基因工程的酶学基础课件

第三章

基因工程的酶学基础第三章

基因工程的酶学基础1第一节、限制性核酸内切酶第二节、ＤＮＡ连接酶第三节、DNA聚合酶第四节、其他酶第一节、限制性核酸内切酶2一、限制性核酸内切酶

（restrictionendonuclease）这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶一、限制性核酸内切酶31、寄主控制的限制（restriction）与修饰(modification)现象

人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉1、寄主控制的限制（restriction）4第三章基因工程的酶学基础课件5E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶

当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ6作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解R/M体系：

寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶作用：R/M体系：7限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类：

Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶2、限制性内切酶的分类限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，8阿尔伯(1929～)1965年W.Arber（瑞士）首次从理论上提出了生物体内存在着一种具有切割基因功能的限制性内切酶，并于1968年成功分离出I型限制性内切酶。1970年，美国分子生物学家、遗传学家H·O·Smith（史密斯）（1931～）分离出了II型限制性内切酶。1971年，美国微生物遗传学家D·Nathans内森斯（1928～）使用II型限制性内切酶首次完成了对基因的切割。他们的研究成果为人类在分子水平上实现人工基因重组提供了有效的技术手段，他们于1978年获得诺贝尔生理学或医学奖。阿尔伯(1929～)1965年W.Arber（9

分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。

Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。

Ⅰ型酶：1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。Ⅰ型酶：1968年，M10

这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24～26bp处切开DNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。

Ⅲ型酶这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24～11分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。

识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。

许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。Ⅱ型酶分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二12主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMMg2+Mg2+SAMATP识别序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋转对称序列GAGCCCAGCAG切割位点距距识别序列1kb处随机性切割识别序列内或附近特异性切割识别序列下游24--26bp处主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白13

第一个字母：大写，表示所来自的微生物属名的第一个字母

第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母

其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号

罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号

3、限制性核酸内切酶的命名原则例：

EcoRI:来自于Escheria

coli

RY13的第一个限制酶

第一个字母：大写，表示所来自的微生物属名的第一个字母14同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶Haemophilusinfluenzaed属名种名株名嗜血流感杆菌d株HindIIHindIII1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出

HindII和HindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶Haemophil151.限制酶识别靶序列同DNA的来源无关；2.限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限制酶只具一个限制位点的质粒）。4、限制酶的特性4、限制酶的特性16二、Ⅱ型酶二、Ⅱ型酶171、II型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构1、II型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分18第三章基因工程的酶学基础课件192.核酸内切酶作用后的断裂方式

（1）粘性末端：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。（2）平末端:两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。5´-端突出粘性末端

3´-端突出5´

AATTC

3´Ｇ

5´Ｇ

3´ACGTC2.核酸内切酶作用后的断裂方式（1）粘性末端：两条链20EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A21PstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C22SmaⅠ等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-C-C-G-G-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-G-G-C-C-C-C-T-C…5’SmaⅠ等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-C-C-G-G23第三章基因工程的酶学基础课件24指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶，同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶(CCGG)，当靶序列中有一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行切割，而MspⅠ可以。3．同裂酶（isoschizomers)指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶，同裂酶进行同样25指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。4．同尾酶（isocaudamer）指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸26

杂种位点（hybridsite）由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点,一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。

BamHⅠG

GATCCBclⅠT

GATC

A

C

CTAG

G

A

CTAG

T杂种位点：T

GATC

C（BamHⅠ）

（BclⅠ）

ACTAG

G

杂种位点（hybridsite）27

（１）分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。5．限制片断的末端连接作用5．限制片断的末端连接作用28（2）分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子（2）分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配296.II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件Tris--HCl50mMpH7.5MgCl210mM0-50mM低盐酶NaCl0-150mM100mM中盐酶DTT1mM150mM高盐酶Volume20-100μlT37℃1-1.5h1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1μg标准DNA所需的酶量6.II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内30对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’II型核酸内切酶的多酶联合酶解：5‘…GCTACATGGATTCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’II型核酸内切酶的多酶联合酶解：5‘…GCTACATG31（１）DNA的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等DNase的污染(Mg++)

a.增加核酸内切限制酶的用量；b.扩大酶催化反应的体系（稀释）；

c.延长酶催化反应的保温时间。d.加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度7．影响核酸内切酶活性的因素：7．影响核酸内切酶活性的因素：32（2）DNA的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC’3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG’3或5‘CCTGG’3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG’3序列中的C5位上引入甲基（2）DNA的甲基化程度33第三章基因工程的酶学基础课件34高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象。EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC’3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘PuPuATTPyPy3’或者5‘AATT’3（3）核酸内切酶的缓冲液性质嘧啶碱基T/C嘌呤碱基A/G高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等35（4）酶切消化反应的温度：

大多数酶的标准反应温度37度（5）DNA的分子结构：

某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍（4）酶切消化反应的温度：36（1）.氯化镁、氯化钠或氯化钾：

不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变

（2）.Tris-HCl：

维持最适的pH值（pH＝7.4）（3）.β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：

维持酶的稳定性（4）.牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性8．核酸内切限制酶标准的缓冲液8．核酸内切限制酶标准的缓冲液37（1）核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用（2）核酸内切限制酶对DNA的局部消化完全的酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切限制酶，对DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平9．核酸内切限制酶对DNA的消化作用9．核酸内切限制酶对DNA的消化作用38小分子量的片断-----少（电泳-容易分离目的片断）大分子量的片断-----多（基因文库）

（3）核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用小分子量的片断-----少（电泳-容易分离目的片断）（339一、ＤＮＡ连接酶二、体外连接一、ＤＮＡ连接酶40一、ＤＮＡ连接酶能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。1.ＤＮＡ连接酶的作用机理一、ＤＮＡ连接酶能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基41第三章基因工程的酶学基础课件42磷酸酰胺键赖氨酸残基腺苷－磷酸DNA的腺苷酸复合物3’-OH对P原子作亲核攻击形成磷酸二酯键连接酶的作用机理此反应是由焦磷酸(ppi)的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键磷酸酰胺键赖氨酸残基腺苷－磷酸DNA的腺苷酸复合物连接酶的作431)DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码的2)T4DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的

DNA连接酶－－NAD+T4DNA连接酶－－ATP2.连接酶的来源1)DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码的2.连接酶44该酶常从Ｔ４噬菌体的受体细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化DNA中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。3.T４DNA连接酶（DNAligase）3.T４DNA连接酶（DNAligase）45第三章基因工程的酶学基础课件46（1）反应温度：连接缺口的温度：37度连接粘性末端的最佳温度：4～16度（2）Ｔ４ＤＮＡ连接酶的用量：平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。ATP的用量10μmol～1mmol/L之间（3）提高外源片断与载体的浓度的比值（10～20倍）4.影响连接酶作用的因素（1）反应温度：4.影响连接酶作用的因素471.用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断2.用T4DNA连接酶将平末端的DNA片断连接；或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用DNA连接酶连接。3.先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接

体外连接的三种方式二、体外连接1.用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断体外连接48

由于具粘性末端的载体易发生自连，对载体的5’末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。而外源片断的5’-P能与载体的3’-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5’-P的链不能进行连接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。

1.粘性末端DAN片断的连接1.粘性末端DAN片断的连接49第三章基因工程的酶学基础课件50第三章基因工程的酶学基础课件51

（1）T4DNA连接酶（2)用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法2.平末端DNA片断的连接2.平末端DNA片断的连接52

2.1同聚物加尾法用5’末端特异的核酸外切酶处理DNA片断在A和B分别中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10～40个碱基2.1同聚物加尾法用5’末端特异的核酸外切酶处理DNA片53同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，对获得插入片断进行进一步的研究。

应用适当的dNTP加尾，再生出共外源DNA片段插入的有用的限制位点。右图说明了如何用poly（dT）加尾法再生出HindⅢ限制位点的情况。同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的542.2衔接物连接法平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点

HpaIIHpaIIBamHI

或Sau3A2.2衔接物连接法HpaII55

衔接物（linker）：是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。

衔接物（linker）：是指用化学方法合成的一段由10～156衔接物连接法衔接物连接法57双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再58双衔接物连接法的基本程序cDNA链的合成通过DNA聚合酶合成第二链加入SalI衔接物SI核酸酶作用后的末端单链突出序列，由Klenow补齐，加入第二衔接物EcolI双衔接物连接法的基本程序cDNA链的合成通过DNA聚合酶合成59在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内601978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能产生稳定的二聚体分子。2.3DNA接头（adapter）连接法：1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴61第三章基因工程的酶学基础课件62DNA接头连接法goDNA接头连接法go63第三节、DNA聚合酶第三节、DNA聚合酶64一、大肠杆菌DNA聚合酶、二、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片断酶、三、T4DNA聚合酶、四、T7DNA聚合酶、五、反转录酶等。常用的DNA聚合酶常用的DNA聚合酶65共同点：

把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。共同点：66一、大肠杆菌DNA聚合酶

DNA聚合酶Ｉ（PolＩ）、DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）、DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）、

PolＩ和PolⅡ的主要功能参与DNA的合成；PolⅢ的功能同DNA的复制有关；PolＩ同DNA分子克隆的关系最为密切。一、大肠杆菌DNA聚合酶671957年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为109×103dal。1.大肠杆菌DNA聚合酶ＩDNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成两个片断，一个具有全部的3’5’的外切酶活性和5’3’的聚合酶活性，另一个具有全部5’3’的外切酶活性。1.大肠杆菌DNA聚合酶ＩDNA聚合酶Ｉ，可以被蛋68

1)底物：四种脱氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；2)Mg＋＋离子；3)带有3’-OH游离基团的引物链；4)DNA模板：单链，双链（糖-磷酸主键上有一个或多个断裂）。

2.DNA聚合酶Ｉ发挥作用的条件：2.DNA聚合酶Ｉ发挥作用的条件：693.DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性

1)5’3’的外切酶活性，所切割的DNA链必须是位于双螺旋的区段上；

2)切割部位可以是末端磷酸二酯键，也可以是在距5’末端数个核苷酸远的一个键上发生；

3)DNA的合成可以增强5’3’的核酸外切酶活性；

4)5’3’核酸外切酶的活性位点同聚合作用的活性位点以及3’5’的水解作用位点是分开的。3.DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性

70第三章基因工程的酶学基础课件71

能催化DNA链发生水解作用，从DNA链3’-OH末端开始向5’的方向水解DNA，并释放出单核苷酸分子。

对酶活的影响：

反应物中缺乏dNTPs时，大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性，将会发挥作用。但对于底物是双链的DNA，在具有dNTPs时，这种降解活性将会被5’3’的聚合酶活性所抑制。

4.DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性4.DNA聚合酶Ｉ的3’72

73

通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针

DNA缺口转移（nicktranslationnicktranslation）

在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸，但polＩ不能在3’-OH和5’-P之间形成一个键，随着5’一侧的核苷酸不断移去，3’一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成的方向移动

5.DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：5.DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：74第三章基因工程的酶学基础课件75

典型的反应体系是。在25μl总体积中含有1μg纯化的特定DNA片断，并加入适量的DnaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未标记的dNTPs。

DnaseＩ：造成DNA分子的断裂或缺口；PolＩ：进行缺口转移，使反应混合物中的32p标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸，最终从头到尾都被标记。DNA杂交探针的制备DNA杂交探针的制备76第三章基因工程的酶学基础课件77

在低浓度dNTPs的条件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs浓度时，PolＩ则能够更有效的合成DNA。低浓度的32p-dNTPs（2μmol/L）和高浓度的dNTPs（20μmol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs参入DNA链（DnaseＩ数量）。

dNTP对PolＩ酶活性的影响dNTP对PolＩ酶活性的影响78

Klenow片断：是由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的分子量为76×1000dal的大片断分子。仍具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性，失去了全酶的5’3’外切酶活性。

二、Klenow片断与DNA末端标记二、Klenow片断与DNA末端标记79（1）、修补经限制酶消化的DNA所形成的3’隐蔽末端；（2）、标记DNA片断的末端；（3）、cDNA克隆的第二链cDNA的合成；（4）、DNA序列的测定。1.Klenow片断的主要用途：1.Klenow片断的主要用途：80

具有3’隐蔽末端的带标记得的DNA片断

5’GATCT…3’3’A…5’在反应物中加入Klenow聚合酶α-32p-dGTP,一道温育后生成：

5’GATCT…3’

3’32pGA…5’

或是同时加入α-32p-dATP＋dGTP5’GATCT…3’3’32p

AGA…5’2.DNA片断末端标记2.DNA片断末端标记81DNA片断末端标记可以作为用凝胶电泳法测定分子大小的标记样品。因为被标记的DNA片断是同它们的摩尔浓度成比例，而与他们的分子大小无关。所以在限制酶消化过程产生的大小DNA片断都得到了同等程度的标记。不能够有效的标记带有5’突出末端的DNA分子。DNA片断末端标记可以作为用凝胶电泳法测定分子大小82

1）从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶。具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性。2）在没有脱氧核苷三磷酸存在的情况下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的独特功能。作用于双链DNA片断，并按3’5’的方向从3’-OH末端开始降解DNA。如果反应物中存在一种dNTP时，它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止。3）在反应过程中，通过T4DNA聚合作用，反应物中的α-32p-dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片断上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。

三、T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片断三、T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片断83

外切酶活性

聚合酶活性

无dNTPdNTP外切酶活性84具EcoR1位点的DNA分子对DNA分子3‘端有控制的降解合成作用产生选择性标记T4DNA聚合酶的取代合成法标记DNA断末端及制备链的特异探针具EcoR1位点的DNA分子对DNA分子3‘端有控制的降解合85这类酶来自于反转录病毒，它可以RNA为模板，催化合成DNA。常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。四、反转录酶（reversetranscriptase）这种酶是1970年美国科学家特明（H.M.Temin）和巴尔的摩（D.Baltimore）分别于动物致癌RNA病毒中发现的，他们并因此获得1975年度诺贝尔生理学或医学奖。（DavidBaltimore）HowardM.Temin这类酶来自于反转录病毒，它可以RNA为模板，催化86含有逆转录酶的病毒叫做反转录病毒，逆转录酶催化的反应叫反转录（reve-rsetranscrip-tion）。在这个过程中，遗传信息流动的方向是从RNA到DNA，正好与转录过程相反，故称反转录。病毒逆转录酶含Zn2+，以脱氧核苷三磷酸为底物，从5’到3’合成DNA，反应需要引物。这个酶在许多方面与DNA聚合酶相似。目前已发现不少动物反转录病毒，近年来也发现了几种人类反转录病毒。艾滋病毒也是一种反转录病毒。

有的逆转录酶已提纯，可作为合成某些特定RNA的互补DNA的工具酶，也可用于DNA的序列分析和克隆重组DNA。含有逆转录酶的病毒叫做反转录病毒，逆转录酶催化的反87第三章基因工程的酶学基础课件88反转录酶所需模板可以是RNA或DNA，引物是带3`-OH的RNA或DNA。它有5‘--3’合成DNA活性，但是无3‘-5’外切活性。AMV（禽成髓细胞瘤病毒）反转录酶包含两条多肽链，具5‘--3’DNA聚合活性和很强的RNA酶H活性。M-MuLV（鼠白血病病毒）反转录酶是单链多肽，84kDa，其RNaseH活性弱，有利于合成较长cDNA。反转录酶所需模板可以是RNA或DNA，引物是带3`-OH的R891978年，S.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。具有5’3’的聚合酶活性和很高的单链及双链的3’5’核酸外切酶活性。

五、T7DNA聚合酶：用途：（1）用于对大分子量模板的延伸合成；（不受DNA二级结构的影响，聚合能力较强可延伸合成数千个核苷酸）（2）通过延伸或取代合成法标记DNA3’末端（3）将双链DNA的5’或3’突出末端转变成平末端的结构。1978年，S.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆90六、修饰的T7DNA聚合酶

对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失去3’5’的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。用途：

（1）作为一种DNA序列分析的工具酶：加工性能高；无3’5’的外切酶活性；具有催化脱氧核糖类似物聚合的能力。（2）制备探针；可催化较低水平的dNTP（<0.1μmol/L）参入。（3）有效的填补和标记具有5’突出末端的DNA片断的3’-末端。聚合作用高；失去了3’5’的外切酶活性六、修饰的T7DNA聚合酶用途：91第四节其他酶一、T4多核苷酸激酶二、末端核苷酸转移酶三、碱性磷酸酶四、S1核酸酶五、Rnase七、DNaseI六、RNaseH第四节其他酶一、T4多核苷酸激酶二、末端核苷酸转移酶三92该酶的用途是：

①为化学测序法标记DNA的5’末端；

②在DNA片段连接之前，使5’-磷酸末端缺失，减少非特异性克隆。一、T4多核苷酸激酶（polynucleotidekinase,PNK）

T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，最初也是从T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞中分离出来的，因此又叫做T4多核苷酸激酶。

T4多核苷酸激酶催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA分子的5′-OH末端，当使用γ-32P标记的ATP作前体物时，多核苷酸激酶便可以使底物核酸分子的5′-OH末端标记上γ-32P。这种标记又叫做正向反应（forwardreaction），是一种十分有效的过程，它常用来标记核酸分子的5′-末端，或是使寡核苷酸磷酸化。一、T4多核苷酸激酶T4噬菌体的pseT基因编码的93第三章基因工程的酶学基础课件94第三章基因工程的酶学基础课件95该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化5’脱氧核苷三磷酸进行5’－3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。

二、末端核苷酸转移酶（terminaltransferase）二、末端核苷酸转移酶（terminaltransferas96它不需要模板，可以用含有的3’-OHDNA片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA,也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA它不需要模板，可以用含有的3’-OHDNA片段为引物，97用途：

1.催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端。可用于测序的终止，一般不含游离的3’-OH末端2.催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端：生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点3.用于在平头DNA上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端用途：98三、碱性磷酸酶

来自于大肠杆菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛肠（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。CIP的比活性比BAP的高出10-20倍，CIP在SDS中68℃就可完全失活，而BAP却是热抗性酶。三、碱性磷酸酶CIP的比活性比BAP的高出10-99第三章基因工程的酶学基础课件100来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理，降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍Zn2+必需最适pH范围为4.0---4.3需要NaCl10-300mM降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍四、S1核酸酶特点：来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末101第三章基因工程的酶学基础课件102S1核酸酶降解单链DNA或RNA(Vogtetal．1973)，产生带5‘磷酸的单链核苷酸或寡核苷酸。双链DNA、双链RNA及DNA-RNA杂交体对此酶相对不敏感。然而如果所用S1核酸酶的酶量非常大，则双链核酸可被完全消化。中等量的S1核酸酶可在切口或小缺口处切割双链核酸(KroekerandKowalski

1978)用途:(1)分析DNA-RNA杂交体的结构(BerkandSharp

1977，Favaloroetal．1980)(2)去除DNA片段中突出的单链尾以产生平端(3)打开双链cDNA合成中产生的发夹环S1核酸酶降解单链DNA或RNA(Vogtetal．19103五、RnaseRNase

大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。

1.RNaseA

分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min仍具活性）,用于除去DNA样品中的RNA分子

2.核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源miRNA五、RnaseRNase104

RNA酶A是内切核糖核酸酶，可特异地攻击RNA上嘧啶残基的3‘端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。反应终产物是嘧啶3’磷酸及末端带嘧啶3‘磷酸的寡核苷酸。用途：(1)从DNA-RNA或RNA—RNA杂合体中去除未杂合的RNA区。(2)确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。在此方法中，RNA-DNA或RNA-RNA杂合体上的单碱基错配可被RNA酶A识别并切割。利用含SP5或T7噬菌体启动子的质粒，在体外合成与野生型DNA或RNA互补的32p标记RNA探针，然后与待检含单碱基置换的DNA或RNA退火，所产生的单碱基错配可用RNA酶A切割，通过凝胶电泳分析切割产物的大小即可确定错配的位置。在所有各种可能的单碱基错配中，大约50％可用此法确定。

制备不含DNA酶的核糖核酸酶

将胰核糖核酸酶(RNaseA)溶解在0．01moI／L醋酸钠(pH5．2)中，使终浓度为10mg／m[，加热到100oC，15min，在室温下缓慢冷却。用0．1体积的1M的Tris-C1调整pH至7．4后，分装小管保存在—20C备用。当浓缩的溶液在中性pH条件下加热到100C时，核糖核酸酶产生沉淀。RNA酶A是内切核糖核酸酶，可特异地攻击RNA上嘧105第三章基因工程的酶学基础课件106六、RNaseH作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。

六、RNaseH作用于DNA-RNA杂交分子中的RN107七、DNaseI1.特点：具内切酶活性，作用于ds-DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5’-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或Ca2+,Mn2+可使酶活达最大值当酶浓度很低时，ds-DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg2+存在时，两条链上的切口独立无关，Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置2.用途

1)切口移位，制备DNA探针2)制备RNA样品时除去DNA分子3)基因突变时产生切口七、DNaseI1.特点：108DNaseI

DNaseI109Mn++存在时

Mg++存在时

DNaseI作用特点DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI与PolI的切口移位PolIMn++存在时Mg++存在时DNaseIDNaseI110第三章

基因工程的酶学基础第三章

基因工程的酶学基础111第一节、限制性核酸内切酶第二节、ＤＮＡ连接酶第三节、DNA聚合酶第四节、其他酶第一节、限制性核酸内切酶112一、限制性核酸内切酶

（restrictionendonuclease）这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶一、限制性核酸内切酶1131、寄主控制的限制（restriction）与修饰(modification)现象

人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉1、寄主控制的限制（restriction）114第三章基因工程的酶学基础课件115E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶

当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ116作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解R/M体系：

寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶作用：R/M体系：117限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类：

Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶2、限制性内切酶的分类限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，118阿尔伯(1929～)1965年W.Arber（瑞士）首次从理论上提出了生物体内存在着一种具有切割基因功能的限制性内切酶，并于1968年成功分离出I型限制性内切酶。1970年，美国分子生物学家、遗传学家H·O·Smith（史密斯）（1931～）分离出了II型限制性内切酶。1971年，美国微生物遗传学家D·Nathans内森斯（1928～）使用II型限制性内切酶首次完成了对基因的切割。他们的研究成果为人类在分子水平上实现人工基因重组提供了有效的技术手段，他们于1978年获得诺贝尔生理学或医学奖。阿尔伯(1929～)1965年W.Arber（119

分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。

Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。

Ⅰ型酶：1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。Ⅰ型酶：1968年，M120

这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24～26bp处切开DNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。

Ⅲ型酶这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24～121分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。

识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。

许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。Ⅱ型酶分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二122主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMMg2+Mg2+SAMATP识别序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋转对称序列GAGCCCAGCAG切割位点距距识别序列1kb处随机性切割识别序列内或附近特异性切割识别序列下游24--26bp处主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白123

第一个字母：大写，表示所来自的微生物属名的第一个字母

第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母

其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号

罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号

3、限制性核酸内切酶的命名原则例：

EcoRI:来自于Escheria

coli

RY13的第一个限制酶

第一个字母：大写，表示所来自的微生物属名的第一个字母124同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶Haemophilusinfluenzaed属名种名株名嗜血流感杆菌d株HindIIHindIII1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出

HindII和HindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶Haemophil1251.限制酶识别靶序列同DNA的来源无关；2.限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限制酶只具一个限制位点的质粒）。4、限制酶的特性4、限制酶的特性126二、Ⅱ型酶二、Ⅱ型酶1271、II型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构1、II型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分128第三章基因工程的酶学基础课件1292.核酸内切酶作用后的断裂方式

（1）粘性末端：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。（2）平末端:两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。5´-端突出粘性末端

3´-端突出5´

AATTC

3´Ｇ

5´Ｇ

3´ACGTC2.核酸内切酶作用后的断裂方式（1）粘性末端：两条链130EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A131PstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C132SmaⅠ等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-C-C-G-G-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-G-G-C-C-C-C-T-C…5’SmaⅠ等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-C-C-G-G133第三章基因工程的酶学基础课件134指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶，同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶(CCGG)，当靶序列中有一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行切割，而MspⅠ可以。3．同裂酶（isoschizomers)指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶，同裂酶进行同样135指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。4．同尾酶（isocaudamer）指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸136

杂种位点（hybridsite）由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点,一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。

BamHⅠG

GATCCBclⅠT

GATC

A

C

CTAG

G

A

CTAG

T杂种位点：T

GATC

C（BamHⅠ）

（BclⅠ）

ACTAG

G

杂种位点（hybridsite）137

（１）分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。5．限制片断的末端连接作用5．限制片断的末端连接作用138（2）分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子（2）分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配1396.II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件Tris--HCl50mMpH7.5MgCl210mM0-50mM低盐酶NaCl0-150mM100mM中盐酶DTT1mM150mM高盐酶Volume20-100μlT37℃1-1.5h1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1μg标准DNA所需的酶量6.II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内140对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’II型核酸内切酶的多酶联合酶解：5‘…GCTACATGGATTCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’II型核酸内切酶的多酶联合酶解：5‘…GCTACATG141（１）DNA的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等DNase的污染(Mg++)

a.增加核酸内切限制酶的用量；b.扩大酶催化反应的体系（稀释）；

c.延长酶催化反应的保温时间。d.加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度7．影响核酸内切酶活性的因素：7．影响核酸内切酶活性的因素：142（2）DNA的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC’3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG’3或5‘CCTGG’3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG’3序列中的C5位上引入甲基（2）DNA的甲基化程度143第三章基因工程的酶学基础课件144高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象。EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC’3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘PuPuATTPyPy3’或者5‘AATT’3（3）核酸内切酶的缓冲液性质嘧啶碱基T/C嘌呤碱基A/G高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等145（4）酶切消化反应的温度：

大多数酶的标准反应温度37度（5）DNA的分子结构：

某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍（4）酶切消化反应的温度：146（1）.氯化镁、氯化钠或氯化钾：

不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变

（2）.Tris-HCl：

维持最适的pH值（pH＝7.4）（3）.β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：

维持酶的稳定性（4）.牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性8．核酸内切限制酶标准的缓冲液8．核酸内切限制酶标准的缓冲液147（1）核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用（2）核酸内切限制酶对DNA的局部消化完全的酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切限制酶，对DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平9．核酸内切限制酶对DNA的消化作用9．核酸内切限制酶对DNA的消化作用148小分子量的片断-----少（电泳-容易分离目的片断）大分子量的片断-----多（基因文库）

（3）核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用小分子量的片断-----少（电泳-容易分离目的片断）（3149一、ＤＮＡ连接酶二、体外连接一、ＤＮＡ连接酶150一、ＤＮＡ连接酶能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。1.ＤＮＡ连接酶的作用机理一、ＤＮＡ连接酶能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基151第三章基因工程的酶学基础课件152磷酸酰胺键赖氨酸残基腺苷－磷酸DNA的腺苷酸复合物3’-OH对P原子作亲核攻击形成磷酸二酯键连接酶的作用机理此反应是由焦磷酸(ppi)的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键磷酸酰胺键赖氨酸残基腺苷－磷酸DNA的腺苷酸复合物连接酶的作1531)DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码的2)T4DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的

DNA连接酶－－NAD+T4DNA连接酶－－ATP2.连接酶的来源1)DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码的2.连接酶154该酶常从Ｔ４噬菌体的受体细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化DNA中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。3.T４DNA连接酶（DNAligase）3.T４DNA连接酶（DNAligase）155第三章基因工程的酶学基础课件156（1）反应温度：连接缺口的温度：37度连接粘性末端的最佳温度：4～16度（2）Ｔ４ＤＮＡ连接酶的用量：平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。ATP的用量10μmol～1mmol/L之间（3）提高外源片断与载体的浓度的比值（10～20倍）4.影响连接酶作用的因素（1）反应温度：4.影响连接酶作用的因素1571.用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断2.用T4DNA连接酶将平末端的DNA片断连接；或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用DNA连接酶连接。3.先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接

体外连接的三种方式二、体外连接1.用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断体外连接158

由于具粘性末端的载体易发生自连，对载体的5’末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。而外源片断的5’-P能与载体的3’-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5’-P的链不能进行连接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。

1.粘性末端DAN片断的连接1.粘性末端DAN片断的连接159第三章基因工程的酶学基础课件160第三章基因工程的酶学基础课件161

（1）T4DNA连接酶（2)用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法2.平末端DNA片断的连接2.平末端DNA片断的连接162

2.1同聚物加尾法用5’末端特异的核酸外切酶处理DNA片断在A和B分别中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10～40个碱基2.1同聚物加尾法用5’末端特异的核酸外切酶处理DNA片163同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，对获得插入片断进行进一步的研究。

应用适当的dNTP加尾，再生出共外源DNA片段插入的有用的限制位点。右图说明了如何用poly（dT）加尾法再生出HindⅢ限制位点的情况。同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的1642.2衔接物连接法平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点

HpaIIHpaIIBamHI

或Sau3A2.2衔接物连接法HpaII165

衔接物（linker）：是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。

衔接物（linker）：是指用化学方法合成的一段由10～1166衔接物连接法衔接物连接法167双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再168双衔接物连接法的基本程序cDNA链的合成通过DNA聚合酶合成第二链加入SalI衔接物SI核酸酶作用后的末端单链突出序列，由Klenow补齐，加入第二衔接物EcolI双衔接物连接法的基本程序cDNA链的合成通过DNA聚合酶合成169在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内1701978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能产生稳定的二聚体分子。2.3DNA接头（adapter）连接法：1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴171第三章基因工程的酶学基础课件172DNA接头连接法goDNA接头连接法go173第三节、DNA聚合酶第三节、DNA聚合酶174一、大肠杆菌DNA聚合酶、二、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片断酶、三、T4DNA聚合酶、四、T7DNA聚合酶、五、反转录酶等。常用的DNA聚合酶常用的DNA聚合酶175共同点：

把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。共同点：176一、大肠杆菌DNA聚合酶

DNA聚合酶Ｉ（PolＩ）、DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）、DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）、

PolＩ和PolⅡ的主要功能参与DN