微生物限度检查法

微生物限度检查法

江苏省苏州药品检验所细菌、霉菌（酵母菌）计数1简述（微生物限度检查的意义）细菌、霉菌、酵母菌计数是检测规定企业单位内的非灭菌制剂污染的活菌数量，是判定药品受到微生物污染程度的重要指标，也是对生产企业的药品、原料、辅料、设备器具、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。细菌、霉菌、酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数方法之一，也是目前国际上许多国家常用的一种方法。该方法以在琼脂平板上，每个细菌（营养琼脂）、霉菌（玫瑰红钠琼脂）、酵母菌（玫瑰红钠琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂）形成一个独立可见的菌落为计数依据。测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（一群在营养琼脂上发育的嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、PH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。一个细菌、霉菌和酵母菌菌落均可由一个或多个菌细胞形成。因此供试品中所测的菌落数实际为菌落形成单位数（colonyformingunit，CFU），而不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。微生物检验项目：细菌总数测定、

霉菌与酵母菌总数测定、控制菌检验（包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、金黄葡萄球菌、破伤风梭菌）以及活螨的检验。

2.1设备2.1.1无菌室2设备、仪器及用具2.1.1.1结构和要求无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区（面积不超过10m2，高度不超过2.4m）由缓冲间（2个）、操作间组成。操作间与缓冲间之间应有样品传递箱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。

无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙与地面及墙壁、天花板连接处应呈凹弧形无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300勒克斯。缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯（２～２.5W/m3），紫外杀菌灯应距实验台面高度不超过1M，并应定期检查辐射强度，不得低于70μW.cm-2（１M距离）。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。2.1.1.2温度、湿度无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外杀菌灯杀菌效果，故温度应控制在18～26℃，相对湿度40～60％。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压、不低于4.9Pa。2.1.1.3操作间操操作间应安安装空气除除菌过滤层层流装置。。洁净度不不应低于是是10000级，局局部净化度度为100级，或放放置同等级级净化工作作台，并准准备药物天天平，乙醇醇灯，火柴柴，乙醇棉棉，大、小小橡皮乳头头等。2.1.1.4缓冲冲间缓冲冲间内应有有洗手盆，，无菌衣、、帽、口罩罩、拖鞋等等。缓冲间间内不应放放置培养箱箱和其他杂杂物。2.1.1.5洁净净级级别别及及检检查查方方法法通常常采采用用尘尘粒粒数数及及浮浮游游菌菌数数或或沉沉降降菌菌数数测测定定法法。。洁净净室室（（区区））空空气气洁洁净净度度级级别别表表洁净度级别尘粒最大允许数/立方米

≥0.5μm≥5μm百级3，5000万级350，0002，000十万级3，500，00020，000三十万级10，500，00060，000级别微生物最大允许数

换气次数/小时

浮游菌/立方米沉降菌/皿

百级510.3米/秒万级100320十万级5001015三十万级—15---2.1.1.5.1浮浮游游菌菌数数测测试试方方法法（（参参照照中中人人民民共共和和国国国国家家标标准准GB/T16293-1996））。。2.1.1.5.2沉降降菌菌数数测测定定(ⅡⅡ法法)无菌菌室室操操作作台台消消毒毒擦擦拭拭处处理理后后，，先先启启动动层层流流净净化化装装置置30min，，将备备妥妥的的营营养养琼琼脂脂平平板板3个个(经经30～～35℃℃预预培培养养48h，证明无菌落落生长。)以无菌方方式（或经经传递箱））移入操作作间，置净净化台左、、中、右各各1个，开开盖，暴露露30min后将盖盖上上。在30～35℃培养养箱内倒置置培养48h，取出检查。。3个平平板生长的的平均菌落落数不超过过1个。无菌室操作作台或净化化工作台要要定期检测测其洁净度度，应达到到100级级。净化工工作台中的的高效及中中效过滤器器应根据检检测情况，，必要时予予以更换处处理。2.1.1.6消毒处理无无菌室应应在每次操操作前、后后均用０.1%苯扎扎溴铵溶液液或其他消消毒液擦拭拭操作台及及可能污染染的死角。。开动层流流净化装置置，同时用用紫外杀菌菌灯照射30min。2.1.2其他设备备、净化工工作台、恒恒温培养箱箱（30～～35℃））、生化培培养箱（25～28℃），微微波炉（或或其他适宜宜加热装置置）、康氏氏振荡器、、匀浆仪（（3000～8000r/min）、恒温水浴、、电热干燥燥箱（250～300℃）、、电冰箱、、空调、高高压蒸汽灭灭菌器（使使用时要进进行灭菌效效果检查并并应定期请请有关部门门检定）。。2.2仪仪器及器皿皿2.2.1菌落计数数器、显微微镜（1500X）、电子天平或或药物天平平（感量0.1g），pH系列比色计计。2.2.2玻璃器皿锥锥形瓶(250～～300ml，内装玻璃珠珠若干)、、研钵（陶陶瓷制，直直径10～～12cm）、培养皿(Ф9cm)、量筒(100ml)、试管(18×180mm)及塞、吸管管(1ml分度0.01，10ml分度0.1)、注射射器(20或是30ml)、注射针头、、载玻片、、盖玻片、、玻璃消毒毒缸(带盖盖)。。玻璃器皿用用前应洗涤涤干净，无无残留抗菌菌物质吸管管口上端距距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松松棉花，置置吸管桶内内或牛皮纸纸袋中。锥锥形瓶、量量筒、试管管均应加棉棉塞或硅胶胶塞，再用用牛皮纸包包扎。玻璃璃器皿，均均于160℃干热灭灭菌2h或高压蒸汽汽121℃℃灭菌30min，烘干备用。。2.3用用具2.3.1大、小小橡皮乳头头（放于干干净带盖的的容器中，，并应定期期用70%～75%乙醇溶液浸浸泡）。2.3.2无菌衣衣、帽、口口罩、手套套（洗净后后配套，用用牛皮纸包包严）灭菌菌，备用。。也可用一一次性无菌菌衣、帽、、口罩、手手套。2.3.3接种环环(白铱铱金或镍铬铬合金，环环径4～～5mm、长度6～10cm)、乙醇灯、乙乙醇棉球或或碘伏棉球球、灭菌剪剪刀或灭菌菌手术刀和和灭菌镊子子、灭菌钢钢锥、灭菌菌称样纸、、不锈钢药药匙、试管管架、火柴柴、记号笔笔、白瓷盘盘、洗手盆盆、陶瓦盖盖（12cm）、实验记录纸纸等。3试液液3.1消毒毒液3.1.10.1%苯扎溴铵溶溶液（供洗洗手、擦拭拭操作台面面用）。3.1.25%石碳酸溶液液(配好好后装入玻玻璃消毒缸缸内，供供消毒带菌菌吸管用)亦可选选用其他适适宜消毒液液。3.1.375%乙醇溶液3.1.4碘酊或或碘伏溶液液3.2稀稀释剂和试试剂3.2.10.9%无菌氯化钠溶液液(附录3.1)3.2.2无菌聚聚山梨酯-803.2.3无菌聚聚山梨酯-80氯化钠溶液液(附附录3.2)3.2.4无菌磷磷酸盐缓冲冲液(pH7.2)(附录3.3)3.2.5无菌0.1%氯化三苯四四氮唑溶液液(TTC)(附录2.15)4培培养养基4.1营营养琼琼脂培培养基基(附录录5.2)4.2玫玫瑰红红钠琼琼脂培培养基基(附录录5.3)4.3酵酵母浸浸出粉粉胨葡葡萄糖糖(YPD)琼脂培培养基基(附录录5.4)培养基基制备备应注注意：：4.3.1采采用干干燥培培养基基，按按说明明配制制，应应对灭灭菌后后的培培养基基pH值进行行校验验。若若为自自配培培养基基，原原料应应挑选选，琼琼脂凝凝固力力应测测定，，以确确定配配制时时琼脂脂用量量。试试剂规规格应应为化化学纯纯以上上的试试剂。。4.3.2配配制的的培养养基不不应有有沉淀淀，如如有沉沉淀，，应于于溶化化后趁趁热过过滤，，灭菌菌后使使用。。4.3.3培培养基基的分分装量量不得得超过过容器器的确确2/3，以免免灭菌菌时溢溢出。。包装装时，，塞子子必须须塞紧紧，以以免松松动或或脱落落造成成染菌菌。4.3.4培培养基基配置置后应应在2h内灭菌菌，避避免细细菌繁繁殖。。4.3.5灭灭菌后后的培培养基基在冷冷暗处处保存存备用用，放放置时时间不不能过过长，，以免免水分分散失失及染染菌。。已熔熔化的的培养养基应应一次次用完完，开开启后后不宜宜再用用。4.3.6勿勿用电电炉直直接熔熔化琼琼脂培培养基基，以以免营营养成成份过过度受受热而而破坏坏。应应用水水浴或或微波波炉加加热。。5供供试试品抽抽样、、保存存及检检验量量5.1抽抽样5.1.1一一般般采用用随机机抽样样方法法，抽抽样量量应为为检验验用量量（2个以上上最小小包装装单位位）的的3倍量（（以备备复试试）。。5.1.2抽抽样时时，凡凡发现现有异异常或或可疑疑的样样品，，应选选取有有疑问问的样样品，，但机机械损损伤、、明显显破裂裂的包包装不不得作作为样样品。。5.1.3凡凡能从从药品品、瓶瓶口（（外盖盖内侧侧及瓶瓶口周周围））外观观看出出长螨螨、发发霉、、虫蛀蛀及变变质的的药品品，可可直接接判为为不合合格，，无需需再抽抽样检检验。。5.2保保存存5.2.1供供试品品在检检验之之前，，应保保存在在阴凉凉干燥燥处，，勿冷冷藏或或冷冻冻，以以防供供试品品内污污染菌菌因保保存条条件不不妥引引起致致死，，损伤伤或繁繁殖。。5.2.2供供试品在在检验之之前，应应保持原原包装状状态，严严禁开启启。包装装已开启启的样品品不得作作为供试试品。5.3检检验量量5.3.1所所有剂型型的检验验量均需需取2个以上包包装单位位（中药药蜜丸、、膜剂，，需取自自4丸、4片以上））。5.3.2固固体及半半固体(粘稠性性供试品品)制剂剂检验量量为10g。5.3.3液体制剂剂检验量量为10ml。5.3.4膜膜剂除另另有规定定外，中中药膜剂剂检验量量为30～50cm2，化学药及及生化药药膜剂检检验量为为10cm2。5.3.5特殊贵重重或微量量包装的的药品，，检验量量可酌减减。除另另有规定定外，口口服固体体制剂不不低于3g。液体制剂剂采用原原液者不不得少于于6ml，采用供试试液者不不得少3ml，外用药品品不得少少5g。6操作作方法6.1试试验前前准备6.1.1将将供试品品及所有有已灭菌菌的平皿皿、锥形形瓶、匀匀浆杯、、试管、、吸管（（1ml、10ml）、量筒、稀稀释剂等等移至无无菌室内内。每次次试验所所用物品品必须事事先计划划，准备备足够用用量，避避免操作作中出入入操作间间。编号号后将全全部外包包装（牛牛皮纸））去掉。。6.1.2开启无菌菌室紫外外杀菌灯灯和空气气过滤装装置，并并使其工工作不低低于30min。。6.1.3操操作人员员用肥皂皂洗手，，关闭紫紫外杀菌菌灯，进进入缓冲冲间，换换工作鞋鞋。再用用0.1%苯扎溴铵铵溶液或或其他消消毒液洗洗手或用用乙醇棉棉擦手，，穿戴无无菌衣、、帽、口口罩、手手套。6.1.4操操作前先先用乙醇醇棉球擦擦手，再再用碘伏伏棉球（（也可用用乙醇棉棉球）擦擦拭供试试品瓶、、盒、袋袋等的开开口处周周围，待待干后用用灭菌的的手术镊镊或剪将将供试品品启封。。6.2供供试液液的制备备6.2.1液液体供试试品取取供试品品10ml，置灭菌锥锥形瓶中中，加入入90ml稀释剂，，摇匀，，作为1:10供试液。。含王浆或或蜂蜜的的液体制制剂和滴滴眼剂直直接用供供试品作作为供试试液。6.2.2固固体、半半固体或或粘稠供供试品称称取供试试品10g，置于匀浆浆杯或适适当灭菌菌容器中中，加入入100ml0.9%无菌氯化化钠溶液液，用匀匀浆仪（3000～5000r/，2～4min），振荡器或或乳钵研研磨等方方法分散散混匀。。胃溶胶胶囊加稀稀释剂后后置45±1℃水浴中振振摇，肠肠溶胶囊囊加无菌菌磷酸盐盐缓冲液液后先打打碎再置置45℃±±1℃水浴振摇摇溶解。。6.2.3非水溶性性供试品品软软膏剂、、乳膏剂剂称称供试品品5g（5ml），，加入含已已灭菌溶溶化并保保温45℃左右右的司盘盘-805g、单硬脂酸酸甘油酯酯3g、聚山梨酯酯-8010g混合物的的烧杯中中，用无无菌玻棒棒搅拌均均匀后，，慢慢加加入45℃左右右的0.9%无无菌氯化化钠溶液液85ml，边加边搅搅拌，使使供试品品充分乳乳化，作作为供试试液（1：20）。油剂取取供试品品10ml，加入无菌菌聚山梨梨酯-805～8ml，摇匀，再再加入稀稀释剂至至100ml。栓剂称称取供试试品10g，置灭菌锥锥形瓶中中，加适适量稀释释剂，置置45℃水浴保温温10min，使溶，加加入无菌菌聚山梨梨酯-805～8ml，振摇使之之乳化，，再加稀稀释剂（（稀释剂剂和聚山山梨酯-80总量为100ml），摇匀。6.2.4气雾剂将将供试试品置冰冰箱（4～８℃℃）１h，取出，用用碘伏棉棉球（也也可用乙乙醇棉球球）擦拭拭供试品品开启部部位周围围，然后后以无菌菌钢锥仔仔细钻孔孔并插入入容器中中，勿移移出钢锥锥，以转转动方式式使容器器内抛射射剂全部部抛出。。以无菌注注射器吸吸出全部部药液，，按标示示量补加加稀释剂剂至足量量（若含含非水溶溶性成份份，加适适量无菌菌聚山梨梨酯-80液）此液液即为供供试品原原液。6.2.5膜膜剂中中药膜剂剂一般取取30～50cm2，将药膜剪成成碎片，置置灭菌锥形形瓶中，加加入稀释释剂100ml，于45±1℃℃水浴保温，，振摇使溶溶。西药药膜一一般取样为为10cm2，制备供试液液方法同上上。6.2.6茶剂取供供试品10g，置灭菌锥形形瓶中，加加入稀释剂剂100ml，振摇30s，以灭菌纱布布过滤（如如为袋泡茶茶，可直接接取2袋，，以称样结结果按1：：10加稀稀释剂，浸浸泡30min）。。以上供试品品如吸水膨膨胀，或粘粘度过高，，增加稀释释剂，制成成都是1：：20～1：100供试液。。6.3供供试液的稀稀释（10倍递增稀稀释法）6.3.1取2～3支支灭菌试管管，分别加加入9ml灭菌稀释剂剂（此时操操作一般为为：左手执执试管并将将塞打开，，倾斜，右右手执10ml吸管吸量，，注意：勿勿在乙醇灯灯焰峰正上上方操作，，以免灯焰焰将供试液液中菌细胞胞杀灭）。。加完稀释释剂后，试试管塞应立立即塞上。。6.3.2另取1支1ml灭菌吸管吸吸1：10均匀供试试液1ml，，加入入装装有有9ml灭菌菌稀稀释释剂剂的的试试管管中中混混匀匀，，即即为为1：：100供供试试液液。。以以此此类类推推，，根根据据供供试试品品污污染染程程度度，，可可稀稀释释至至1：：102、1：：103、1：：104等适适宜宜稀稀释释级级（（至至少少共共3级级））。。每每递递增增1稀稀释释级级，，必必须须另另换换一一支支吸吸管管。。在作作10倍倍递递增增稀稀释释时时，，吸吸管管插插入入第第1级级稀稀释释液液内内不不低低于于液液面面2.5cm，，反复复吸吸吹吹约约10次次。。吸吸液液时时，，应应先先吸吸至至高高于于吸吸管管上上部部刻刻度度少少许许，，然然后后提提起起吸吸管管，，贴贴于于试试管管内内壁壁调调整整液液量量至至刻刻度度，，再再沿沿第第2级级稀稀释释管管的的内内壁壁靠靠近近液液面面(勿勿接接触触液液面面)缓缓慢慢地地吹吹出出全全部部供供试试液液(吸吸管管内内应应无无粘粘附附或或残残留留液液体体)，，然然后后将将吸吸管管放放入入消消毒毒液液缸缸内内。。6.4注注平皿皿在在进行行10倍递递增稀稀释的的同时时，以以该稀稀释级级吸管管，吸吸取各各级稀稀释液液各1ml至每个个灭菌菌平皿皿中（（从高高稀释释级至至低稀稀释级级吸液液时可可用1支吸吸管）），每每一稀稀释级级注2～3个平平皿（（此时时，一一般为为左手手执平平皿，，将盖盖半开开，右右手执执吸管管），，注平平皿时时，将将1ml供试液液慢慢慢全部部注入入平皿皿中，，管内内无残残留液液体，，防止止反流流到吸吸管尖尖端部部。同时作作阴性性对照照（待待各级级稀释释液注注皿完完毕后后，用用1支支1ml吸管吸吸取稀稀释剂剂各1ml，，分别注注入4个平平皿中中。其其中2个作作细菌菌阴性性对照照；另另二个个作霉霉菌、、酵母母菌数数阴性性对照照，如如另用用YPD琼脂测测定酵酵母菌菌数时时，则则再增增加2个平平皿作作酵母母菌数数阴性性对照照）。。6.5倾倾注注培培养养基基将将预预先先配配制制好好的的培培养养基基（（细细菌菌计计数数用用营营养养琼琼脂脂，，霉霉菌菌、、酵酵母母菌菌计计数数一一般般用用玫玫瑰瑰红红纳纳琼琼脂脂，，含含蜂蜂蜜蜜、、王王浆浆液液体体制制剂剂另另加加用用YPD琼脂脂））熔熔化化，，冷冷至至45℃℃时时，，倾倾注注上上述述各各个个平平皿皿15ml，，以顺顺时时针针或或反反时时针针方方向向快快速速旋旋转转平平皿皿混混匀匀，，注注意意，，混混匀匀时时切切勿勿将将培培养养基基溅溅到到皿皿边边及及皿皿盖盖上上，，置置操操作作台台上上待待凝凝。。6.6培养细细菌计计数平平板倒倒置于于30～35℃℃培养养箱中中培养养48h。霉菌、、酵母母菌计计数平平板于于25～28℃℃培养养箱中中培养养72h。6.7菌菌落计计数6.7.1一般将将平板板置菌菌落计计数器器上或或从平平板的的背面面直接接以肉肉眼点点计，，以透透射光光衬以以暗色色背景景，仔仔细观观察。。勿漏漏计细细小的的琼脂脂层内内和平平皿边边缘生生长的的菌落落。注注意细细菌菌菌落与与霉菌菌菌落落和酵酵母菌菌菌落落以及及它们们与供供试品品颗粒粒、培培养基基沉淀淀物、、气泡泡等的的鉴别别。必必要时时用放放大镜镜或用用低倍倍显微微镜直直接观观察或或挑取取可疑疑物涂涂片镜镜检。。6.7.2供供试品如如为微生生物制剂剂，应将将有效微微生物菌菌落排除除，不可可点计在在细菌、、霉菌和和酵母菌菌数内。。排除的的方法需需按该制制剂微生生物品种种而定，，并须观观察菌落落特征及及染色形形态。6.7.3供供试品稀稀释液常常含有不不溶性原原料、辅辅料，培培养基注注皿后可可能产生生沉淀物物，经过过培养后后有时形形成数量量很多且且难与菌菌落肉眼眼相鉴别别的有形形物。为为了有利利于菌落落计数，，可在操操作时将将适宜稀稀释级的的供试液液多增加加注皿（（1～2个平皿）），注皿皿后不经经培养而而放置于于冰箱（（勿结冻冻）中，，在计数数菌落时时作为对对照。或用0.001%TTC营养琼脂脂注皿，，经培养养后可将将细菌菌菌落与其其他有形形物区别别开来。。有些软膏膏等非水水溶性供供试品，，经营养养琼脂注注皿后呈呈乳白色色，培养养后生长长的菌落落不易辨辨认和点点计，为为防止这这种情况况，也可可用0.001%TTC营养琼脂脂注皿，，经培养养后生长长的菌落落为红色色，衬于于白色背背景上易易于点计计。6.7.4若若平板上上有2个个或2个以上上菌落重重叠，肉肉眼可辨辨别时仍仍以2个个或2个个以上菌菌落计数数；若平平板生长长有链状状菌落，，菌落间间无明显显界限，，一条链链作为一一个菌落落计，但但若链上上出现性性状与链链状菌落落不同的的可辨菌菌落时，，仍应分分别计数数，若生生长蔓延延的较大大片状菌菌落或花花斑样菌菌落，一一般不宜宜作为计计数用。。6.7.5计录录各各稀稀释释级级平平板板的的菌菌落落数数，，求求出出各各稀稀释释级级2或或3个个平平板板菌菌落落的的平平均均数数。。当当菌菌落落数数在在15以以上上的的同同稀稀释释级级二二平平板板菌菌落落数数相相差差1倍倍时时，，该该稀稀释释级级菌菌落落数数不不得得作作为为计计数数依依据据；；当当2个个平平板板菌菌落落数数均均在在15（（含含15））以以下下时时，，两两个个平平板板菌菌落落数数的的差差值值允允许许范范围围为为0～～4，，1～～7，，2-9，，3～～10，，4～～12，，5～～14，，6～～15。。超超出出以以上上范范围围即即视视为为操操作作误误差差，，不不得得作作为为计计数数依依据据。。6.7.6在下列情况况下、点计计菌落时间间需提前或或延长培养养时间：6.7.6.1菌菌落生长呈呈蔓延趋势势者，细菌菌点计需在在24h，霉菌点计需需在48h作初步点计计（点计霉霉菌菌落时时，动作宜宜轻，勿反反复翻转平平板或造成成震动，使使早期形成成的孢子散散落在平板板的其他部部位，又萌萌生新的霉霉菌菌落，，导致计数数误差）。。6.7.6.2在在48h点计细菌，，72h点计霉菌时时，菌落极极小不易辨辨认，需延延长培养时时间4～7天，再点点计菌落数数。6.7.6.3对对有疑议的的供试品以以YPD培养基作酵酵母菌计数数时，可培培养至1周周再点计菌菌落数。6.7.7供试品品按营养琼琼脂平板点点计细菌菌菌落数；固固体供试品品按玫瑰红红钠琼脂平平板点计霉霉菌数，一一般液体供供试品按玫玫瑰红钠平平板点计霉霉菌及酵母母菌总数；；含蜂蜜及及王浆的合合剂按玫瑰瑰红钠琼脂脂平板点计计霉菌菌落落数，按YPD琼脂平板点点计酵菌落落数，二者者合并为霉霉菌及酵母母菌数。6.8菌落数报告告规则:6.8.1细菌数选取取平均菌落落数在30～300之间的稀释释级，霉菌菌、酵母菌菌数选取平平均菌落数数在30～100之间的稀释释级作为报报告菌数的的依据。如只有1个个稀释级平平均菌落数数在此30～300（30～～100））之间，则则将该稀释释级的菌落落计数器乘乘以稀释倍倍数报告（（见附表例例6.8.1）。6.8.2如有2个相相邻稀释级级平均菌落落数在30～300（30～～100））时，则按按比值计算算。当比值值≤2时，，则以2个个稀释级的的平均菌落落数均值报报告。当比比值＞2时时，则以低低稀释级的的平均菌落落数乘以稀稀释倍数报报告（见附附表附6.8.3））。比值=

高稀释级平均菌落数×稀释倍数

低稀释级平均菌落数×稀释倍数

6.8.3如有3个稀稀释级平均均菌落数均均在30～～300(30～～100)之间时，，则以后2个稀释级级计算级间间比值报告告(同6.8.2)，(见附附表例6.8.3)。6.8.4如各稀释级级平均菌落落数均在300（100）以以上，则按按最高稀释释级平均菌菌落数乘以以稀释倍数数报告；如如各稀释级级平均菌落落数均在30以下，，则按最低低稀释级平平均菌落数数乘以稀释释倍数报告告（见附表表6.8.4）。6.8.5如各稀稀释级平均均菌落数均均不在30～300(30～100)之间，则则以最接近近30或300（100）的稀释级平平均菌落数数乘以稀释释倍数报告告（见附表表6.8.5）。6.8.6如各稀稀释级的平平均菌落数数均无菌落落生长或最最低稀释级级平均菌落落数小于1时，，应报告菌菌落数为＜＜10个/g或ml（见附表例6.8.6）。如供供试品原液液平板均未未生长霉菌菌及酵母菌菌，报告未未检出霉菌菌及酵母菌菌/ml。6.8.7当各稀释级级平均菌落落数小于30时，如如高稀释级级平均菌落落大于或等等于低稀释释级平均菌菌落数时，，应以培养养基稀释法法重新测定定，按测定定结果报告告菌落数（（见附表例例6.8.7）。培养基稀释释法测定培养基稀释释法：取低稀释级级供试液（（原液或1：10供供试液）3份，每份份各1ml，分别注入5个或5个个以上平皿皿中（每皿皿0.2ml或<0.2ml），每1个平皿皿倾注营养养琼脂培养养基约15ml，混匀，凝固固后，倒置置培养，计计数。5个或5个个以上平板板点计的菌菌落之和，，即为每1ml菌落计数器器，共得3组数据据。以3份份低稀释级级供试液菌菌落数的平平均值乘以以稀释倍数数报告。6.9结结果报告6.9.1菌落数数在100以内时，，按实有有数据报告告。6.9.2菌落数数大于100时，取取两位有效效数字报告告，第三位位按数字修修约规则处处理。6.10复复试供供试品细菌菌数、霉菌菌及酵母数数其中任一一项一次检检验不合格格，应重新新取2倍包包装量供试试品，依法法作单项复复试两份，，以三次检检验结果的的均值报告告。7．注意事项7.1供供试品检验验全过程必必须符合无无菌技术要要求。使用用灭菌作具具时，不能能接触可能能污染的任任何器物，，灭菌吸管管不得用口口吹吸。7.2从从供试品稀稀释至倾注注琼脂培养养基操作应应在1h内完成，避避免由于时时间过长导导致菌细胞胞繁殖或死死亡。7.3供供试液稀释释及注皿时时应取均匀匀的供试液液，以免造造成实验误误差。7.4为为避免细菌菌菌落蔓延延生长，宜宜采用下列列方法处理理：7.4.1开盖干干燥将将已凝固的的琼脂平板板开盖，倒倒置斜放于于净化工作作台上，开开机1～2h后合盖，放放入培养箱箱培养；7.4.2换陶瓦瓦盖将已已凝固的琼琼脂平板盖盖换上新近近干热灭菌菌的陶瓦盖盖。7.4.3加TTC于倾注培养养基前，在在每1000ml营养琼脂内内加入灭菌菌1%TTC溶液1ml（最终浓度为为0.001%），，混匀后倾倾注平皿。。7.5一一般情况下下，以营养养琼脂平板板计数细菌菌数，玫瑰瑰红钠琼脂脂平板计数数霉菌、酵酵母菌数。。在特殊情情况下，如如营养琼脂脂平板生长长了霉菌、、酵母菌，，且多于玫玫瑰红钠琼琼脂平板的的霉菌和酵酵母菌菌落落数，则营营养琼脂平平板的霉菌菌、酵母菌菌数报告；；反之，如如玫瑰红钠钠琼脂平板板生长了细细菌，且多多于营养琼琼脂平板的的细菌菌落落数，则以以玫瑰红钠钠琼脂平板板的细菌数数报告。如营营养养琼琼脂脂平平板板生生长长的的霉霉菌菌、、酵酵母母菌菌数数或或玫玫瑰瑰红红钠钠琼琼脂脂平平板板生生长长的的细细菌菌菌菌落落数数超超过过该该品品种种微微生生物物限限度度规规定定时时，，经经复复试试2次次，，如如3次次结结果果的的平平均均值值仍仍超超过过规规定定，，应应判判供供试试品品不不合合格格。。8检检验验报告告书本品按按中国国药典典2000年版版微生生物限限度检检查法法标准准检验验，结结果符符合或或不符符合规规定。。二、大大肠杆杆菌检检查法法1．简简述大肠杆杆菌即即大肠肠埃希希菌（（Escherichiacoli）），为肠杆杆菌科科埃希希菌属属的模模式种种。埃埃希菌菌属除除大肠肠埃希希菌外外，新新近发发现有有非脱脱羧埃埃希菌菌等四四个种种。大肠埃埃希菌菌是人人和温温血动动物肠肠道内内的栖栖居菌菌，随随粪便便排出出体外外。在药品品中检检出大大肠杆杆菌，，表明明该样样品受受到人人和温温血动动物的的粪便便污染染，即即可能能污染染肠道道病原原体。。大肠肠埃希希菌除除普通通大肠肠杆菌菌外尚尚有致致病性性大肠肠杆菌菌，可可引起起婴幼幼儿、、成人人爆发发性腹腹泻。。为保保证人人体健健康，，口服服药品品必须须检查查大肠肠杆菌菌。用4-甲基基伞形酮葡葡糖苷酸（（4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，即MUG））和靛基质质（Indole））试验检查查大肠杆杆菌是一一项新技技术，其其检验步步骤为：：增菌培培养后，，转种MUG蛋白胨培培养基培培养，多多数情况况下不需需要从混混合菌中中分离单单个菌，，如MUG、、Indole试验为阳阳性或阴阴性即可可报告结结果，如如MUG与Indole试验不一一致时，，则需分分离培养养、革兰兰染色、、镜检及及生化试试验鉴别别。原理:利利用目标标菌限定定酶作用用的底物物的水解解产物，，产生颜颜色或荧荧光反应应作为指指示系统统来鉴定定目标菌菌。实验证明明96%的大大肠杆菌菌含β-葡糖苷酸酸酶（β-glucuronidase，，GUD），约10%的沙沙门氏菌菌属一些些菌种也也含有此此酶。MUG被GUD水解，产产生荧光光，由于于荧光反反应的敏敏感度较较颜色反反应强行行千万倍倍，易于于观察，，没有主主观性，，因而用用MUG鉴定大肠肠杆菌已已被广泛泛应用于于临床、、食品、、饮水、、污水等等的检测测。单一的MUG鉴别大肠肠杆菌其其漏检率率达6%，鉴于于98%的大肠肠杆菌靛靛基质试试验为阳阳性，故故将MUG-靛基质试试验结合合，用EMB琼脂平板板分离，，辅以IMViC试验，在在理论上上可使大大肠杆菌菌的检出出率达99%。。三、沙门门菌检查查法1.简简述沙门氏菌菌属是肠肠杆菌科科的重要要致病菌菌，沙门门菌分5个亚属属，包括括常见的的伤寒、、甲型副副伤寒、、乙型副副伤寒、、丙型副副伤寒、、鼠伤寒寒，猪霍霍乱等沙沙门菌在在内，迄迄今已发发现2000多多个菌型型。药品品中中沙沙门门菌菌，，是是以以鉴鉴定定沙沙门门菌菌属属为为准准，，即即对对每每g（（或ml））药品品中中是是否否检检出出沙沙门门菌菌作作出出检检验验报报告告。。由于于沙沙门门菌菌菌菌型型繁繁多多，，各各菌菌型型的的生生化化及及血血清清学学特特性性虽虽密密切切相相关关，，却却不不尽尽相相同同，，采采用用一一种种增增菌菌增增培培养养基基和和两两种种分分离离培培养养基基，，不不可可能能是是所所有有沙沙门门菌菌的的最最适适增增菌菌及及分分离离条条件件。。此外外，，由由于于药药品品在在生生产产过过程程中中，，常常受受到到加加热热、、干干燥燥等等加加工工步步骤骤的的影影响响，，药药品品中中污污染染的的沙沙门门菌菌可可受受到到损损伤伤或或呈呈休休眠眠状状态态，，故故须须在在增增菌菌培培养养前前先先进进行行预预增增。。然然后后再再进进行行增增菌菌及及分分离离、、三三糖糖铁铁琼琼脂脂初初步步鉴鉴别别、、生生化化试试验验、、血血清清学学试试验验等等步步骤骤。。四、、铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌检检查查法法1．．简简述述铜绿绿假假单单胞胞菌菌（（Pseudomonasaeruginosa）），，习称称绿绿脓脓杆杆菌菌，，为为假假单单胞胞菌菌属属菌菌种种，，广广泛泛分分布布在在土土壤壤，，水水及及空空气气，，人人和和动动物物的的皮皮肤肤、、肠肠道道、、呼呼吸吸道道均均有有存存在在，，故故可可通通过过环环境境和和生生产产的的各各个个环环节节污污染染药药品品。。本菌菌是是常常见见的的化化脓脓性性感感染染菌菌、、在在烧烧伤伤、、烫烫伤伤，，眼眼科科及及其其他他外外科科疾疾患患中中常常引引起起继继发发感感染染，，由由于于本本菌菌对对许许多多抗抗菌菌药药物物具具有有天天然然的的耐耐药药性性，，增增加加了了治治疗疗的的难难度度、、国国内内外外药药典典均均将将铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌检检查查列列为为检检查查项项目目之之一一。。铜绿绿假假单单胞胞菌菌按按增增菌菌，，分分离离、、纯纯培培养养、、革革兰兰染染色色镜镜检检及及生生化化试试验验等等步步骤骤进进行行检检验验。。五、、金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌检检查查法法1简简述述金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌（（Staphylococcusaureus））为葡葡萄萄球球菌菌属属中中的的一一种种，，广广泛泛分分布布于于自自然然界界，，空空气气、、土土壤壤、、水水及及物物品品上上，，人人和和动动物物皮皮肤肤及及与与外外界界相相通通的的腔腔道道中中，，也也经经常常有有本本菌菌存存在在。。本本菌菌可可产产生生多多种种毒毒素素及及酶酶，，这这些些毒毒性性物物质质能能引引起起局局部部及及全全身身化化脓脓性性炎炎症症，，严严重重时时可可发发展展成成为为败败血血症症和和脓脓毒毒血血症症，，是是人人类类化化脓脓性性感感染染中中重重要要的的病病原原菌菌。。本菌抵抵抗力力较强强，干干燥情情况下下能生生存数数月，，80℃30min的条件件下尚尚能存存活，，5%石碳碳酸或或0.1%升汞汞溶液液10～15min才会被被杀死死。金黄色色葡萄萄球菌菌检查查按增增菌、、分离离、纯纯培养养、革革兰染染色镜镜检和和血浆浆凝固固酶试试验等等步骤骤进行行。本法适适用于于外用用药品品及一一般滴滴眼剂剂、眼眼膏剂剂的检检查。。六、活活螨螨检查查法1．简简述螨，属属于节节肢动动物门门，蛛蛛形纲纲，蜱蜱螨目目。种种类繁繁多，，分布布甚广广。其其生生活习习性各各异，，分为为自由由生活活和寄寄生生生活两两种类类