超声提取小檗碱及其薄层扫描分析

实验八超声波辅助提取药用植物小檗碱及其薄层扫描分析实验者：区文花（09354107）郭文婷（09354105）时间：2011.11.29［背景知识］小檗碱，英文名Berberine，中文名黄连素，一种常见的异喹啉生物碱，分子式C20H18N04,结构如下：OCH,小檗碱为一种季铵生物碱，熔点145°C，溶于水，难溶于苯、乙醚和氯仿，从乙醚中可析出黄色针状晶体，其盐类在水中的溶解度都比较小，例如盐酸盐为1：500，硫酸盐为1:30。它存在于小檗科等四个科十个属的许多植物中，是黄连、黄柏、功劳木、三颗针等中药材中的主要有效成分,具有清热解毒、抗菌消炎的功效。在多数含以上药味中药制剂的质量标准中,盐酸小檗碱常被选作含量控制指标,其含量测定对于控制制剂质量、开发药源、合理用药等均具有重要意义。OCH,、实验目的掌握生物碱提取方法。掌握生物碱薄层层析技术特点。了解薄层扫描技术定性、定量分析功能在天然产物成分分析中的应用二、实验原理小檗碱为季胺碱，有较大极性，本实验根据其结构性质，采用酸性醇溶液提取，在大极性展开剂中层析，薄层扫描测定。三、 实验材料与仪器小檗科药材，1：100盐酸：甲醇溶液、蒸馏水、碘化铋钾溶液、超声波清洗仪药材粉碎机、薄层扫描仪，移液管、烧杯（500ml）、量筒（100ml）、三角烧瓶（250mlx2）、比色管（25ml）、圆底烧瓶，玻璃棒、薄层板（2.5x7.5cm,碱性硅胶G板）。四、 实验内容洗净实验器皿、烘干。（一） 总碱提取称取药物北豆根，每份约0.30g,于比色管中，加入盐酸-甲醇（1：100）25mL,超声提取30mim，平行2份样品，冷却后用甲醇补充损失的溶剂至原刻度，摇匀，沉降，上清液作为供试品溶液。（二） 总碱成分群整体特性测定

2.1对照品溶液的配制：精密称取小檗碱对照品适量，加甲醇制成1mg/mL的溶液，作为对照品溶液。2.2展开剂配比：二氯甲烷:丙酮:氨水(175:205)已配好，直接使用。2.3上样：用同一只毛细管取对照品一份和供试品两份，点在硅胶G薄层层析板上C2.5X7.5cm),样品间距要固定，点样体积要和标样一致，点样后的薄层板挥干溶剂,置干燥器中放置片刻。展层：将层析板放入已盛有展开剂的层析缸中展开；展开剂组成见2.2，取出层析板，晾干。显色：喷碘化铋钾溶液显色，室温下放置0.5~1小时。2.6置于薄层扫描仪中扫描，置于薄层扫描仪中扫描，扫描条件：A=360nm荧光扫描，背景校正。测出后按以下公式计算供试品中小檗碱的含量：MsX稀释倍数含量削/片)MsX稀释倍数X平均片重MsX稀释倍数含量削/片)MsX稀释倍数X平均片重五、实验结果1.薄层扫描得北豆根中没有小檗碱的成分。1.薄层扫描得北豆根中没有小檗碱的成分。分析：由1可看到三个峰的Rf都在0.1~0.2之间，峰型是能看到，但是展开剂的配比不能，故三个样品都在前面出峰了，没有把峰型完全展开，看到那些峰都是连得很密，如果是好的展开剂，Rf通常会在0.5左右，对照品(3)的Rf=0.27和0.56均有明显的出峰，而供试品(l,2)Rf在0.2之后没有明显出峰，基本成一直线，故由

图上可看出供试品中不含有小檗碱，与薄层扫描的结果一致。图2为碘化铋钾颢色，薄层板上三个点均有紫红色的点，说明试样中含有生物碱的成分，观察紫红色点的位置，可看到小檗碱对照品的紫红色区域与北豆根提取液的紫红色斑点不在同一位置上，说明北豆根中没有小檗碱成分。图3为三个样品展开后紫外光(365nm)下观察到的图，可看到左边的两个样品点在紫外灯下没有明颢荧光，有弱的蓝色荧光，说明有生物碱成分的存在，对照品紫外灯下可看到明颢的黄檗碱成分，需经薄层扫描进一步确定存在，对照品紫外灯下可看到明颢的黄檗碱成分，需经薄层扫描进一步确定薄层扫描结果，紫外光下也可以推测北豆根中不含有小StartRiStartMaxRfStartRiStartMaxRf朋mHfrlghlhtaK%EndRfEndHeight10.15S5.80.17155.679.410.20112D.^7D.3013.46.32ci.aiQ.63。.阴■:0005911&60S0.611540.663.30.6915.17.710.715.1%sub^t^riic«2176.6S6.22ufiknov/ri*ao.o317unknown*260unknown*20248.02unkfi&vvn■Aiea分析：此为供试液1的扫描图，得四个峰型，可见Rf=0.15时有高峰位，之后的峰型均较小，说明展开剂的配比不行，或是展开剂的部分液体挥发掉，使得展开剂没有把供试品的峰型展开，基本集中在点样前沿。|Tntch2,|Tntch2,ID'A日咅igc住HunknQwn*A日咅igc住HunknQwn*只餌ItFtf Hei那ht FtfH吕也M坠 RfH右舸竝Area %D.15 443D17 1351 10000 020 04 W174 1Q0DO分析：此为供试液2的扫描图，得一个峰型，集中在Rf=0.15的位置上，此后都没有看到峰型，与供试液1的高峰型的Rf值相同，说明展开剂的配比不行，原因与供试液1相同。

3UD-a5D-qOO-asn-303-35R-:ill-旧3UD-a5D-qOO-asn-303-35R-:ill-旧A10u-5ii-n~5d~~cHion~5o~dUnio~dId~a®~FVd~~o®~iTSoKCnneoAesiignedBuhatartceunknown*unknosiYnTunknown*unknown*10.W149017132S41370.1894659261620.W24.00.2283-026.240.2S43.S32S7.430.803D.332口4Q29420.524300233£±0.77610.7311.03460.79O.7783072Start Stflirt M-sikMax Max EndEnd AroaPeak刖 H附硏lit 殆 He■也h| 鳴 iRf HeJght阳日日 鳴分析：此为对照品小檗碱的扫描图，有四个峰型，都是集中在斑点前沿，Rf值在0.16有高峰型，Rf在0.19和0.33都有大幅度的低矮峰型，峰型也是没有展开，说明展开剂的配比不行。供试液1、2与对照品的扫描图比较，可得出供试液中不含有小檗碱。六、思考题研究药用植物活性成分群整体特性有什么意义？答：植物亲缘关系、化学成分与疗效间存在一定的联系性，亲缘相近的种生物活性和疗效往往具有很大的相似性；同样地，具有相似的疗效的植物，其系统学上有具有相近的亲缘关系。药用植物生物活性物质的分布规律，与疗效和植物进化系统的关系，是促进药用植物资源开发的重要环节，从理论上总结植物亲缘关系、化学成分与疗效问存在一定的联系性．为探索药用植物生物活性物质的分布规律提供理论指导．对于开发药用植物资源具有重要指导意义。研究药用植物活性成分群整体特性，实现中药药性与化学成分的有机关联，有助于从整体方向宏观系统地研究药用植物之间的亲缘关系以及药性、药理效应、生物特性等，以便于更好地开发药用植物资源。在一定亲缘关系范围内,确定同一药性的共性药理效应,分析与药性相关联的化学成分,进而揭示中药药性——药理效应——化学成分之间的关联规律。将中药药性、药理效应、化学成分有机结合,为突破制约中药药性研究的瓶颈,提供新的思路和视角。表7化学成分特征揭示的小乘科(广义)植物系统关系Table7PhylogeneticrelationshipsofBerberidaceae(s.l.)revealedfrompliytocheniicalcharacters1234 5 6 7 8南大竹科NandinacEdu南犬竹^Nandina+++小粟科Berberidaceae小聚属Berbens++十大功劳^Mafionia一十鬼臼科PodophyllaceaetribePodophylleae鬼臼属Podophyllum^包括桃儿七属Sinopodophvllum.八角莲属Dy'sosma)^--山荷叶属Diphylleia—tribeEpimedieae淫羊霍属Epimedium+十 +温哥华属Vancouvena+++裸花草l^Achlys鲜黄连属Jeffersoma(Plagiorhegmd)兰山草属Ranzania+狮足草科Leonticaceae牡丹草属Gyvmospernmm++++囊果草属Zeo”tice+十++红毛七属Caidophylhnn+十+十蓬加蒂属Bongardia++++1.节基异唾I林生物碱：2•鬼臼毒素类木脂素：3・三菇皂卄:4.唾喏里西喘生物碱：5.淫羊蕾井类黄酮：6.木脂素：7.异香豆素：8.貳类化合物。11.lsobenzydquiiioline:2.podophyllotoxinligiian:3.triteipenesaponin:4.quinolizidinealkaloid:5.icariiiiflavonoid;6.lisnan:7.isocoumarin:8.nandiniii.七、实验讨论1、小檗科植物含有丰富的化学成分,成为该类植物多种生物活性的物质基础。和形态上的变异相似,该科植物的化学成分差异也很大,亲缘关系比较近的植物化学成分有很大的相似性。总体来讲,小檗科化学成分主要包括苄基异喹啉生物碱、鬼臼毒素类木脂素、喹喏里西啶生物碱、淫羊藿苷类黄酮、香豆素和其他黄酮等酚类成分。2、薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱有紫外光和可见光吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、检查和含量测定的方法。薄层扫描法具有分离效能高、快速、简便等特点，因而适用于中药的分析。薄层扫描法虽然精密度不如HPLC法高，但可作为补充用于无紫外吸收，或不能用HPLC法分析的组分如人参皂貳、贝母生物碱等。3、 薄层扫描法影响因素较多，测定时应注意以下几点：薄层厚度应均匀，表面应平整，最好使用预制板；点样应准确，原点大小应一致；喷洒显色剂应均匀，量适中；并用胶布加以固定。薄层扫描法检测的线性范围较窄，应在其线性范围内测定。4、 以薄层层析法进行中草药的成分鉴定,都要有标准样品与供试品同时进行薄层层析。当用数种溶剂展开后，标准品和供试品出现的斑点形状、Rf值、颜色都完全相同,则可初步结论是同一化合物。5、 TLC法存在拖尾现象，据分析，影响薄层色谱拖尾的因素很多，包括温度的影响、相对湿度的影响、溶剂蒸汽的影响还有展开剂的选择、展开方式的选择等。薄层色谱是样品与硅胶之间的吸附/解吸附的过程，当样品与硅胶吸附能力过强的时候，就会造成拖尾，这时候需要更强的溶剂系统来解吸附。展开剂选择的一般原则是根据相似相溶原理:极性大的组分——极性大的展开剂，极性小的组分——极性小的展开剂。当单一溶剂不能很好分离则可采用混合溶剂来展开.并可改变混合溶剂配比来得到满意的分离效果;在做薄层层析时尽量浓缩样品提取液，并设法使药物斑点集中,用增大药斑中药物含量的方法加深药斑颜色,以增加照片反差,这种方法在一定范围内有效,超量不仅不能增加反差,反而药斑出现拖尾现象,影响检验准确性。6、 展开操作应注意的几个问题是:①色谱缸密闭性能要良好②防止边缘效应③吸附色谱展开速度较快,约需10-30min,受温度影响较小。7、 在全班19组19种药材的实验中，只有黄柏和黄连检测出有小檗碱，但据查文献，北豆根为防己科植物蝙蝠葛的干燥根茎，又名黄条香、野豆香、蝙蝠藤，主要含有生物碱，如蝙蝠葛碱，蝙蝠葛诺林碱，蝙蝠葛可林碱，为苄基异喹啉类生物碱，小檗碱也是异喹啉类生物碱，故对其进行超声提取及小檗碱的薄层扫描，为检测出小檗碱，可以采用加大药材用量，旋蒸浓缩等方法使小檗碱在样品中含量变大，实验中使用了旋蒸浓缩的方法，可能是因为药材中含有生物碱的量很少，超声用药材量也少，故第一次展板紫外光下也看不到任何荧光，于是旋蒸浓缩后加lml甲醇溶解后点样，展板，紫外光下观瘵可看到样品弱的荧光（如图3），薄层扫描得北豆根中没有小檗碱.8、 小檗碱是一种季铵生物碱，极性较大，实验中使用的展开剂：二氯甲烷：丙