扬州大学《现代分子生物学》 分子生物学方法

第五章分子生物学研究方法5.1重组DNA技术发展史5.2DNA操作技术5.3基因克隆技术5.4基因表达研究技术5.5蛋白质组学及研究技术5.1重组DNA技术发展史40年代明确了遗传的物质基础是DNA50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题。50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。

5.1.1重组DNA技术诞生的理论基础5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基

1、DNA分子的切割与连接技术限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA技术的创立具有特别重要的意义。3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应5.1重组DNA技术发展史重组DNA技术(recombinantDNAtechnique):是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。基因克隆(genecloning)分子克隆(molecularcloning)5.1.3重组DNA技术的概念5.1重组DNA技术发展史5.1.4重组DNA技术的基本步骤1、四大要素

①外源基因②载体③工具酶④受体细胞

5.1重组DNA技术发展史2、重组DNA技术的基本步骤

①目的基因的获得与载体的制备②目的基因与载体DNA的连接③重组DNA分子导入受体细胞④重组体的筛选与重组DNA的鉴定⑤克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化5.1重组DNA技术发展史重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交5.1重组DNA技术发展史5.1.5重组DNA技术的意义重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟重组DNA技术缩短了进化时间重组DNA技术使人能对生物进行定向改造体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义。5.1重组DNA技术发展史酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶Ⅰ按5‘到3’方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’-OH末端末端转移酶在双链核酸的3‘末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶Ⅲ从DNA链的3’末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5’末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5’或3’末端的磷酸基团5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶5.1重组DNA技术发展史限制性核酸内切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶分类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）5.1、重组DNA技术发展史第一个字母母取自产生生该酶的细细菌属名，，用大写；；第二、第三三个字母是是该细菌的的种名，用用小写；第四个字母母代表株；；用罗马数字字表示发现现的先后次次序。命名HindⅢ属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆杆菌d株的第三种种酶5.1重重组DNA技术发发展史Ⅱ类酶识别别序列特点点——回文结构(palindrome)即反相重复复结构，是是DNA分子子中以某一一处为轴，，其两侧核核苷酸排列列呈回文对对称的序列列。切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG5.1重重组DNA技术发发展史BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口5.1重重组DNA技术发发展史DNA连接接酶:通通过磷酸酸二酯键把把两个或多多个DNA片断连接接成一个整整体DNA分子。T4¯DNA连接接酶EcoRI连接接酶T7¯DNA连接接酶5.1重重组DNA技术发发展史目的基因的的来源原核细胞真核细胞：：cDNA或或gDNA文库人工合成及及PCR扩扩增目的基基因天然DNA（染色体DNA、病病毒DNA(噬菌体体DNA)、质粒DNA、线线粒体DNA和叶绿绿体DNA）5.1重重组DNA技术发发展史（八）重组组实验中的的主要载体体定义：为携带目的的基因，实实现其无性性繁殖或表表达有意义义的蛋白质质所采用的的一些DNA分子。。5.1重重组DNA技术发发展史克隆载体(cloningvector)为使插入的的外源DNA序列被被扩增而特特意设计的的载体称为为克隆载体体。表达载体(expressionvector)为使插入的的外源DNA序列可可转录翻译译成多肽链链而特意设设计的载体体称为表达达载体。5.1重重组DNA技术发发展史载体的选择择标准能自主复制制；具有两个以以上的遗传标记物，便于重重组体的筛筛选和鉴定定；有克隆位点点（外源DNA插入点点），常具具有多个单单一酶切位位点，称为为多克隆位位点；分子量小，，以容纳较较大的外源源DNA。。5.1重重组DNA技术发发展史噬菌体载体体：双链DNA病毒，约约50kb,两端有有一个12个核苷酸酸5′端突出粘粘性末端λ噬菌体黏粒、YAC、BAC：高容量载体体5.1重重组DNA技术发发展史个克隆载体体所容纳的的外原DNA片段的的大小质粒：10kbλ噬菌体：：23kb黏粒：45kbBAC：350kbYAC：1000kb5.1重重组DNA技术发发展史以质粒为载体的DNA克隆过程5.1重重组DNA技术发发展史5.2.1细菌菌转化5.2常常见的DNA操作作技术转化（transformation）：P151感受态细胞胞（Competentcells）：受体细胞经经过一些特特殊方法（（如：CaCl2等化学试剂剂法）的处处理后，细细胞膜的通通透性发生生变化，能能容许有外外源DNA的载体分分子通过，，处于这种种状态下的的细胞称~将异源DNA分子引引入一细胞胞株系，使使受体细胞胞获得新的的遗传性状状转导？转转染？常用的转化化方法：化学转化（（CaCl2）法电击法5.2常常见的DNA操作作技术化学转化原原理：在0℃冷冻冻处理时，，处于CaCl2低渗溶液液中的大肠肠杆菌细胞膨胀胀成球形。。DNA可可吸附于其其表面。在在短暂的热冲击下，，细胞吸收收外源DNA，然然后在丰富富培养基内内复原并增殖殖，表达外外源基因。。5.2常常见的DNA操作作技术5.2常常见的DNA操作作技术P1535.2常常见的DNA操作作技术电击转化：：使用低盐缓缓冲液或水水洗制备的的感受态细细胞，通过过高压脉冲的的作用将载载体DNA分子导入入受体细胞胞。菌液：生长长对数期场强(最大大转化效率率)：12.5-15kV/cm温度：0-4℃5.2常常见的DNA操作作技术克隆的筛选选：抗生素基因因。常用的抗生生素有：氨氨苄青霉素素、卡那霉霉素、氯霉霉素、四环环素、链霉霉素等-互补蓝白斑斑筛选营养条件（（自养、异异养）5.2常常见的DNA操作作技术-互补筛筛选5.2常常见的DNA操作作技术β-半乳糖糖苷酶基因因（LacZ）的调调控序列和和氨基端（（N端）146个氨氨基酸编码码序列的质质粒编码β-半半乳糖苷酶酶羧基端（（C端）部部分序列的的宿主细胞胞IPTG/X-gal的培养养基上筛选选蓝白斑蓝白斑筛选选LacZ,IPTGX-galX+gal（白色）（（蓝色））LacZ（失活））,IPTGX-galX-gal（白色）（（白色色）5.2常常见的的DNA操操作技术蓝白斑5.2常常见的的DNA操操作技术转化率的计计算：转化体总数数＝菌落数数×（转化化反应原液液总体积/涂板菌液液体积）插入频率＝＝白色菌落落数/蓝色色菌落数+白色菌落落数转化频率＝＝转化体总总数/加入入质粒DNA的量（（计算出每每微克的转转化菌落数数）5.2常常见的的DNA操操作技术5.2.2聚合酶酶链式反应应（PCR）技术1985年年，K.Mullis等研究究成功的一一种在体外外快速扩增增特定基因因DNA序序列的方法法原理：类似于天天然的DNA复制过过程。将待待扩增的DNA片段段和两侧互互补的两段段寡核苷酸酸引物，经经过变性，，退火和延延伸若干个个循环后，，DNA扩扩增倍数可可达2n倍5.2常常见的的DNA操操作技术反应体系模板DNA：待扩增的目目的片段特异性引物物：人工合成的的与待扩增增的靶DNA两端序序列互补的的寡核苷酸酸片段，15-30bpDNA聚合合酶dNTP含有Mg2+的缓冲液5.2常常见的的DNA操操作技术PCR的基基本反应步步骤：1.变性：95℃，，模板DNA变性性为单链；；2.退火：50℃左左右，使引引物与模板板DNA退退火结合；；3.延伸：72℃，，DNA聚合酶以以dNTP为底物催催化DNA的合合成反应。。上述三个步步骤为一个个循环，经经25-30次循环后，可将将模板DNA扩增达达百万倍。。5.2常常见的的DNA操操作技术PCR技术术在基因克克隆方面的的应用（1）目的基因因的直接克克隆，（2）通过过RT-PCR进行行cDNA的克隆；；（3）制备备DNA探探针，进行行分子检测测等。5.2常常见的的DNA操操作技术5.2.3cDNA文库cDNA文文库(complementaryDNAlibrary)以组织细细胞中的mRNA为为模板，反反转录合成成双链cDNA，，各cDNA分子分分别插入载载体形成重重组子，再再导入宿主主细胞克隆隆扩增。这这些在重组组体内的cDNA的的集合即cDNA文文库。5.2常常见的的DNA操操作技术构建步骤：：1、高质量量mRNA制备：纯纯化试剂盒盒，生物素素P1562、反转录录生成cDNA:反反转录酶酶，olig(dt),R63、与噬菌菌体载体分分子连接4、噬菌体体的包装5.2常常见的的DNA操操作技术5.2常常见的的DNA操操作技术5.2常常见的的DNA操操作技术文库中筛选选目的基因因DNA探针针：带有特殊殊碱基序列列的单链DNA或RNA分子子,可以用用放射性物物质或免疫疫性物质标标记,通过过杂交,DNA探针常用于检测测互补的碱碱基序列。。5.2常常见的的DNA操操作技术5.2.3SNP技技术应用（singlenucleotidepolymorphism）单单核苷酸多多态性，指指基因组DNA序列列中由于单单个核苷酸酸的突变而而引起的多多态性一个SNP表示在基基因组某个个位点上有有一个核苷苷酸的变化化，源于单单个碱基的的转换或颠颠换应用用：：遗遗传传病病研研究究、、动动植植物物遗遗传传育育种种5.2常常见见的的DNA操操作作技技术术5.2.4基基因因敲敲除除技技术术（（geneknock-out））通过过一一定定的的途途径径使使特特定定的的基基因因失失活活或或缺缺失失的的技技术术。。通通常常意意义义上上的的基基因因敲敲除除主主要要是是应应用用DNA同同源源重重组组原原理理，，用用同同源源片片段段替替代代靶靶基基因因片片段段，，进进行行精精确确的的定定位位修修饰饰和和基基因因改改造造，，同同染染色色体体一一起起稳稳定定遗遗传传二、、常常见见的的DNA操操作作技技术术完全全基基因因敲敲除除条件件型型基基因因敲敲除除植物物基基因因敲敲除除株株系系筛筛选选（（T-DNA插插入入失失活活））5.2常常见见的的DNA操操作作技技术术5.3基基因因克克隆隆技技术术简简介介5.3.1RACE(rapidamplificationofcDNAends)一种种通通过过PCR进进行行cDNA末末端端快快速速克克隆隆的的技技术术，，是是以以mRNA为为模模板板反反转转录录成成cDNA第第一一链链后后用用PCR技技术术扩扩增增出出某某个个特特异异位位点点到到3′或5′端之之间间未未知知序序列列的的方方法法。。mRNA的的获获取取去磷磷酸酸化化加寡寡聚聚接接头头（（5′′））反转转录录合合成成第第一一条条cDNA5´´RACE，，扩扩增增5未未知知序序列列3′′RACE扩扩增增3′未知知序序列列5′′已已知知的的接接头头序序列列；；基因因特特异异反反向向序序列列3′′寡寡聚聚dT下下游游序序列列；；基因因特特异异反反向向序序列列5.3基基因因克克隆隆技技术术简简介介5.3.1cDNA差差示示分分析析法法(cDNA-RDA法法)差减减杂杂交交与与RT-PCR方方法法相相结结合合，，通通过过降降低低cDNA群群体体复复杂杂性性和和更更换换cDNA两两端端接接头头等等方方法法，，特特异异扩扩增增目目的的基基因因片片段段5.3基基因因克克隆隆技技术术简简介介5.3基基因因克克隆隆技技术术简简介介主要要步步骤骤是是：：mRNA逆逆转转录录为为cDNA，，用用4碱碱基基识识别别酶酶消消化化，，与与接接头头1连连接接，，PCR扩扩增增；；去去除除接接头头1，，扩扩增增子子接接上上接接头头2，，与与驱驱逐逐子子杂杂交交，，PCR扩扩增增；；去去除除接接头头2，，加加上上接接头头3，，再再与与driver杂杂交交，，再再扩扩增增，，筛筛选选出出目目的的片片段段、、克克隆隆、、测测序序。。5.3.3酵酵母母双双杂杂交交体体系系（（Yeasttow-hybridsystem））基于于对对真真核核生生物物调调控控转转录录起起始始过过程程的的认认识识，，高高灵灵敏敏度度的的研研究究蛋蛋白白质质之之间间关关系系的的技技术术。。。。细胞胞起起始始基基因因转转录录需需要要有有反反式式转转录录激激活活因因子子的的参参与与。。反式式转转录录激激活活因因子子GAL4：：DNA结结合合功功能能域域(DNAbindingdomain,DNA-BD)转录录激激活活结结构构域域（（activationdomain，，DNA-AD））被分分开开的的两两者者通通过过适适当当的的途途径径在在空空间间上上较较为为接接近近时时，，才才能能重重新新呈呈现现完完整整的的GAL4转转录录因因子子活活性性，，并并可可激激活活上上游游激激活活序序列列（（upstreamactivatingsequence,UAS））的的下下游游启启动动子子，，使使下下游游基基因因得得到到转转录录。。5.3基基因因克克隆隆技技术术简简介介5.3基基因因克克隆隆技技术术简简介介主要要实实验验过过程程：：a.选选择择缺缺失失GAL4编编码码基基因因的的酵酵母母寄寄主主菌菌株株b.研研究究的的猎猎物物(或或称称靶靶蛋蛋白白)蛋蛋白白的的基基因因与与编编码码AD的的序序列列结结合合c.诱诱饵饵(bait)蛋蛋白白的的基基因因与与编编码码BD的的序序列列结结合合,形形成成两两段段融融合合基基因因d.将将共共转转化化的的酵酵母母菌菌株株涂涂布布于于选选择择培培养养基基上上，，筛筛选选表表达达相相互互作作用用的的杂杂种种蛋蛋白白（（激激活活报报告告基基因因转转录录））的的阳阳性性菌菌落落。。5.3基基因因克克隆隆技技术术简简介介酵母母双双杂杂交交系系统统的的应应用用：：发现现新新蛋蛋白白和和蛋蛋白白的的新新功功能能研究究抗抗原原和和抗抗体体的的作作用用（（细细胞胞内内））筛选选药药物物的的作作用用位位点点建立立基基因因组组蛋蛋白白连连锁锁图图5.3基基因因克克隆隆技技术术简简介介1986年年提提出出，，根根据据目目的的基基因因在在染染色色体体上上的的位位置置进进行行的的，，无无需需预预先先知知道道基基因因的的DNA顺顺序序，，也也无无需需预预先先知知道道其其表表达达产产物物的的有有关关信信息息，，但但必必须须建建立立遗遗传传