植物细胞工程实验指导

7/7植物细胞工程实验指导实验一植物组织培养培养基的配制

【实验目的】

通过实验，掌握常用MS培养基的配制。

【仪器及试剂】

1．仪器：：500ml试剂瓶4个，100ml试剂瓶4个，高压灭菌锅，电子天平，烧杯（大、中、小各2个），玻璃棒，移液管，搪瓷缸，培养瓶，电炉，pH计或精密pH试纸，容量瓶（大、中、小各1个）2．试剂：见MS培养基的配制方法一览表

【操作步骤】

1、母液的配制：

为了避免每次配制培养基时都要对所需的各种成分进行称量，人们便把培养基中必需的一些物质按原量的10倍、100倍或1000倍称量后放在一起，成为一种浓缩液，这种浓缩液就叫“母液”。

①大量元素：一般配成使用浓度的10－20倍，浓度太大的母液

在冰箱保存时会结晶。除钙盐外，其它大量元素按一定倍数分别称量并分别用蒸馏水溶解后混合在一起，最后加蒸馏水定容。钙盐要单独配制，不能和PO43-、SO42-混合，以免生成Ca3(PO4)2或CaSO4，发生

沉淀。

②微量元素：微量元素因用量小，为称量方便及精确起见常配成100倍或1000倍的母液，即每种化合物的量加大100倍或1000倍，逐个溶解并混合在一起。

③铁盐：微量元素中的铁盐是单独配制的，由硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）5.56克和乙二铵四乙酸二钠（Na2-EDTA）7.46克溶于1升水中配成。每配1升培养基加铁盐5毫升。

④有机物质：主要指氨基酸和维生素物质，它们都是分别称量及分别用容量瓶配成所需浓度（0.1－10毫克/毫升），用时按培养基配方中要求的量分别加入。这些化合物都易溶于水，直接用水配制。

⑤生长调节物质：一般配成0.1－1.0毫克/毫升。

生长素类IAA、NAA、2,4-D等，配制时先按要求浓度称好药品，置于小烧杯中，用1－2毫升0.1N氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。如果用少量95％的乙醇来溶解亦可，有时效果不如氢氧化钠好。

配制细胞分裂素类物质时，则宜先用少量0.5N或1N盐酸来溶解，然后加蒸馏水至所需量。

2、配制培养基

①吸取各种母液，按培养基配方吸取一定量的各种母液混合在一起。大量及微量元素的母液吸取量为：

母液吸取量（ml）=配制培养基的数量（ml）/母液扩大倍数

有机物及生长调节物质的母液吸取量为：

母液吸取量（ml）=每升培养基要求的含量（mg）/每毫升母液中的含量（mg）

②称取一定量的蔗糖（或葡萄糖等），溶解后与1混合。

③称取一定量的琼脂，加蒸馏水，加热使其熔化成透明状后，和1合并。

④用热蒸馏水定容到一定体积，继续加热，不断搅拌，直至琼脂完全溶解。

⑤用pH计或精密pH试纸测pH值，用1N或0.1N氢氧化钠或盐酸将培养基的pH值调至5.8－6.0。

⑥将配好的培养基用漏斗或分装器分装到干净的培养瓶内。琼脂约在40℃时才凝固，所以有足够的时间来进行分装工作。

⑦用封口膜封口，并对不同的培养基及时做好标记。

3、灭菌

通常培养基应在汽相120℃的条件下在高压锅内灭菌20分钟。在高压灭菌锅的加热过程中，在气压指针上升到0.5公斤/厘米2时，放一次气，然后在温度达120℃、1.1公斤/厘米2时，保持此压力灭菌15－20分钟。灭菌完成后，待灭菌锅的压力0降到时，打开灭菌锅，取出培养瓶，放平，待培养基凝固后备用。

【注意事项】

1．实验中所用的各种容器一定要洗净、烘干。

2．用电子天平称量药品时，一定要用称量纸，对于有腐蚀性的药品，应将其放在小烧杯中称量。

3．各种母液应保存在2－4℃的冰箱中，以免变质、长霉。

4．吲哆乙酸（IAA）受热不稳定，所以不能和培养基一起灭菌，要过滤除菌。

5．用高压灭菌锅时，一定要先检查一下其中的水是否合适。

实验二植物叶片的脱分化和再分化培养

【实验原理】

分化了的植物叶片细胞往往具有全能性，在一定条件下进行离体培养，给于一定的营养与激素，可以脱分化为愈伤组织，由愈伤组织在一定的条件下逐渐形成具有两极性的胚状体，经过进一步的分化培养，给于不同的营养与激素成分，又可以生出完整的小植株。

【实验目的】

通过实验，掌握无菌操作方法，将烟草叶片培养成愈伤组织；将愈伤组织分化成幼苗。

【仪器、材料及试剂】

1.仪器：超净工作台，无菌滤纸、剪刀、镊子、大培养皿、无菌烧杯

2.材料：烟草无菌苗和室外培养的烟草幼苗

3.试剂：：70%的乙醇，0.1%的升汞，无菌水

【操作步骤】

1.操作前用温水和肥皂将手充分擦洗干净，再用70%的乙醇消毒，尽量做到不带菌。

2.将装有无菌苗的培养瓶用70％的乙醇消毒后放在超净工作台上备用；将室外培养的烟草先用自来水洗净后，再用70％的乙醇消毒1－2秒钟，再于0.1%的升汞中消毒5－10分钟。再于无菌条件下用无菌水冲洗4－5遍，用无菌滤纸吸干后备用。

3.接种，将上述材料在无菌条件下剪成0.5cm×0.5cm大小，接种于诱导培养基MS＋BA1.0＋NAA0.1中诱导愈伤组织，在此培养基上能诱导出愈伤组织并能长出小芽。

4.状苗生根培养，将3中培养的带有愈伤组织的小芽接种在MS基本培养基中，芽能长成幼苗并且能生根。

【注意事项】

1．操作前要洗手，进入超净工作台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。

2．点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼后，要冷却后才能夹取组织，以免烧焦组织。

3．不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

4．注意升汞是剧毒药品，一定不要直接用手接触，用完后要放在回收的容器中，不能直接倒入下水道中。

【实验报告】

观察并记录接种的烟草脱分化的情况。

【思考题】

1.接种的烟草组织有无污染？为什么？

2.愈伤组织细胞是否出现绿色？讨论其来源与影响？

3.烟草组织经过分化培养、长出完整的植株，说明什么问题？在理论和实践中有何价值？

实验三玉米成熟胚的培养

【实验原理】

成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚，它培养极易成功。在含有无机大量元素和糖的培养基上，就能培养成幼苗。

【实验目的】

1.掌握胚培养的方法

2.了解在种子萌发过程中胚各部分之间的互作，以及胚的各个组成部分的形态发生潜力。

【仪器、材料及试剂】

1．仪器：超净工作台，无菌滤纸、解剖刀、镊子、无菌培养皿、解剖镜、培养瓶。

2．材料：成熟玉米种子

3．试剂：70%的乙醇，0.1%的升汞，无菌水

【操作步骤】

1.成熟玉米种子的消毒及浸泡：

玉米种子用70％的乙醇消毒3－5分钟，再于0.1%的升汞中消毒10－15分钟。再在无菌条件下用无菌水冲洗4－5遍，用无菌滤纸吸干后放于盛有无菌水的培养瓶中，封口，浸泡2-3天，备用。

2.于无菌条件下，在解剖镜下，用镊子、解剖刀剥取完全的胚，将胚放在01.%的升汞中消毒1分钟，再用无菌水冲净后接种培养。

3.在无菌条件下，将完整的胚切去一部分后，再在01.%的升汞中消毒1分钟，再用无菌水冲净后接种培养。

【注意事项】

1．操作前要洗手，进入超净工作台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。

2．消毒的玉米种子要始终处于无菌的条件下。

3．点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼后，要冷却后才能夹取组织，以免烧焦组织。

4．不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

5．注意升汞是剧毒药品，一定不要直接用手接触，用完后要放在回收的容器中，不能直接倒入下水道中。

【实验报告】

1.观察并记录完整玉米种子的出苗情况。

2.观察并记录残缺玉米种子的出苗情况，去掉一部分后对其发芽能力及幼苗生长的情况有何影响？

【思考题】

.玉米种子去掉一部分后对其发芽能力及幼苗生长的情况有何影响？为什么？

实验四月季快繁

【实验原理】

月季的某些名贵品种，用传统的无性繁殖法速度太慢，难以满足人们日益增长和美化环境的需要。而采用快繁则解决了这种问题。快繁是由单芽诱导丛生芽，再诱导丛生芽生根，从尔大大提高了繁殖的速度。

【实验目的】

了解木本观赏植物的快繁技术

【仪器、材料及试剂】

1．仪器：培养瓶、超净工作台，剪刀、镊子、大烧杯、无菌培养皿、无菌滤纸

2．材料：当年生幼嫩月季枝条

3．试剂：70%乙醇，0.1%升汞无菌水

【操作步骤】

1.取具腋芽的月季嫩茎，先用自来水冲净，再用70%乙醇消毒1－2秒钟，然后置于0.1%升汞中消毒10分钟左右，再于超净工作台

上用无菌水冲洗4－5遍，用无菌滤纸吸干水后备用。

2.将上述材料在无菌条件下用剪刀剪成1－2cm带腋芽的茎段，接种于基本MS培养基上，待长出腋芽后，将其转入MS+BA1.0－2.0+NAA0.01－0.1的培养基上，诱导丛生芽。5周－6周可继带增殖一次，形成许多丛生芽。

3.诱导生根，将上述丛生芽接种于生根培养基1/2MS+NAA0.05上，3周后，可长出数条根。

4.移栽，将生根苗取出后，先洗去粘附的培养基，再栽植在营养介质（蛭石＋田园土（1:1））中，保持相对湿度在85％以上，并注意通风，并定期用0.1％多菌灵喷雾保苗。

【注意事项】

1．操作前要洗手，进入超净工作台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。

2．消毒的月季嫩茎要始终处于无菌的条件下，接种时最好去掉直接接触药品的两端。

3．点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼后，要冷却后才能夹取组织，以免烧焦组织。

4．不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

5．注意升汞是剧毒药品，一定不要直接用手接触，用完后要放在回收的容器中，不能直接倒入下水道中。

【实验报告】

1.观察并记录丛生芽的诱导情况。

2.观察并记录丛生芽的生根情况。

【思考题】

想一想，什么因素影响月季的增殖、生根以及移栽成活率？

实验五、六土壤农杆菌的转化实验（叶盘法）

【实验原理】

带有目的基因的农杆菌和植物受伤叶片共培养，可将目的基因转入植物叶片组织，通过叶片组织的脱分化可再分化培养，可获得带有目的基因的植株。

【实验目的】

了解植物的转基因技术。

【仪器、材料及试剂】

1．仪器：摇床、超净工作台，剪刀、镊子、大烧杯、无菌培养皿、无菌滤纸

2．材料：烟草无菌苗，带有目的基因的农杆菌，

3．试剂：2.药品：70%乙醇，0.1%升汞，无菌水

【操作步骤】

1.烟草无菌苗的获得，将烟草种子用70%乙醇消毒5分钟，然后置于0.1%升汞中消毒10－15分钟，再于超净工作台上用无菌水冲洗4－5遍，用无菌滤纸吸干后接种于基本MS培养基中，数周后可长

出无菌苗。

2.农杆菌的培养，将带有目的基因的农杆菌接种于带有利福平、卡那霉素霉素和链霉素的YEB培养基（配方见附表），在28℃、黑暗、200转的条件下培养24小时，取出后放入冰箱中备用。用时在4000转条件下离心5分钟，再用1/2MS液体培养基悬浮。整个过程都保持无菌。

3.烟草叶片的预培养，将烟草无菌苗在无菌条件下剪成0.5cm×0.5cm大小，接种于预培养培养基MS＋BA1.0＋NAA0.1中预培养5－10小时，目的是修复伤口。

4.共培养，将经过预培养的烟草叶片放入上述农杆菌中浸染5－10分钟，取出后用无菌滤纸吸去多余的菌液，接种于共培养培养基MS＋BA1.0＋NAA0.1中，于黑暗条件下共培养2天。

5.后培养，将4中培养2天的烟草叶片取出后接种于含有卡那霉素和哌拉西林钠的MS＋BA1.0＋NAA0.1培养基中培养。

【注意事项】

1．操作前要洗手，进入超净工作台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。

2．农杆菌的培养、贮存以及离心过程中都要保持无菌。

3．点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼后，要冷却后才能夹取组织，以免烧焦组织。

4．不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

【实验报告】

.观察并记录烟草叶片的愈伤组织诱导情况。

.观察并记录烟草叶片的污染情况

【思考题】

想一想，造成烟草叶片污染的原因？

实验七原生质体融合技术

【实验原理】

在物理或化学融合剂的诱导下，两种不同来源的原生质体彼此靠近，在很小的局部区域质膜紧密连接，彼此融合，在两个原生质体之间细胞质呈现连续状态，随着两个细胞质的扩展，融合完成形成球形的异核体或同核体。

【实验目的】

掌握植物的原生质体分离、培养的一般方法和步骤及培养过程中的无菌操作技术；了解植物的原生质体融合技术。

【仪器、材料及试剂】

1．仪器：超净工作台、吸管、移液管、恒温水浴锅（37℃）、无菌离心管、离心机，剪刀，镊子，培养皿，盖片，倒置显微镜2．材料：烟草无菌苗，番茄无菌苗。

3．试剂：促融液，清洗介质，溶液I，硅液200，PEG溶液，溶液Ⅱ

【操作步骤】

1．高pH－高浓度Ca2+诱导融合法：

①将从烟草和番茄的幼嫩叶片中新分离出的原生质体1:1混合，并使最终密度约为2.5×105原生质体/ml。

②在50g下离心3－5min，使原生质体沉积在一起。

③去掉上清液，加入2ml促融液，在50g下离心3－5min，使原生质体沉积。

④把离心管置于37℃水浴中10—30min。

⑤用清洗介质置换掉促融液，放置30min。

⑥用清洗介质洗2次。

⑦将原生质体悬浮在培养基中进行培养。

2．PEG诱导原生质体融合法：

①将从烟草和番茄的幼嫩叶片中新分离出的原生质体1:1混合，在50g下离心6min，使原生质体沉积。

②用吸管去掉上清液，将原生质体用10ml溶液I进行清洗。

③将洗过的原生质体重新悬浮在溶液I中，制成密度为4％－5%（V/V）的原生质体悬浮液。

④在1个60mm×15mm的培养皿中放1滴（2－3ml）硅液200。

⑤在这滴硅液上面放一张22mm×22mm的盖片。

⑥用吸管吸取大约150μl原生质体悬浮液置于盖片上。

⑦等待大约5min，以使原生质体沉降在盖片上形成一个薄层。

⑧在原生质体悬浮液中，逐滴加入450μlPEG溶液，在一个倒置显微镜下观察原生质体粘连的情况。

⑨在室温（24℃）下，将PEG溶液中的原生质体保温10－20min。

⑩以10min间隔轻轻加入2滴（每滴0.5ml）溶液Ⅱ，再过10min后，加入1滴原生质体培养基。

⑾每次用10ml新鲜的原生质体培养基，以各为5min的间隔，将原生质体清洗5遍，每次洗完之后，不要把盖片上的培养基全部去掉，要在原生质体上留下一薄层旧培养基，而将新鲜的培养基加于其上。