基因芯片在嗜铬细胞瘤患者基因突变中的检测作用课件

基因芯片在嗜铬细胞瘤患者基因突变中的检测作用徐州医学院研4班泌尿外科：刘文彬、韩学超

韩学超、许小兵神经外科：刘长涛基因芯片在嗜铬细胞瘤患者基因突变中的检测作用徐州医学院研4班主要内容背景介绍12基因芯片技术3基因芯片的应用4讨论主要内容背景介绍12基因芯片技术3基因芯片的应用4讨论背景介绍1、嗜铬细胞瘤

嗜铬细胞瘤是由肾上腺髓质的嗜铬细胞及交感神经节细胞形成的肿瘤，瘤组织持续或间断地释放大量儿茶酚胺引起持续性或阵发性高血压和多个器官功能及代谢紊乱。

嗜铬细胞瘤分为散发型和家族型，约10%的嗜铬细胞瘤患者为某些孟德尔遗传疾病。家族性嗜铬细胞瘤呈常染色体显性遗传，目前已知这些疾病的嗜铬细胞瘤发生与RET原癌基因、HL基因、SDHD基因和SDHB基因4种基因有关。背景介绍1、嗜铬细胞瘤背景介绍2、近年来研究表明家族性嗜铬细胞瘤患者中这四种基因的突变频率较高，突变频率的总和接近30%，目前国内外普遍采用DNA直接测序技术，在嗜铬细胞瘤患者中发现和诊断某些孟德尔遗传疾病，耗费大量的时间和金钱，临床上难以广泛的开展。3、最新的基因芯片技术可以高效快速的探测疾病机制，诊断疾病病因。背景介绍2、近年来研究表明家族性嗜铬细胞瘤患者中这四种基因芯片技术

基因芯片技术是将大量探针固化于固相支持物上，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息。该技术具有高通量、大规模、快速、高效、高灵敏度等优点，在科研领域、生物制药和医学诊断上都具有良好的应用前景。基因芯片技术基因芯片技术是将大量探针固化于固相支持基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1、材料与方法1.1、基因芯片的选择

选择与嗜铬细胞瘤相关的4个基因(RET、VHL、SDHB和SDHD)共87个突变位点，检测位点全部位于基因外显子区域，涵盖与嗜铬细胞瘤相关的85%的已知变异位点。1.2、患者DNA的提取

取患者外周血5ml，用酚—氯仿方法提取DNA。基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1、材料与方法基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1.3、聚合酶链反应（PCR）标本的扩增反应采用25uL混合体系:：将25ngDNA样本，2.5uL10×扩增缓冲液、2u

L2.5mmol／LdNTPs、1.0uL25mmol／LMg、1.5ulDMSO、1uL20g/

LBSA、13uLddN20、上、下游引物(1umol／L)各1uL分和2.5UTag聚合物加入200L扩增管。1.4、杂交反应杂交步骤按照基因芯片操作说明书进行。将PCR扩增液和阴性、阳性扩增液加入同一个薄壁管中，98℃热变性5min，取出后迅速放入冰盒，一20℃放置5min。取出基因芯片，做好样品编号，在杂交舱中加入预杂交液42。C静置5min，吸除该缓冲液；吸取杂交缓冲液与已变性的PCR扩增产物混合物，混匀，将液体全部加入杂交舱中，42℃杂交30min。吸除杂交舱中溶液后清洗两次。基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1.3、聚合酶链反应（PCR基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1.5、显色反应

检测探针采用Biotin标记，碱性磷酸酶(AP)催化的NBT／BCIP显色反应。在杂交舱中加入抗体溶液，室温放置20min。吸除杂交舱中溶液后清洗两次。向杂交舱中加入显色液溶液，42℃避光放置40min。吸除杂交舱中溶液，小心揭除杂交舱，用蒸馏水冲洗后，置42℃烘干。将显色载玻片面朝下置于BaiO生物芯片识读仪片槽上检测。基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1.5、显色反应基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1.6、检测分析图像经ArrayDoctor软件分析可自动输出检测结果。各个信号值均经过背景信号值的矫正。芯片中1个检测位点由相邻的3个杂交点组成，计算3个杂交点的均值为该检测位点的信号值，然后将野生型与突变型位点的信号值进行比较，以判断是否存在位点突变。基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1.6、检测分析基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用2、结果基因芯片检测结果显示，91.4%(32／35)的基因芯片杂交与基因测序结果一致。

基因芯片和基因测序的结果比较突变基因

基因测序检出例数

芯片杂交检出例数

符合率SDHB 10 880SDHD22100VHL7686RET1010100无突变对照66100

基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用2、结果讨论

1、嗜铬细胞瘤占高血压病因的（0.5-1.0）%。因为本病发作时有引起急症意外的危险，加之尚有10％为恶性嗜铬细胞瘤，故应及早诊治。新的研究表明，散发的嗜铬细胞瘤中基因突变频率较高，某些研究中发现50%的嗜铬细胞瘤患者中存在一个易感的等位基因。而传统的基因测序虽然比较的准确，但往往要花费大量的时间和金钱，临床推广有一定的困难。基因芯片技术相比传统的基因测序具有快速、准确、简便、经济适用等特点，在嗜铬细胞瘤的基因诊断中具有较好的应用前景。讨论1、嗜铬细胞瘤占高血讨论2、小样本的实验证明基因芯片在嗜铬细胞瘤的诊断中具有较好的准确性，但目前还不能完全检测所有基因的突变位点。因此本基因芯片在投入实际应用之前还需要更多的样本验证。3、基因芯片虽然显示出良好的识别突变位点的效能，但在个别样本中也显示出了不足之处。未来需要解决的问题是如何控制基因芯片检测的误差及提高检测效能？讨论2、小样本的实验证明基因芯片在嗜铬细胞瘤的诊断中具有较好谢谢！谢谢！基因芯片在嗜铬细胞瘤患者基因突变中的检测作用徐州医学院研4班泌尿外科：刘文彬、韩学超

韩学超、许小兵神经外科：刘长涛基因芯片在嗜铬细胞瘤患者基因突变中的检测作用徐州医学院研4班主要内容背景介绍12基因芯片技术3基因芯片的应用4讨论主要内容背景介绍12基因芯片技术3基因芯片的应用4讨论背景介绍1、嗜铬细胞瘤

嗜铬细胞瘤是由肾上腺髓质的嗜铬细胞及交感神经节细胞形成的肿瘤，瘤组织持续或间断地释放大量儿茶酚胺引起持续性或阵发性高血压和多个器官功能及代谢紊乱。

嗜铬细胞瘤分为散发型和家族型，约10%的嗜铬细胞瘤患者为某些孟德尔遗传疾病。家族性嗜铬细胞瘤呈常染色体显性遗传，目前已知这些疾病的嗜铬细胞瘤发生与RET原癌基因、HL基因、SDHD基因和SDHB基因4种基因有关。背景介绍1、嗜铬细胞瘤背景介绍2、近年来研究表明家族性嗜铬细胞瘤患者中这四种基因的突变频率较高，突变频率的总和接近30%，目前国内外普遍采用DNA直接测序技术，在嗜铬细胞瘤患者中发现和诊断某些孟德尔遗传疾病，耗费大量的时间和金钱，临床上难以广泛的开展。3、最新的基因芯片技术可以高效快速的探测疾病机制，诊断疾病病因。背景介绍2、近年来研究表明家族性嗜铬细胞瘤患者中这四种基因芯片技术

基因芯片技术是将大量探针固化于固相支持物上，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息。该技术具有高通量、大规模、快速、高效、高灵敏度等优点，在科研领域、生物制药和医学诊断上都具有良好的应用前景。基因芯片技术基因芯片技术是将大量探针固化于固相支持基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1、材料与方法1.1、基因芯片的选择

选择与嗜铬细胞瘤相关的4个基因(RET、VHL、SDHB和SDHD)共87个突变位点，检测位点全部位于基因外显子区域，涵盖与嗜铬细胞瘤相关的85%的已知变异位点。1.2、患者DNA的提取

取患者外周血5ml，用酚—氯仿方法提取DNA。基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1、材料与方法基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1.3、聚合酶链反应（PCR）标本的扩增反应采用25uL混合体系:：将25ngDNA样本，2.5uL10×扩增缓冲液、2u

L2.5mmol／LdNTPs、1.0uL25mmol／LMg、1.5ulDMSO、1uL20g/

LBSA、13uLddN20、上、下游引物(1umol／L)各1uL分和2.5UTag聚合物加入200L扩增管。1.4、杂交反应杂交步骤按照基因芯片操作说明书进行。将PCR扩增液和阴性、阳性扩增液加入同一个薄壁管中，98℃热变性5min，取出后迅速放入冰盒，一20℃放置5min。取出基因芯片，做好样品编号，在杂交舱中加入预杂交液42。C静置5min，吸除该缓冲液；吸取杂交缓冲液与已变性的PCR扩增产物混合物，混匀，将液体全部加入杂交舱中，42℃杂交30min。吸除杂交舱中溶液后清洗两次。基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1.3、聚合酶链反应（PCR基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1.5、显色反应

检测探针采用Biotin标记，碱性磷酸酶(AP)催化的NBT／BCIP显色反应。在杂交舱中加入抗体溶液，室温放置20min。吸除杂交舱中溶液后清洗两次。向杂交舱中加入显色液溶液，42℃避光放置40min。吸除杂交舱中溶液，小心揭除杂交舱，用蒸馏水冲洗后，置42℃烘干。将显色载玻片面朝下置于BaiO生物芯片识读仪片槽上检测。基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1.5、显色反应基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1.6、检测分析图像经ArrayDoctor软件分析可自动输出检测结果。各个信号值均经过背景信号值的矫正。芯片中1个检测位点由相邻的3个杂交点组成，计算3个杂交点的均值为该检测位点的信号值，然后将野生型与突变型位点的信号值进行比较，以判断是否存在位点突变。基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用1.6、检测分析基因芯片在嗜铬细胞瘤患者中的应用2、结果基因芯片检测结果显示，91.4%(32／35)的基因芯片杂交与基因测序结果一致。

基因芯片和基因测序的结果比较突变基因

基因测序检出例数

芯片杂交检出例数

符合率SDHB 10 880SDHD22100VHL7686RET