM类抗体。形成记忆Bm细胞，当受到相同抗原再次刺激时引起再次应答，而且抗体亲和力较初次应答明显提高。诱导体液免疫应答，同时诱导细胞免疫应答。国药长春所胸腺依赖性抗原（TD-Ag）绝大多数天然抗原（蛋白质）都是TTD-AgIgGIgMTH细胞细胞因子B2Bm停止分化记忆B细胞（Bm）形成，产生加强应答，增强免疫原性。B细胞对（TD-Ag）应答特点国药长春所TD-AgIgGTH细胞细胞因子B2Bm停止分化记忆B细胞（多糖—蛋白质结合物（TD-Ag）将多糖分子与蛋白质共价结合，由于蛋白质抗原激活TH细胞，能诱导TH细胞产生细胞因子（如r-IFN,IL-2、4、5）并传递给B2细胞，使之参与免疫应答。TD-Ag应答存在着TH-B2细胞间的协作作用国药长春所多糖—蛋白质结合物（TD-Ag）将多糖分子与蛋白质共价结合，多糖—蛋白质结合物（TD-Ag）多糖蛋白质结合疫苗免疫优势:1.有TH细胞参与，刺激机体产生的抗体主要有IgG和少量IgM，能产生细胞免疫和加强免疫应答，免疫原性强。2.免疫接种范围广，对所有年龄组人群均能提供免疫保护。国药长春所多糖—蛋白质结合物（TD-Ag）多糖蛋白质结合疫苗免疫优抗体生成的辅助细胞专一地识别载体决定簇

TH细胞

B2细胞是产生抗体的效应细胞专一地识别多糖（半抗原）表面抗原识别受体为IgG和IgM产生IgG和IgM。分化增殖过程中有少量B细胞停止分化变成记忆Bm细胞出现加强应答免疫原性大大提高细胞因子TD-AgTD-Ag应答存在着TH-B2细胞间的协作作用国药长春所抗体生成的辅TH细胞B2细胞是产生抗体的效应细胞细胞因子一类是细菌的荚膜多糖（CPS）A/C群脑膜炎球菌肺炎链球菌b型流感嗜血杆菌（Hib）和伤寒杆菌结合疫苗在动物和人体中均证实了其安全性和增强的免疫原性。三、用于制备结合疫苗的多糖抗原国药长春所一类是细菌的荚膜A/C群脑膜炎球菌肺炎链球菌b型流感嗜血杆菌另一类为菌体多糖（OPS）脂多糖（LPS）中的O特异性多糖（O-PS）脂寡糖（LOS）中的寡糖（OS）结合疫苗纯化的O-PS和OS没有免疫原性，与蛋白载体制备结合疫苗后可获得免疫原性。抗O-PS的IgG具有型特异性保护，抗OS抗体具有杀菌活性及免疫保护作用。三、用于制备结合疫苗的多糖抗原国药长春所另一类为菌体多糖脂多糖（LPS）中脂寡糖（LOS）结合疫苗纯四、用于制备结合疫苗的蛋白载体1.细菌的分泌性毒素（去除毒性）

破伤风类毒素（TT）白喉类毒素（DT）及无毒CRM197百日咳毒素（PT）及无毒CRM3201霍乱肠毒素（CT）及其B亚单（CTB）无毒的重组绿脓杆菌外毒素（rEPA）大肠杆菌热敏感肠毒素（HLT）2.细菌菌毛

绿脓杆菌菌毛（PAP）淋球菌P-3-2菌毛国药长春所四、用于制备结合疫苗的蛋白载体1.细菌的分泌性毒素（去除毒性四、用于制备结合疫苗的蛋白载体3.细菌外膜蛋白

B群脑膜炎球菌外膜蛋白（OMP）4.病原蛋白质如乙肝表面抗原（HｂsAg）5.B群脑膜炎球菌外膜蛋白（OMP）6.伤寒杆菌鞭毛和肺炎球菌溶血素（PLY）也是很有潜力的结合蛋白。7.人工合成的多肽聚合物，常用的是多聚赖氨酸

国药长春所四、用于制备结合疫苗的蛋白载体3.细菌外膜蛋白国药长春所1.多糖抗原的选择细菌的保护性抗原荚膜多糖（CPS）菌体多糖（OPS）2.多糖分子大小选择天然多糖经降解后的寡多糖。五、结合化学制备结合疫苗的要素国药长春所1.多糖抗原的选择五、结合化学制备结合疫苗的要素国药长春所3.载体蛋白的选择破伤风类毒素（TT）白喉类毒素（DT）4.多糖和蛋白质活性功能基团天然的修饰的5.结合模式五、结合化学制备结合疫苗的要素国药长春所3.载体蛋白的选择破伤风类毒素（TT）五、结合化学制备结功能团蛋白质多糖一类功能团（多糖或蛋白质原有功能团）羧基、氨基、巯基和芳香基羧基、羟基、氨基醛基衍生功能团（经化学反应可引入功能团）氨基、巯基、酰肼马来亚胺基、卤代乙基、羧基、氨基、醛基马来亚胺基、酰肼巯基、卤代乙酰基4.偶联反应可利用的化学功能团国药长春所功能团蛋白质多糖一类功能团羧基、氨基、巯基羧基、羟基、氨基醛按照结合方法可分为两种结合模式两种抗原的直接结合一般限于羧基和具有一级氨基醛基之间的缩合反应，其产物需要进一步还原才能稳定。两种抗原通过化学双功能连接剂的结合

在多糖和载体蛋白之间使用一个连接物，不但可增加结合物的收率，而且可大大增强其免疫原性。现有的连接剂按其性质可分为两种。

5.结合模式国药长春所按照结合方法可分为两种结合模式5.结合模式国药长春

5.结合模式异种双功能连接剂：SPDP（Ｎ-琥珀酰胺-3-二硫代呲啶丙酸）同种双功能连接剂AＤH（已二酰肼）EDAC(碳二亚胺)戊二醛。

不同的连接剂所带的活性功能团不同,因而要求抗原中相应不同的活性功能团与之反应。国药长春所5.结合模式异种双功能连接剂：SPDP（Ｎ-琥珀酰5.结合模式按照多糖－蛋白质偶联物的分子构象分为两种连接模式末端连接模式交叉连接模国药长春所5.结合模式按照多糖－蛋白质偶联物的分子构象国药长春所5.结合模式

末端连接模式

一个载体蛋白上可连接一定数量的糖链，每一条糖链上只有一个末端位点与蛋白质结合，糖链与蛋白质载体可以直接连接，也可以通过小分子桥连接。

5.结合模式

末端连接模式5.结合模式交叉连接模该模式的每一个载体蛋白或每一个糖链上都可以有多个相互连接位点，结合物形成网状交连体。随着糖链长度的延长，连接点的增加，交连体的分子质量会相应增大，其三维空间结构更为复杂.国药长春所5.结合模式交叉连接模国药长春所方案多糖的活性功能基团连接剂选用实例Ⅰ-CHO–OH直接结合（氨基还原反应）付伤寒甲PS结合疫苗Ⅱ-COOHADH（酰胺化反应）疫疾CSP结合疫苗Ⅲ苯环上－OH

-OHCNBr激活ADH（酰胺化反应）Hib结合疫苗Ⅳ-COOHSPDP（二硫化物交换）伤寒Vi结合疫苗结合疫苗制备常用的四种化学结合方案国药长春所方案多糖的活性功能基团连接剂选用实例Ⅰ-CHO–OH直接

1.氨基还原法（直接结合）糖类在水溶液中大多以环状半缩醛形式存在，在氨基存在的情况下与之形成shiff氏碱。用还原剂将氨基还原成二级亚胺,从而形成稳定的多糖蛋白结合物。国药长春所1.氨基还原法（直接结合）糖类在水溶液中大多以环状半缩3.CNBr-ADH酰胺化反应法在碱性条件下用CNBr活化多糖分子上的羟基（-OH）形成氰酸脂。然后与ADH反应将脂酰肼（AH）基团导入多糖分子形成PS-AH衍生物。最后在EDAC的介导下与蛋白载体形成稳定的结合物。国药长春所3.CNBr-ADH酰胺化反应法在碱性条件下用CNBr活化4.SPDP（二硫化物交换）法首先在EDAC的介导下将多糖分子中的羧基与胱氨酸上的氨基通过肽键结合，形成含有二硫键（-S-S-）的衍生物，然后用二硫基苏糖醇将双硫键还原成自由的巯基（-SH）,即多糖-SH衍生物。另将SPDP与蛋白质载体反应形成蛋白质衍生物最终两种衍生物在水溶液中微碱条件下由于二硫基和巯基之间的交换，形成稳定的含有二硫键的多糖蛋白质复合物。国药长春所4.SPDP（二硫化物交换）法首先在EDAC的介导下将多糖分六、结合疫苗的两个共同特征㈠结构特征1.多糖抗原与载体蛋白质之间以化学共价键牢固地接合。2.多糖分子大小与载体蛋白的结合比有利于刺激机体产生最强的针对多糖免疫应答。3.重复制备性及稳定性好，有效期较长。4.作为多价或单价疫苗易于标准化。国药长春所六、结合疫苗的两个共同特征㈠结构特征国药长春所六、结合疫苗的两个共同特征㈡功能特征1.多糖蛋白质结合疫苗无毒、安全。2.注射机体后能同时诱发细胞免疫和Ｔ细胞依赖性免疫，血清中存在高滴度的杀菌抗体。3.能增强婴幼儿对细菌多糖的免疫应答。4.对某些细菌衍生物载体蛋白不产生加强免疫反应。国药长春所六、结合疫苗的两个共同特征㈡功能特征国药长春所检定项目检定指标已二酰肼含量16-45μg/ml氰化物残留量≤10ng/mg多糖含量≥28μg/ml蛋白含量≥48μg/ml多糖蛋白质比值0.30-0.59高分子结合物含量80%-100%Kd值≤0.20Kd值＜0.20回收率≥

60%EDAC残留量＜10μmol/L热原检查0.025μg/kg细菌内毒素≤5EU/μg结合疫苗检定项目及指标国药长春所检定项目检定指标已二酰肼含量16-45μg/ml氰化物残留量荚膜多糖结合疫苗菌体多糖结合疫苗ｂ型流感嗜血杆菌结合疫苗绿脓杆菌OSP-TT结合疫苗肺炎球菌结合疫苗副伤寒杆菌OSP-TT结合疫苗AC群脑膜炎球菌结合疫苗大肠杆菌0157:HT结合疫苗艾希氏大肠杆菌结合疫苗大肠杆菌0111结合疫苗伤寒Vi结合疫苗痢疾结合疫苗肺炎克雷伯杆菌结合疫苗01霍乱弧菌结合疫苗甲乙型及变异链球菌结合疫苗O139霍乱弧菌结合疫苗新型隐球菌结合疫苗金黄色葡萄球菌结合疫苗七、结合疫苗的使用和发展现状国药长春所荚膜多糖结合疫苗菌体多糖结合疫苗ｂ型流感嗜血杆菌结合疫苗八、结合疫苗的研究方向1.已逐渐扩展到真菌、寄生虫、人体分泌的激素更为广泛的结合疫苗范围。2.由于其接种效果在儿童中尤为显著，更是儿童疫苗研制的一个热点。3.免疫细胞被激活不仅需要有效抗原刺激，同时需要多种刺激信号，而这种信号部分来源于细胞因子，怎样将结合疫苗与细胞因子联合应用，以达到有效免疫的效果是今后的研究方向之一。4.发展和使用更具免疫活力的蛋白质载体将是新的焦点，在Hib结合疫苗基础研究中，不同载体蛋白，三次免疫后血清抗体水平高于同一载体蛋白的结合疫苗（不同载体蛋白结合同一多糖时激活的TH细胞的克隆系多于单一载体蛋白）。国药长春所八、结合疫苗的研究方向1.已逐渐扩展到真菌、寄生虫、人体分泌九、存在问题1.作为一个单一多糖疫苗基础上进一步化学结合的疫苗，其制造成本较高，发展受到一定限制。2.在具体化学合成中还存在许多问题，其中如多糖和载体蛋白质在结合中均存在自身交联而变形，产生一种新抗原（副反应物）的可能，如何控制它的发生还是一个比较棘手的问题。国药长春所九、存在问题1.作为一个单一多糖疫苗基础上进一步化学结合国谢谢!国药长春所谢谢!国药长春所细菌性疫苗杨丽华2011年3月细菌性疫苗杨丽华1.死疫苗2.活疫苗

3.蛋白类疫苗4.多糖类疫苗

5.多糖蛋白结合疫苗

细菌性疫苗国药长春所1.死疫苗2.活疫苗3.蛋白类疫苗4.多糖类疫苗细菌性疫苗种类23白喉破伤风百日咳疫苗……451霍乱伤寒副伤寒百日咳疫苗……卡介苗鼠疫布氏杆菌伤寒痢疾霍乱疫苗……脑膜炎伤寒vi肺炎流感嗜血杆菌多糖疫苗……AC脑膜炎球菌多糖结合疫苗HIB……脑膜炎伤寒vi流感嗜血杆菌多糖疫苗……国药长春所细菌性疫苗种类23白喉451霍乱卡介苗脑膜炎AC脑膜炎球菌多百日咳疫苗

伤寒疫苗结合疫苗

白喉疫苗国药长春所百日咳疫苗伤寒疫苗结合疫苗白喉疫苗国药长春所白喉疫苗一、白喉概述二、病原学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学四、白喉毒素五、白喉类毒素六、生产工艺七、类毒素的质量检定国药长春所白喉疫苗一、白喉概述国药长春所外毒素对神经系统损害细菌产生的外毒素对心肌损害外毒素对肾脏损害白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病主要临床表现为上呼吸道发炎，常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，白喉疫苗国药长春所外毒素细菌产生外毒素白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。主要白喉流行特点1.传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌没有中间宿主，病人及带菌者是唯一的传染原。2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通过被污的器具和食物传播。3.易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿1岁时白喉易感性达高峰。国药长春所白喉流行特点1.传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌国二、病原学1.细菌形态

白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈棒状，有着色较深的异染颗粒，革兰氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚膜，不形成芽孢。国药长春所二、病原学1.细菌形态国药长春所白喉棒状杆菌显微镜下形态国药长春所白喉棒状杆菌显微镜下形态国药长春所国药长春所白喉棒状杆菌显微镜下形态国药长春所白喉棒状杆菌显微镜下形态2.培养特性白喉杆菌是需氧菌，最适温度为34～35℃。能分解葡萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原硝酸盐，不产生吲哚，不消化蛋白。3.抵抗力⑴.白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和红霉素极敏感。⑵.对消毒剂抵抗力弱，3％苯酚10min可将该菌杀死⑶.不耐热，58℃10mi或100℃1min即可被杀死。国药长春所二、病原学2.培养特性国药长春所二、病原学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学1.致病力自然界中动物不感染白喉，只能在敏感动物中造成人工感染。猴、马、家兔和豚鼠对白喉敏感实验室常用的动物是家兔、豚鼠和NIH小鼠。2.毒素产生遗传学白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的。白喉杆菌的产毒基因是由β嗜菌体携带。β嗜菌体感染无毒白喉杆菌后嗜菌体DNA与细菌DNA整合，形成溶原性白喉杆菌而获得产毒能力（PW8株目前用于白喉类毒素生产)。国药长春所三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学1.致病力国药长春所四、白喉毒素1.白喉外毒素为棒状杆菌β-噬菌体tox基因表达产物,可与细胞表面的特异性受体结合,干扰蛋白质的合成，对人和动物都引起致死性毒性，如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均受到损害。2.白喉毒素是单一多肽，由560个氨基酸组成，分子量为62kDa,等电点pH4.1，在pH6时加热55℃很快失活。3.通过物理和化学方法将其纯化。国药长春所四、白喉毒素1.白喉外毒素为棒状杆菌β-噬菌体tox基因表达细菌毒素甲醛类毒素毒素经甲醛处理后去除毒性而保留免疫原性五、白喉类毒素国药长春所细甲醛类毒素毒素经甲醛处理后去除毒性五、白喉类毒素国药长春甲醛浓度温度PH脱毒影响脱毒因素国药长春所甲醛温度PH脱毒影响脱毒因素国药长春所温度、pH和甲醛浓度等均影响脱毒效果１.温度越高脱毒越快，超过40℃影响抗原性，一般37～38℃。２.在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，在保存过程中由于甲醛的继续作用，可导致脱毒过甚，并影响毒素的稳定性；在碱性时脱毒快，但抗原性损失较大，一般采用弱碱性。３.甲醛浓度大则脱毒快，但抗原损失大。国药长春所温度、pH和甲醛浓度等均影响脱毒效果国药长春所温度升高游离甲醛的浓度低毒素纯度高易发生毒性逆转提高甲醛浓度、脱毒pH、脱毒温度和延长脱毒时间；增加非蛋白氮含量（于精制毒素中加入赖氨酸、精氨酸等）防止或减轻毒性逆转类毒素的毒性逆转国药长春所易发生毒性逆转提高甲醛浓度、脱毒pH、防止或减轻毒性逆转类毒六、白喉疫苗工艺流程

菌种（PW8株）

传代扩增3～4代

发酵罐培养34～35℃培养对数生长末期收获，甲苯杀菌。离心去菌体收集清液超滤浓缩

硫酸铵两段盐析除盐除菌氨离子及无菌检查脱毒甲醛液37℃脱毒试验（家兔）原液检定（浓度、纯度、安全等）

Al(OH)3吸附

成品检定（安全、效价等）国药长春所六、白喉疫苗工艺流程七、类毒素的质量检定1絮状单位（Lf）

是毒素或类毒素与抗毒素的结合单位，只能代表“量”而不能完全代表活性。使用抗毒素絮状单位标准品来测定类毒素的絮状单位。

絮状单位测定

毒素或类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度反应时间等条件下可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉眼可见的絮状凝集反应，根据抗毒素絮状单位标准品可测定类毒素的絮状单位（Lf）值。2纯度：≥1500Lf/mgPN3安全性试验（豚鼠）国药长春所七、类毒素的质量检定1絮状单位（Lf）国药长春所七、类毒素的质量检定4效价测定

类毒素刺激机体产生特异性抗体的免疫应答和对相应抗体的特异性结合反应。⑴小鼠Vero细胞法将标准和待检类毒素2倍稀释3～5个稀释度，皮下免疫NIH小鼠8只（0.5ml/只)，免疫5周采血，根据vero细胞生长情况，以标准品的效价为标准，用平行线分析法进行结果计算。⑵豚鼠毒素攻击法皮下免疫豚鼠10只（1ml/只），免疫4周后用毒素攻击，观察5天根据存活率以标准品的效价为标准，用平行线分析法进行结果计算。国药长春所七、类毒素的质量检定4效价测定国药长春所百日咳疫苗一、百日咳概述二、病原学三、百日咳疫苗发展简史四、无细胞百日咳疫苗㈠、生产工艺流程㈡、质量检定㈢、APV的效果㈣、接种不良反应国药长春所百日咳疫苗一、百日咳概述国药长春所急性脑炎、呕吐、痉挛和昏迷，死亡或脑损伤并发症肺炎形成肺气肿肺不张，甚至死亡。营养缺乏症百日咳是对儿童威胁非常大的传染病，它是由百日咳杆菌引起的一种呼吸道传染病。典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾声或伴有呕吐，可持续数月。百日咳概述国药长春所急性脑炎、呕吐、痉挛和昏迷，死亡或脑损伤并发症肺炎营养缺百日百日咳流行特点1.传染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳病人是传染原。2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通过被污的器具和食物传播。3.易感人群：主要传染对象是6岁以下儿童，1岁以内婴幼儿发病率50%。国药长春所百日咳流行特点1.传染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳二、病原学㈠细菌形态百日咳菌呈革兰氏染色阴性，短杆状或椭圆形国药长春所二、病原学㈠细菌形态国药长春所㈡生长特性1.百日咳菌可分四种相变，Ⅰ相菌毒力最强有免疫原性；Ⅳ相菌毒力消失，无免疫原性；ⅡⅢ相菌介于Ⅰ

Ⅳ相之间。2.百日咳菌是需氧菌，最适温度为35～36℃,最适pH6.8-7.0。3.不发酵任何糖类、不分解糊精，尿素盐，不液化明胶不产生吲哚，不利用枸橼酸盐。国药长春所㈡生长特性1.百日咳菌可分四种相变，Ⅰ相菌毒力最强有免国作用PTFHAAggsPRNACTCTHLT呼吸道粘附作用＋＋＋＋－＋－--细胞毒性＋＋－－＋＋＋＋＋免疫原性＋＋＋＋＋＋＋--1百日咳Ⅰ相菌有两大类抗原菌体O抗原表面K抗原（荚膜物质）2百日咳菌可产生外毒素(PT)内毒素其他生物活性物质，据报道有25种之多。㈡、主要抗原和生物学活性作用PTFHAAggsPRNACTCTHL百日咳菌粘附在上呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖↑↓重患

(FHAPTPRNAgg)下呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖↓细菌不进入组织和血液循环

①干扰吞噬细胞功能AC分泌大量PT②麻痹上皮细胞功能TCT①产生血细胞增多③损伤支气管血管周HLT细胞代谢发生变化②组织胺致敏性增强围组织③分泌胰岛素增强和血糖降低.

㈢、致病机理国药长春所百日咳菌粘附在上呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖㈢、致病机三、百日咳疫苗发展简史㈠粗制百日咳灭活疫苗

第一次世界大战时期，在对病原菌的生物学构造及其与致病机理间的关系缺乏认识的前提下，凭经验制造的灭活疫苗，工艺粗造、含量不确定。㈡全菌体百日咳疫苗(WPV)

以标准化方式生产的，制造疫苗的菌株必须含有123型凝集原（Agg1、Agg2、Agg3）。经过50多年的临床应用证明该疫苗的免疫效果是肯定的，但接种后的不良反应问题一直未解决。㈢无细胞百日咳疫苗(APV)

20世纪80年代初期，对百日咳菌的成分及其所引起生物学作用的认识，产生了APV。㈣基因工程疫苗正在研究中。国药长春所三、百日咳疫苗发展简史㈠粗制百日咳灭活疫苗国药长春所四、无细胞百日咳疫苗1981年日本的佐藤教授等人在纯化出PT和FHA两种抗原的基础上，在世界上第一次研制成功了含有两种抗原成分的无细胞百日咳疫苗，并且与白喉和破伤风类毒素联合制成无细胞百白破联合疫苗。该疫苗在日本开始正式使用，目前日本已经全部取代了菌体百白破疫苗。1992年美国正式批准使用日本生产的无细胞百日咳疫苗。美国获得生产许可证的APV还含有Agg2和PRN。目前WHO已经将其作为儿童预防免疫推荐用疫苗。我国是于80年代中期开始研制无细胞百白破联合疫苗，90年代中期获得正式生产文号。近期的临床试验证明含有5种保护性抗原（PTFHAPRNAgg2

Agg3）的APV效果最佳。国药长春所四、无细胞百日咳疫苗1981年日本的佐藤教授等人在纯化出PT

冻干百日咳菌种（Ⅰ相CS菌株）↓接种血培养基大管培养↓36℃48-72小时培养传代接种发酵罐培养（综合培养基）↓培养≤48小时收集培养物↓第一段硫酸铵盐析及浸提↓第二段硫酸铵盐析及浸提↓透析↓密度梯度离心↓戊二醛脱毒↓透析