G6PD缺乏高铁血红蛋白法检查分子生物学设计性实验课件

——G6PD缺乏高铁血红蛋白法检查分子生物学设计性实验

2010级临床八大班第四实验室组员：主讲：患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。

体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5µmol/L，结合胆红素13.7µmol/L，未结合胆红素71.8µmol/L，尿蛋白（++），潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。案例：1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？蚕豆病起病急遽，大多在进食新鲜蚕豆后1～2天内发生溶血，最短者只有2小时，最长者可相隔9天。如因吸入花粉而发病者，症状可在数分钟内出现。潜伏期的长短与症状的轻重无关。本病的贫血程度和症状大多很严重。症状有全身不适、疲倦乏力、畏寒、发热、头晕、头痛、厌食、恶心、呕吐、腹痛等。巩膜轻度黄染，尿色如浓红茶或甚至如酱油。一般病例症状持续2～6天。最重者出现面色极度苍白，全身衰竭，脉搏微弱而速，血压下降，神志迟钝或烦躁不安，少尿或闭尿等急性循环衰竭和急性肾功能衰竭的表现。2.请设计实验进一步明确诊断要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流程及注意事项，结果如何分析。G6PD缺乏症的检查方法：高铁血红蛋白还原实验变性珠蛋白小体生成实验（可做为G6PD缺乏的筛选实验）G6PD活性测定G6PD荧光斑点实验（特异性较好、方法简单）抗坏血酸-氰化物实验硝基四氮唑蓝定量法G6PD比值法高铁血红蛋白还原实验……高铁血红蛋白还原实验——G6PD缺乏症检查实验名称：高铁血红蛋白还原实验——G6PD缺乏症检查高铁血红蛋白还原实验——G6PD缺乏症检查实验原理：在有足量的还原辅酶Ⅱ（NADPH)存在下，反应液中的高铁血红蛋白能被高铁血红蛋白还原酶即细胞色素b5（黄素酶）还原成亚铁血红蛋白。在体外，这一还原过程还需要递氢体亚甲蓝的参与。但红细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）含量正常时，由磷酸戊糖代谢途径生成NADPH的数量足以完成上述还原反应。当红细胞内G6PD含量不足或缺乏时，高铁血红蛋白还原速度减慢，甚至不能还原。高铁血红蛋白呈褐色，在波长635nm处有吸收峰，可用分光光度计加以测定。高铁血红蛋白还原实验——G6PD缺乏症检查操作：1.在试管中加入葡萄糖20mg，109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml,静脉血1.8ml,混匀。2.离心15min，取出，调整血细胞与血浆的比例为1：1后混匀。3.取上述抗凝血1ml,加亚硝酸钠葡萄糖混合溶液和亚甲蓝溶液各0.05ml，颠倒混合15次，使与氧气充分接触，加塞后放37℃水浴或孵箱中3h。高铁血红蛋白还原实验——G6PD缺乏症检查计算：高铁血红蛋白还原率（%）=[1–(SA-B)/(ST-B)]×100%式中：SA-B、ST-B分别为还原后和还原前高铁血红蛋白的吸光度；SA-B/ST-B为还原后剩余高铁血红蛋白的比值。高铁血红蛋白还原实验——G6PD缺乏症检查结果分析：高铁血红蛋白还原实验（MHb）正常人还原率>75%(比色法）蚕豆病患者MHb还原率31%~74%（杂合子遗传者）还原率<30%（纯合子型）患者如存在高铁血红蛋白（HbH）、不稳定血红蛋白、高脂血症、巨球蛋白血症等均可造成假阳性。NADPH-MHb还原酶缺乏（罕见）也可出现阳性结果3.从生化代谢解释患儿的临床表现和实验检查结果。红细胞和血红蛋白含量减少原因：G6PD缺陷不能通过磷酸戊糖途径提供足够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽红细胞脆性增加，易于破裂红细胞在遇到蚕豆中的某些强氧化剂时，细胞膜破坏红细胞减少实验检查结果：大量血红蛋白释放

形成原尿后，超过肾小管和集合管的重吸收作用尿蛋白量增加形成酱油样尿胆红素增加红细胞减少实验检查结果：单核吞噬系统红细胞大量破坏单核吞噬细胞系统产生胆红素增加超过肝摄取、转化和排泄的能力未结合胆红素浓度增加（血浆胆红素、未结合胆红素含量增高、结合胆红素浓度改变不大）当超过34.2mmol/L时出现显性黄疸肝对胆红素的摄取、转化和排泄增多进入胆道系统肠肝循环尿胆原和尿胆素增多实验检查结果：实验检查结果：潜血：潜在的出血，也就是由肉眼下或是显微镜下无法观察到有红血球的存在，但如果用试纸检验时却有反应，当红血球被破坏时，其内含的血红素会释放出来，所以，尿液试棒才能侦测到血红素的反应。尿液下没有见红细胞可能是因为红细胞本身的寿命已到，也可能是喝了大量水，尿液稀薄红血球破裂。4.要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？可使用技术：扩增G6PD基因第10、11、12、13外显子639bpDNA片段结合寡核苷酸探针斑点杂交技术PCR/SSCP片段结合寡核苷酸探针斑点杂交技术PCR/SSCP分析法DNA序列分析探针技术G6PD基因定位于X染色体长臂2区8带ⅶ因子及18Kb，中国人红-绿色盲基因之间（Xq28）,长18Kb，中国人G6PD基因绿色盲基因之间（Xq28）Xq28目前依法显得突变种类很多，但能引起题目中所诉临床症状G1376Ｔ和G6PD的突变点可能是G1376Ｔ和G1388A点突变G6PD基因含（13