造血干细胞的发育调控课件

造血干细胞的发育调控授课教师：刘静研究方向1：造血发育调控研究方向2：白血病治疗的分子机制研究

造血（hematopoiesis）

造血干细胞(hematopoieticstemcell)分化为早期祖细胞(primitiveprogenitorcell)，经大量增殖分化成为晚期祖细胞(lateprogenitorcell)，然后再分化为具有特异形态的、骨髓中不同系别的前体细胞(precursorcell)，最后分化成为各类具有生理功能的血细胞的整个过程称为“造血”

。骨髓中各类前体细胞是各系祖细胞分化走向成熟的过渡形态。造血不包括成熟血细胞在体内储存、释放、分配和凋亡的过程。一、胚胎期造血器官

人类的血液细胞首先在卵黄囊中形成，肝、脾、胸腺和骨髓均参与造血根据发育过程中造血中心的转移，胚胎期造血分为三个时期：

卵黄囊造血期

、肝造血期

、骨髓造血期1.卵黄囊造血期（中胚叶造血期）始于人胚胎3周左右，卵黄囊壁上的中胚层细胞开始分化聚集成团，称为血岛（bloodisland）。血岛是人类最初的造血中心。血岛外周的细胞分化为血管内皮细胞。血岛中央的细胞形成多能造血干细胞，继尔分化成幼稚红细胞，以后大量的多能造血干细胞迁移至肝、脾、骨髓和淋巴组织继续增殖、分化为干细胞。胚胎

2个月后，卵黄囊逐渐退化、萎缩，被肝、脾取代其造血功能。2．肝造血期

始于胚胎第6周，是卵黄囊血岛的造血干细胞移植到肝脏的结果，以造红细胞为主，后期可生成粒细胞和巨核细胞。肝脏是胚胎2~5个月的造血中心，持续至第7个月时，逐渐被骨髓造血替代。此外脾、胸腺、淋巴结等也参与造血。胚胎期造血的三个时期不能截然分开，此消彼长，互为交错。1．骨髓

骨髓是位于骨髓腔内的海绵样胶状组织，有红骨髓和黄骨髓之分。婴幼儿的骨髓几乎都参与造血，即全为红骨髓。约从5岁开始，长骨的髓腔内出现脂肪细胞，随年龄增长，长骨远端的红骨髓转化为黄骨髓。成人的红骨髓和黄骨髓约各占50%，但黄骨髓仍有造血潜能，当机体需要时又转变为红骨髓而参与造血。3.髓外造血正常情况下，胎儿出生2个月以后，骨髓以外的组织如肝、脾淋巴结等不再制造红细胞、粒细胞和血小板。但在某些病理情况下，如骨髓纤维化、骨髓增生性疾病及某些贫血，这些组织又恢复造血功能（常可导致相应器官肿大），称为髓外造血。一、造血细胞的生长发育是一个连续不断的复杂过程，造血器官内的各种造血细胞在造血微环境中通过细胞与细胞之间相互作用，在各种细胞因子的诱导下，按一定的规律发育成为各种成熟的血细胞，然后释放入血循环中。第二节造血干/祖细胞的生长发育、特性以及造血调控

（一）基本过程造血细胞的生长发育包括增殖、分化、成熟和释放四个方面。多种调节因素控制该过程，维持血细胞数量和质量稳定。造血细胞的增殖（proliferation）是指血细胞通过分裂而使其数量增加的过程。有丝分裂是造血细胞的主要增殖方式。

造血细胞的分化（differentiation）细胞发育过程中失去某些潜能而获得新功能的过程，即由多潜能转变为单潜能的过程。分裂后的细胞在形态和功能上产生新的特征，分化过程是不可逆的。（二）造血细胞生长发育阶段根据造血细胞的功能和形态特征，造血细胞生长发育阶段可分为：造血干细胞、造血祖细胞、原始及幼稚细胞造血干细胞阶段造血祖细胞阶段原始及幼稚细胞阶段成熟细胞（一）造血干细胞造血干细胞又称多能干细胞，由中胚层细胞分化而来，是各种血细胞的始祖，具有高度自我更新、多向分化和增殖能力，并且在造血组织中含量极少，其形态酷似小淋巴样细胞而难以辨认。1.造血干细胞的基本特征

（1）自我更新

即细胞通过有丝分裂产生的两个子代细胞与亲代细胞具有相同的特征。造血干细胞的自我更新是维持其数量平衡的基础，亦称自我维持。高度的自我更新能力是造血干细胞最基本的生物学特征之一。

（3）

造血干细胞全能性（多向分化）

分化是不可逆的，一旦定向分化为某种祖细胞，就不可能再变成其它的祖细胞。造血干细胞在特定的条件下可以分化成红细胞、粒细胞、单核细胞、血小板、组织嗜碱细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞及自然杀伤细胞等的祖细胞。（4）

造血干细胞不均一性造血干细胞有增殖态与静止态之分，并且不断地在静止和增殖态之间转换。造血干细胞代龄（有丝分裂的次数）不同构成了干细胞群体的代龄结构，形成干细胞不均一性。2．造血干细胞检测

单个细胞在生物体内有能力长期重建造血是判断该细胞为造血干细胞的“金标准”。造血干细胞的数量极少，形态上不能区别，干细胞抗原性弱，仅有很少表面抗原。（2）单克隆抗体法

利用FACS自动细胞分选系统分选出CD34+CD38+及CD34+CD38—亚群细胞，在无血清体系中加入各种细胞因子（如SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF及Epo）刺激，结果表明，CD34+CD38—单个细胞可形成原代集落，并可向红系、粒系、巨噬系、巨核系等细胞分化。CD34+CD38—细胞的性能接近于造血干细胞，同时也证明了造血干细胞具有多向分化的能力。

（3）造血干细胞的表面标记的流式细胞仪检测CD34+细胞具有长期重建造血的能力；CD34+CD38—细胞比CD34+细胞具有更强的长期造血能力；AC133+细胞也被认为是早期造血细胞的标志。（二）造血祖细胞造血干细胞进一步分化为各种造血祖细胞（hematopoieticprogenitorcell）。造血祖细胞是一类由造血干细胞分化而来，但失去自我更新能力的过渡性、增殖性的细胞群，过去称为定向干细胞。造血祖细胞根据其分化能力，可分为多向祖细胞和单向祖细胞。多向祖细胞可进一步分化为单向祖细胞。通过体外造血细胞半固体培养证实了造血祖细胞的存在。红细胞爆式集落形成单位

（BFU-E）红细胞的祖细胞体外培养红细胞集落形成单位

(CFU-E)（三）造血干／祖细胞的临床应用造血干／祖细胞移植主要应用于：1.血液系统恶性肿瘤，如急、慢性白血病等；2.血液系统非恶性肿瘤性疾病，如再生障碍性贫血、异常血红蛋白病、Fanconi贫血、难治性贫血等；3.实体肿瘤化疗后造血重建，如乳腺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤等；4.其他，如重症联合免疫缺陷症、自身免疫性疾病、基因治疗等。三、造血调控造血细胞的增殖、分化受控于不同的调控系统，以保持各种血细胞数量和质量的相对稳定。其中细胞因子的调控占重要地位。细胞因子（cytokines）是一组基因编码的低分子量蛋白质细胞外信号分子，有的是糖蛋白，有的则不含糖基，在机体内含量极低，半衰期短，主要功能是在细胞间传递信息，从而影响造血活动。（一）集落刺激因子类(colony-stimulatingfactors,CSFs)主要有以下几种：1.红细胞生成素（erythropoietin，EPO）刺激红系祖细胞的增殖和分化，以提高红细胞数量。2.粒细胞集落刺激因子(G-CSF)除促进粒系祖细胞形成集落外，G-CSF可诱导某些白血病细胞株分化成熟，激活中性粒细胞的吞噬功能。3.粒－巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)

除了促进中性粒细胞、单核细胞祖细胞增殖、分化

成熟外，对成熟细胞也产生作用。4.巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）促进单核系祖细胞的增殖和分化，激活巨噬细胞的吞噬和分泌功能。5.多系集落刺激因子（multi-CSF）促进多系集落生长。6.血小板生成素（thrombopoietin,TPO）促进巨核细胞集落形成。（二）白细胞介素（interleukin,IL)白细胞介素主要是白细胞产生的信号分子，不仅在免疫系统中传递信息，同时也参与造血系统的造血调控。（三）其它细胞因子1.干细胞因子（stemcellfactor,SCF）又称肥大细胞生长因子

促进肥大细胞生长；协同促进造血干／祖细胞增殖、分化。2．FLT-3配基(FLT-3ligand,FL)诱导处于静止期的造血干／祖细胞进人细胞周期，促进其扩增。1．原癌基因

如：c-myc基因、ras相关基因、c-abl基因、bcl-2基因、c-kit基因等。（四）造血基因调控原癌基因的编码产物可为：细胞因子、细胞因子受体、细胞内蛋白激酶、细胞内信号传递分子及转录因子等。2.抑癌基因

如：p53基因、WT1基因、NF1基因、DCC、Rb基因等。抑癌基因编码产物通常为细胞增殖负调节因子，抑制细胞增殖、诱导终末分化、维持基因稳定、诱导细胞凋亡等。

3.转录因子参与信号转导的调控对造血中基本的基因调控机制仍存在若干悬念有待研究：（1）如何在细胞周期G1与G0之间来回转换，并保持绝大多数细胞处于G0静止状态?（2）干细胞不对称有丝分裂在基因水平上是怎样实现的?（3）干/祖细胞基因怎样调控各类受体表达，以接受造血微环境中各种正负信号的影响?（4）干细胞在基因水平如何调控向淋巴系或髓系分化?祖细胞基因如何决定分化方向?怎样保持各系之间正常恒定比例?

第三节造血干／祖细胞体外培养技术

体内造血干／祖细胞在一个极复杂的造血微环境中增殖、分化生成血液细胞。体外造血祖细胞培养就是在体外模拟体内的生理环境，将从机体中分离出的造血祖细胞进行培养，使之生存、增殖分化。

造血祖细胞培养的主要应用：1）检测造血祖细胞在骨髓、外周血和脐血中的数量2）研究体外造血祖细胞类型、特性及生理意义3）利用人工培养条件易于严格控制的特点，研究造

血调节；4）用于造血系统疾病发生机制，诊断、预后判断、疗效观察及治疗药物的选择等方面的研究。一、造血干／祖细胞体外培养的基本条件（一）细胞培养室条件（二）培养的支持物（三）营养液（四）细胞因子（五）血清

二、造血干／祖细胞体外培养（一）造血祖细胞集落培养：（1）分离培养细胞，制成单个核细胞悬液。（2）配制培养体系：按比例将培养液、细胞、血清、细胞因子加入到培养体系，混匀。（3）将配制的培养体系在37℃水浴中保温10min。（4）将琼脂等支持物煮沸融化（甲基纤维素不需加热）。（5）待支持物降至40℃左右，加入培养体系并混匀。（6）将混匀后的培养体系加入培养皿或培养板孔内，一般平行做3份。（7）于5%CO2、饱和湿度及37℃温箱内孵育。BFU-E需14天，CFU-E需7天。（8）观察结果。（一）红系祖细胞诱导分化的液体培养：MediumFBSEPOStemcellfactorIL3FVACELLS:aninvitrosystemtostudyerythroblastdifferentiation0h12h24h44hFVAcells:Briefly,10daysafterinfectionwith104spleenfocus-formingunitsoftheanemia-inducingstrainofFriendleukemiavirus(FVA),femaleCDF-1micewerekilled,andproerythroblasts(spleenorigin)werepurifiedandcultured.KouryMJ,etal.JCellPhysiol1984,121:526–532.LeeG,etal.Blood,2003,101,1790-1797.Highamountofenucleatingerythroblastcellsproduced