基因工程在生物肥料上的开发利用

基因论文题目：基因工程在生物肥料上的开发利用学生姓名：学号：专业年级：生物技术2010级所在学院：基因工程在生物肥料上的开发应用xxx（xxx学院，xx，xxxx）摘要在当今世界世界人口的不断增长,自然资源的耗减和环境污染等问题的频频出现促使人们把追求人与自然和谐相处推上当今社会发展主要的位置，现今，低碳环保型生活是广大群众所竞相追逐的的潮流，而且生态文明建设也已经成为全球性的时代的潮流。现代农业技术应用过程中出现的一些生态问题对农业可持续发展已构成严重威胁[1]。对于建立绿色环保型生态农业也日趋重要。绿色农业生产模式既适应了社会发展和人类文明进步的要求，同时也为微生物肥料提供了广阔的发展空间，实践也证明生物肥料在土壤肥力的提高与保持、营养元素的转化、提高化肥利用率、促进作物生长、拮抗土传病害，环境净化与生态系统的平衡等方面起着重要的作用。而且,生物肥料在环境保护及产量方面,并不低于化肥。因此生物肥料在绿色农业生产、资源节约和环境友好型社会建设中将发挥越来越重要的作用，市场潜力巨大，研究和开发微生物肥料具有重要的经济、社会和环境效益。目前，我国微生物肥料生产的发展机遇是前所未有的。生物肥料也会在未来的中国农业可持续发展中起到不可替代的作用。关键词:微生物肥料;生态文明;可持续发展1生物肥料的简介生物肥料是指一类含有活微生物的特定制剂，应用于农业生产中，能够获得特定的肥料效应。由于生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用，保护环境以及提高农作物产品品质和食品安全等方面表现出不可替代的作用，发展前景良好。目前，生物肥料可分为两类：一类是狭义的生物肥料，是指含有特定微生物活体的制品，一般应用于农业生产，通过其中所含微生物的生命活动，增加植物养分的供应量或促进植物生长，提高产量，改变农产品品质及农业生态环境；另一类则是广义的生物肥料，是指通过其中的微生物的生命活动，不但能提高植物营养元素的供应量，还能产生植物生长激素，促进植物对营养元素的吸收利用或有拮抗某些病原微生物的致病作用，减轻农作物病虫害而促进作物产量的增加。生物肥料的种类很多，现在推广应用的主要有根瘤菌类肥料、固氮菌类肥料、解磷解钾菌类肥料、抗生菌类肥料和真菌类肥料等等[2]。2与生物肥料相关微生物目前，自然界中可进行生物固氮的微生物种属范围分布较广，按其固氮方式主要可分成自生固氮、共生固氮和联合固氮微生物3种：⑴自生固氮微生物，能独立固氮，主要分布于细菌和蓝细菌的不同科、属及生理群中，如红螺菌、红硫细菌、绿硫细菌和梭状芽胞杆菌等都是自生固氮菌，利用光能或化能固定氮素；⑵共生固氮微生物，主要通过与宿主植物形成共生固氮体系，进行生物固氮，根据固氮微生物的寄主植物类型又分为与豆科植物共生和非豆科植物共生2种；⑶联合固氮微生物，主要是聚集在根表或通过植物根部伤口定植到根内，不形成根瘤状特异化结构的一种特殊共生固氮体系，其中联合固氮微生物以根际分泌物为碳源和能源，而植物则得到固氮菌固定的氮及分泌的生物活性物质[3]。3生物肥料的主要作用目前社会上对生物肥料的看法存在一定的误解或偏见。有看法认为,生物肥料的肥效很高，把它当成万能肥料，甚至认为可以取代化肥,有看法则认为菌肥根本无效，或者与复合化肥中营养元素相比，认为其养分不足。合理使用生物肥料既可以补充化肥的不足，又可以减少环境污染和保护生态环境。生物肥料的作用是多方面的。它可以作为绿色农产品生产的肥料、土壤净化剂、土壤改良剂,不仅能提高土壤肥力,还可促进土壤的良性循环;此外,生物肥料的施用可以提高化肥利用率,对减少经济浪费和保护环境起到一定的作用。生物肥料的重要作用如下：⑴生物固氮微肥中的根瘤菌、固氮菌等微生物能将空气中的氮固定并转化供农作物吸收利用。据统计，固氮菌每667m2能固定45kg氮，全世界每年生物固氮总量约为13t，因此，开发利用生物固氮是低成本制造氮肥的重要途径。⑵降低环境污染、提高产品品质微生物肥料中含多种解磷、钾微生物，如芽抱杆菌、假单胞菌，它们可以将土壤中的难溶的有机或无机磷或钾分解为植物可以吸收利用的可溶性磷、钾，从而提高了土壤的肥力和肥料的利用率，使农作物的安全性提高，环境得到保护。⑶促进农作物生长一些微生物细菌在生长繁殖过程中可产生大量的各类植物生长激素，能够调节植物的生长，部分激素还能打破种子休眠，促进生根、发芽，使作物提前成熟，这些特点都是化肥所不具备的。⑷抗病、抗旱，增产增收施用微生物肥料后，在植物根基区，有益细菌形成优势群体，抑制病原微生物的人侵，提高植株的抗病能力;同时，合理施用微生物肥料会改善土壤结构，减少板结，增强土壤肥力，增产增收[4]。⑸提高化肥利用率微生物肥料与化肥混合施用,既可增产又减少化肥用量,降低成本,亦可改善土壤及农产品品质,减少污染,发展绿色食品。中国绿色食品发展中心已将微生物肥料列入生产绿色食品允许使用的肥料。⑹改良土壤生物肥料中有益微生物能产生糖类物质与植物粘液、矿物胶体和有机胶体结合在一起,可以改善土壤团粒结构,提高土壤肥力,增强土壤物理性能和减少土壤颗粒损失,在一定条件下还能参与腐殖质形成,增进腐殖酸含量,改善土壤腐殖酸的品质,减少环境污染[5]。4生物肥料的应用前景生物肥料可以节约能源，降低生产成本，且其不仅用量少，而且本身具有无毒无害，没有环境污染的特点，而且生物肥料在作物增产和品质改善等方面具有重要的积极作用，故其拥有广阔的前景，具体如下：⑴适用品种多，市场需量大适宜施用微生物肥料的作物种类繁多，各种豆科作物、粮食作物、蔬菜瓜果等都可以应用微生物肥料提高产量、改善品质。据不完全，我国目前微生物肥料年产量在10万~40万t，与同期化肥相比，微不足道，微生物肥料市场容量是相当大的。⑵生产成本低，应用效果好化肥生产成本的提高，价格上涨幅度过快，令广大农民难以接受，且效果差，污染环境。微生物肥料以生物固氮为例，它可以持续不断供应氮素营养，并且能够减少环境污染和温室效应，污染少，成本低。⑶生产无公害绿色食品，减少环境污染的需要随着绿色农业(生态农业)的发展，生产安全、无公害的绿色食品已成为一个发展趋势。并且由于大量使用化肥，土壤性质恶化，土壤质量下降，地下水污染等问题日益突出；消纳城市废弃物的压力愈来愈大，因此，无污染的微生物肥料的综合利用和开发显示出它的应用优势和良好发展前景。⑷通过筛选优良菌种、改进生产工艺和生产设备为生产优质的微生物肥料创造了条件，而且基因工程新菌株的出现使微生物肥料的广泛应用成为可能。近年来兴起的植物根际促生细菌(PGPR)的研究和开发，更为微生物肥料的应用开辟了广阔前景[6-8]。5基因工程对生物肥料菌株的改造5.1材料和方法5.1.1供试菌株快生型大豆根瘤菌15067、土著大豆根瘤菌、大肠杆菌(E.coli)DH5α5.1.2质粒载体质粒载体pTR102、质粒载体pUC19(含有lac启动子)、质粒载体pET-28a、辅助质粒pRK2073。5.1.3nifA基因的克隆以快生型大豆根瘤菌15067的基因组DNA为模板,采用同源序列克隆法,设计nifA基因全长的特异性引物(P1,P2),采用PCR方法,扩增目的基因nifA基因全长。对回收的DNA片段进行纯化,并进行连接,将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,采用PCR方法进行签定,将阳性克隆测序。5.1.4表达载体pTR-Plac-nifA的构建将nifA基因全长连入质粒载体pUC19中lac启动子下游,构建重组载体pUC19-nifA;设计引物(P3,P4),PCR扩增带有lac启动子的nifA基因(Plac-nifA)片段。将其连入pET-28a多克隆位点处,构建重组载体pET-28a-Plac-nifA;设计引物(P5,P6),PCR扩增带有lac启动子的nifA基因以及T7终止子(Plac-nifA-T7)片段,并将该片段连到luxAB基因标记的质粒载体pTR102,构建表达载体pTR-Plac-nifA。5.1.5大豆根瘤菌基因工程菌株的构建采用三亲本杂交的方法,将表达载体pTR102-Plac-nifA转化土著大豆根瘤菌。由于重组载体pTR-Plac-nifA上含有发光酶基因luxAB,利用癸醛对培养的平板中的大豆根瘤菌转移接合子进行发光性检测,并用X光片进行结果记录[9]。5.2讨论目前在根瘤菌中已发现三类固氮基因:结瘤基因(nod)、固氮基因(nif)和共生固氮基因(fix)。对根瘤菌中的这三个基因加以改造可以提高固氮能力。也可以通过加入某些促进因子是固氮基因能够高效率表达，增加固氮效率。土著根瘤菌的固氮能力较低,根瘤菌的固氮过程主要由nif基因簇控制,其中nifA基因是最重要的正调节基因,对根瘤菌的固氮和结瘤生理过程起着决定性的作用。利用基因工程方法构建重组根瘤菌菌株主要路线有两条:一是提高根瘤菌的固氮效率;二是增强根瘤菌的强竞争结瘤能力。上述研究采用分子生物学及基因工程手段增加nifA基因的额外拷贝数,构建高效固氮根瘤菌工程菌株,该菌与豆科植物共生,在根部形成根瘤,可以为植物提供生长所需要的部分氮素,提高大豆植株的固氮结瘤能力,同时nifA基因诱导宿主防卫反应基因的表达[10-12]。同时在构建载体中引入luxAB标记基因,该基因具有简便、快速、准确、直观的特点,可显著提高重组子筛选的效率及根瘤检测的准确性。为了生产无污染的绿色农产品,构建既能利用大气中的有效资源,又能抗病的基因工程菌株,既降低了农业生产成本,又减轻了环境污染,也促进了生态平衡,有利于农业的可持续发展,这将成为今后生物固氮研究领域中的发展方向和追求目标。氮素营养对农业生产的决定性作用众所周知,在我国农业生态系统中氮素限制普遍存在,但同时氮肥浪费造成的污染却在不断加剧,因此共生固氮在提供氮素、减少污染及受损生态系统功能恢复中的作用将会更加引人注目,今后的理论研究应集中在以下方面:①共生固氮植物对生态系统中植被格局、地上和地下生态过程的作用,影响共生固氮速率的因素极其生态学机制;②对豆科植物及其根瘤菌的遗传结构改造,提高豆科植物共生固氮体系的抗逆能力,选育和培育高效、抗逆性和适应性强的共生体系③豆科植物细胞中特异的结瘤信号传导通路嫁接到其他非豆科植物根瘤菌生长信号通路上,在非豆科植物特别是主要农作物中构建共生固氮体系,打破根瘤菌的宿主专一性,以实现农业的可持续发展[13]。而且目前也存在着基因工程安全性问题，要在建立严格的筛选体系，筛选出目标效能稳定抗逆性好的菌株。而且通过基因工程的技术手段构建的基因工程菌株一定要符合安全性要求，以免造成生态入侵等严重的生态危机。在基因工程后期生产中要提高生产工艺，确保产品质量。生物肥料的产品质量标准也有待于进一步完善。参考文献[1]孟瑶,徐凤花,孟庆有,顾万荣.中国微生物肥料研究及应用进展[J].土壤肥料科学,2008,24（6）:276-283.[2]张彦，孙磊，卢丽娜.微生物肥料在绿色农业中的应用.第三届微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会会议论文摘要.[3]何元胜,胡晓峰,岳宁,周佳,陈俊秋,弓新国.微生物肥料的作用机理及其应用前景[J].湖南农业科学,2012,13-16.[4]张强,秦涛,张红艳,阮祥稳.微生物肥料的研究应用进展[J].新疆农业科学,2005,42（增）:159-160.[5]叶光祎,刘友林,尹增松.微生物肥料发展状况及前景[J].云南农业,1999,7;22.[6]赵娟娟.微生物肥料的作用及应用前景[J].土肥水利,46.[7]袁田,熊格生,刘志,贺利熊.微生物肥料的研究进展[J].湖南农业科学,2009,（7）:44-47[8]盛玉婷.微生物肥料的发展现状及前景[J].安徽农学通报,2008,14(11):80-81.[9]李海英,张喜波,刘金玲,于海鹏,杨乐,蒙明明,贾珊珊.导入额外拷贝nifA基因的大豆根瘤菌工程菌株的构建[J].黑龙江大学自然科学学报,2010,27