毛细管电泳-荧光结合微透析取样技术对丙二醛(MDA)含量进行实时、在体检测课件

Detectionofmalondialdehyde

invivo

usingmicrodialysis

sampli-ngwithCE-fluorescence毛细管电泳-荧光结合微透析取样技术对丙二醛（MDA）含量进行实时、在体检测

主要内容

一、研究背景介绍二、仪器试剂三、实验方法四、实验结果讨论五、文献优点缺点1、研究背景介绍

丙二醛（Malomdialdehvde，MDA）是机体内的氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，形成的脂质过氧化物，它的浓度可以反映脂质过氧化程度。MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成，对机体造成损害甚至死亡。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。对MDA的准确测定可指导人们对机体的受损程度或耐受程度进行正确的评价，有助于医学、生物学、药理及工农业生产的发展。现有测定MDA

的方法用于MDA测定已有几种方法：〔1〕分光光度法。分光光度法灵敏度较低；〔2〕荧光法。已报道的荧光法由于萃取溶剂不同或按照原文献方法无混匀器使萃取不完全而造成结果不准确；〔3〕高效液相色谱法。高效液相色谱法需昂贵仪器。〔4〕比色法。检测方法常受到多种因素的干扰，尤其是当试样处于特殊的情况下，机体内可能会积累很多的干扰物质。基于以上方法的不足，本文提出了利用毛细管电泳-荧光方法结合微透析技术对丙二醛（MDA）含量进行实时、在体检测的方法。什么是微透析取样？微透析(Microdialysis)技术是一种将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术。在体微透析取样技术有别于传统的生物采样方法，能够在不明显损伤动物或人体组织的情况下，实现长时间连续取样，与分析仪器联用，可对微量样品实现实时分析。它具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点。微透析取样的原理基本原理：

在体微透析技术是在组织中植入半透膜探头(probe)装置,体外微量泵使灌流液(perfusate)流经探头,组织中被测物质沿浓度梯度差逆向扩散进入灌流液,并达到一种动态平衡,通过测定流出液,即透析液(dialysate)中待测物的浓度(Ces),研究组织细胞外液(extracelluarfluid,ECF)中待测物的水平(Cos)及其变化过程。探针微透析系统组成

微透析系统一般由微透析探针、连接管、收集器、灌流液和微量注射泵组成。微透析探针是核心部件，由透析膜（管）与入液管和出液管连接而成，探针前端是多碳聚合物半透膜（聚丙烯腈，PAN），透析分子极限为6－100kda，多为20kda。灌流液多为生理盐水、林格氏液和人造脑脊液。组成部件微透析探针注射泵实时自动采样进样器自动样本收集器

微透析取样可以与许多检测技术联用。包括以分离为基础的检测技术如高效液相色谱和毛细管电泳，以非分离为基础的技术，如生物传感器、免疫学检测和质谱。因为高效液相色谱有高选择性、易自动化等特点,微透析技术与高效液相色谱联用较多,但是液相色谱存在需要的样品量多，分析时间长，得到的时间分辨率不高，成本较高等缺点，使其应用受到一定的限制。

毛细管电泳（capillaryelectrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳（highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。

CE具有不同于传统色谱的分离机制，它具有分辨率高、分离速度快、所需样品量少、样品处理相对简便的优点，为与微透析技术联用提供了理想的条件。

2、仪器设备1.Beckman-CoulterP/ACEMDQ型毛细管电泳仪2.未处理石英毛细管柱：55cm×75μm（i.d.）3.微透析探针(MicroLumen,Tampa,FL,USA)4.KH-1微透析注射泵及控制装置5.离子阱质谱仪(ThermoScientific)6.超声波清洗仪7.pHS-4C型精密酸度计8.电子天平

试剂1.MDA（丙二醛四丁铵盐）2.boric

acid（硼酸）and3-mercaptopropionicacid(3-MPA)（3-巯基丙酸）andTBA（Sigma-Aldrich）.3.TBA（硫代巴比妥酸）（CaymanChemical）.4.Brij35（布里杰35去污剂，[聚氧乙烯月桂醚]一种非离子型去污剂）（MP

Biom-edicals）.5.Sulfuricacid（硫酸）6.saltsforRinger’s

solution（林格氏液（一种生理盐溶液））

(Fisher).7.nanopurewater

Ringer’ssolutioncompositionwas:147mMNaCl,3mM

KCl,1mMMgCl2,and1.2mMCaCl2.

小鼠→用混合麻醉剂麻醉→以1μL/min的流速灌流纯林格氏液溶液，搜集样本一小时→10mM3-MPA通过探针注入小鼠脊椎50min(诱导小鼠癫痫发作）→以1μL/min的流速每隔10min搜集样本（微透析取样）→将8μL搜集的样本加入离心管→再加入3μLTBA和硫酸2:1混合的混合液→离心5s→95摄氏度加热20min→急速冷冻保存在-20摄氏度（MDA衍生化）→取出样本，恢复至室温→用纯水稀释一半→以0.5psi注射5s→分离电压设置为10kV→CE分离检测→采集数据(样本分离检测）空白的TBA和加入MDA标准物溶液→用丁醇进行液液萃取（除去盐和硫酸）→转移丁醇层至另一离心管→丁醇层用氩气吹干→用500mL含有0.1%乙酸的50%甲醇和水重新配置溶液→以2μL/min的流速注射进入MS→图谱数据记录处理（质谱鉴定）3.实验方法毛细管电泳原理示意图4.实验结果讨论1.衍生化（Derivatization）2.分离与鉴定（Separationandidentification）3.反应优化（Reactionoptimization）4.微透析确认（Microdialysisvalidation）4.2Separationandidentification4.4Microdialysisvalidation

Concludingremarks

在本文，我们阐述了一种通过微透析技术在体检测MDA的方法。在动物实验的过程中，微透析取样的使用使得局部特定样本的获得成为可能。利用微透析取样检测MDA提供了细胞脂质体过氧化的实时过程，而组织采取或者血液样本不能提供。MDA在酸性条件下用TBA衍生化20分钟，然后无需任何预处理直接注射进毛细管。这种方法提供的检出限为25nM(S/N=3)，线性范围25–2400nM(1.8–174ng/mL)。该方法已经被用于小鼠心脏、肌肉、肝脏和大脑透析液中MDA的定量检测。

本方法的缺点

微透析技术的缺点就是需对取出的样品进行准确可靠的校正，主要涉及到对探针的回收率的测定。

文献缺点在本实验的分离和鉴定步骤中，电泳图谱上出现了一个污染物的峰。虽然本文对其到底是什么物质进行了一部分探索，但最终还是没有说明它是什么物质的，只知道是来源于TBA。这对本文的实验结果的可信度造成了一定影响。Thankyou！仪器系统毛细管电泳系统的基本结构包括进样系统、两个缓冲液槽、高压电源、检测器、控制系统和数据处理系统。1－高压电源；2－检测器；3－毛细管；4－温度控制系统；5－记录/数据处理；

6－高压电极槽；7－低压电极槽。微透析取样的特点

（1）时间分辨性（2）空间分辨性（3）样品可不经预处理