鸡场实验室常规检测课件

瑞普生物养殖场实验室常规检测瑞普生物技术部诊断试验室电话：概述细菌对抗菌药物的敏感试验抗体检测（HA/HI）细菌性药敏试验

细菌性疫病的发生特点1．疫病复杂化，条件性细菌病的危害加大

据生产实践，条件性致病菌在良好的饲养环境和有效的防疫措施下，基本上不会带来危害。但在某些疫病感染或防疫条件不良的情况下，就会诱发疫病。2．症状复杂化，给疫病诊断带来一定困难

近年来，畜禽疾病的普遍表现是症状复杂化，表现为某些细菌性疫病与病毒病并发感染或继发感染，构成多病因性疾病，使疫病诊断更加复杂化。多病原的并发或继发感染，使疫病的快速准确的诊断与有效防治变得越来越困难。3．滥用抗生素，导致大量耐药菌株产生

一些养殖场由于缺乏科学饲养技术和兽医诊疗知识，对临床动物疫病很难进行针对性治疗，一旦发病，多用抗生素、抗病毒类药物进行盲目治疗，治标不治本，极易造成病情延误，甚至干扰肠道内正常微生物菌群，失去微生物的互相制约作用，致使某些非致病菌大量繁殖，引起“二次感染”；更严重的是，由于滥用抗生素导致大量耐药菌株产生，给疫病治疗带来困难。另一方面，由于饲料厂家为了提高饲料的疾病预防作用，在饲料中添加不同成分的的抗菌药物，加速了饲养动物的抗药性产生，尤其是某些鸡场由于长期使用土霉素等，使大肠杆菌、沙门氏菌等细菌逐渐产生了抗药性，一旦发生大肠杆菌病、沙门氏菌病，这类药物即失去了治疗作用。细菌性药敏试验纸片扩散法肉汤试管稀释法含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。细菌性药敏试验原理:（1）敏感（sensitive）：指被测菌株所引起的感染可以用常用剂量的某种抗菌药物治愈。（2）中度敏感（moderatesensitive）：指通过提高某种抗菌药物的剂量或在该药物浓集的部位，细菌生长可被抑制，感染被治愈。（3）中介度（intermediate）：这一范围是“缓冲域”，是由操作上的误差造成的，不作为报告形式。如确需明确该药的敏感度，需重复试验或做稀释法敏感试验。（4）耐药(resistance)：指被测菌株所引起的感染不能用该抗菌药物治愈。（5）最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration)：抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。单位：μg/ml或U/ml。（6）最低杀菌浓度(minimalbacteriacidleconcentration)：抗菌药物杀灭细菌所需要的最低浓度。单位：μg/ml或U/ml。细菌性药敏试验药敏试验中所用的专用名词观察纸片周围有无抑菌环形成，并测量其直径大小，以判定细菌对药物的敏感程度，记录和报告结果。判定标准：实验条件不同，判定标准有所不同。对于一般抑菌环的直径，20mm以上极敏;15mm以上者为高度敏感；10-15mm为中度敏感；10mm以下为低度敏感；无抑菌环者为耐药。

纸片扩散法中，最常用的质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923和铜绿假单胞菌ATCC27853。细菌性药敏试验细菌性药敏试验琼脂扩散法①将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌分别接种于琼脂平板上（密集划线法）。②用蜡笔在平皿底面将其分为4个区域，分别标记抗生素的名称。③用灭菌后的镊子夹取各种抗生素滤纸片，平放至培养基表面的相应位置。④置37℃培养24h，测量滤纸片周围的抑菌圈的直径。

细菌性药敏试验1.标记分区底部观细菌性药敏试验3.贴片顶部观

将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上。细菌性药敏试验4.培养置37℃温箱，倒置培养18h细菌性药敏试验5.结果观察细菌药敏片抑菌圈青青青青细菌性药敏试验Kirby-Bauer法试验程序（a）挑取菌落（b）转种肉汤（c）比浊（d）涂布平板上（e）放置药敏片（f）量取抑菌圈大小细菌性药敏试验细菌性药敏试验常用药敏试验纸片判断标准抗菌药物纸片含药量(μg/mL)抑菌圈直径(mm)

不敏感低度敏感中度敏感敏感青霉素500≤1010～26≥26链霉素5000≤1010～15≥15氯霉素7000≤1010～20≥20新霉素3000≤1010～25≥25多黏菌素抑菌圈在9毫米以上为高敏，6-9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。影响药敏结果的因素

1.培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药。

2.细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。

3.药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。

4.培养时间：一般培养温度和时间为37℃8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。细菌性药敏试验血凝（HA）现象：有些病毒表面有血凝素，可凝集人,鸡,豚鼠等动物RBC。原理：血凝素与RBC表面相应受体结合，引起RBC凝集；用途：①滴定病毒的血凝效价，为血凝抑制试做准备；②确定病毒的存在；凝集效价：能使血球产生++凝集的病毒最高稀释度为病毒的凝集效价，在病毒血凝抑制试验中，一般用4个血凝单位。抗体检测（HA/HI）血凝抑制（HI）现象：血凝素抗体使病毒失去凝集红细胞能力的现象。作为临床检测试验，可用于检测血清中抗体含量或鉴定病毒。称为血凝抑制试验。原理：Ab与血凝素结合，封闭血凝素，使之不能与RBC结合，凝集RBC。用途：①测定鸡群的相应Ab—诊断；②鉴定V的型、亚型；③流行病学调查：鸡群感染情况（Ab）、检测流行株（V）；血凝抑制效价：能完全抑制血球凝集的最高血清稀释度即为该血清的血凝抑制效价。抗体检测（HA/HI）实验材料针头

9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）抗原

新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。1%红细胞

非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。柠檬酸三钠

配制3.8％抗凝剂用重铬酸钾

配制清洁液用硫酸

配制清洁液用

蒸馏水

当地买。清洗96孔V型板、吸头用稀释液：0.1MPBS

做血清稀释液用、配制4单位抗原抗体检测（HA/HI）实验材料抗体检测（HA/HI）0.1MPBS离心机抗体检测（HA/HI）1%红细胞的制备实验材料抗体检测（HA/HI）实验材料微量加样器冰箱抗体检测（HA/HI）单位：微升孔号123456789101112①PBS252525252525252525252525②抗原252525252525252525252525抗原稀释212223242526272829210211③RBC1%252525252525252525252525振荡器震荡1-2min，置室温感作30min。结果+++++++++++++++++++++++++++++++-结果观察反应板倾斜45℃，对照成立的情况下，孔底红细胞向下呈线状流动者表示不凝集；反之，倾斜后不流动则表示被凝集。HA操作抗体检测（HA/HI）HA阳性HA阴性HA试验抗体检测（HA/HI）4单位抗原的验证HI操作单位：微升孔号123456789101112①PBS252525252525252525252525②被检血清252525252525252525252525血清稀释212223242526272829210211212③4单位Ag252525252525252525252525振荡器震荡1-2min，置20-22℃感作20min。④RBC1%252525252525252525252525振荡器震荡1-2min，置20-22℃感作30min。结果---------++++++结果观察

反应板倾斜45℃，对照成立的情况下，孔底红细胞向下呈线状流动者表示血清中的抗体抑制了病毒（4单位Ag）对红细胞的凝集；反之，倾斜后不流动则表示病毒（4单位Ag）凝集了红细胞，即血清中无相应Ab。抗体检测（HA/HI）商品肉鸡检测时机常规检测：1）1d母源抗体，考察种代健康情况及确定免疫时间；2）35-42日龄，测定出栏前机体抗体情况。发病鸡群：发病后一周免疫试验或疫苗对比试验：每周采血化验种鸡/蛋鸡检测时机常规检测：每4周一次发病鸡群：发病后一周抗体检测（HA/HI）一般认为，活苗免疫后2w到达抗体高峰，油苗免后3w到达抗体高峰。采样的比例：按每个舍0.6%的比例采集，但每舍不得少于15份，一般常规采样15-30份即可。

采样的具体要求

(1)每个鸡舍应分至少五个点随机采样。采血的量要适当,一般在1-1.2ml左右(4/5管)为宜。如果采血量不足,可能不够完成所有的化验项目。

(2)采血时应注意采出的血液应沿着采血管管壁慢慢注入管内，切忌用力过猛起泡造成溶血。

(3)刚采好的血要避免受冷和振动，应在25-37℃环境中加盖静置1-2h，这样有利于血液凝固和析出血清。静置后立即送检，如不能及时送检。须放入4℃冰箱保存（不宜超过24h），切忌冰冻。

(4)血样运输时尽可能直立，避免洒漏。抗体检测（HA/HI）正常1）商品肉鸡母抗≤28，有时可达29，一般情况下母抗较种代鸡低2个滴度。2）种鸡/蛋鸡2个月时可达26-8

，甚至更高，多次免疫也不会超过212。3）通常一旦建立免疫保护，HI抗体维持2个月不会有大变动，抗体波动不会超过2个滴度。4）正常情况下，育成期或产蛋期的油苗免疫一次可以提升1.5-2个滴度，否则就是免疫失败，则应加免。抗体检测（HA/HI）ND-HI态势评价发病1）未免疫鸡群的抗体出现阳性。2）发病后2w的ND-HI至少比发病前高2个滴度，个别可能异常高。3）肉鸡或育雏的种鸡/蛋鸡发病后10d，ND-HI可上升5个滴度到210

。4）种鸡/蛋鸡场野毒感染1个月后，个别的滴度可达214

或更高。5）生物安全措施良好的鸡场往往存在野毒的滚动感染，因此鸡场的病程往往持续数月之久。如确诊的早，可从远离发病舍的（假定）健康鸡舍做紧急免疫。抗体检测（HA/HI）ND-HI态势评价数据的意义抗体检测（HA/HI）抗体滴度：个体抵抗力GMT：平均值，显示群体的平均抵抗力CV%：变异系数(标准差S/平均值X)，代表群体相对与平均值的离散程度。但活苗免后抗体的转阳率远比该参数重要。CV%均匀度<40%优异40-60%良好>60%需改善抗体检测（HA/HI）免疫鸡群血清ND-HI抗体水平与保护力的关系：ND-HI滴度鸡群接触到VVNDV后的情况注<4Log2死亡临界值。50%以上的死亡率，可达100%。免疫抗体4-7Log290%以上的保护率。>6Log2能抵抗呼吸道感染,仍有少数鸡死亡。8Log2100%保护，但产蛋鸡群产蛋下降。9-10Log2产蛋安全临界值。11-13Log2NDV仍可在鸡体内复制。>13Log2不再出现NDV复制（不发生感染）强毒感染后的抗体抗体检测（HA/HI）日龄疫苗剂量途径0dC30+H1201XSpr8dND+H9（RP）0.3mlSC11d新支妥1.2XDW16d法必妥1XDW23d新必妥2XDW抗体检测（HA/HI）影响检测结果的因素红细胞悬液浓度来源于不同个体鸡的红细胞，对抗原的敏感性不尽相同。因此实验时最好用3-4只未免疫鸡。配制红细胞时，红细胞