噬菌体载体和柯斯载体

第五章噬菌体载体和柯斯载体噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第1页!本章主要内容噬菌体一般特性λ噬菌体柯斯质粒M13噬菌体1、M13噬菌体特性及基因组结构2、M13噬菌体载体类型及特点噬菌粒比较噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第2页!节噬菌体的一般生物学特性（Bacteriophage，phage）

噬菌体可以在脱离寄主细胞的状态下保持生命，但一旦脱离了寄主细胞，就不能生长和复制利用寄主的核糖体、蛋白质合成因子、氨基酸和产能体系，进行生长和繁殖噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第3页!一、噬菌体的结构和其核酸类型结构：无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、线状体型核酸类型：最常见的是双链线性DNA、双链环形DNA、单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第4页!不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是比较大的。大分子量的噬菌体生命周期比较复杂；对寄主的依赖性较低有些噬菌体的DNA碱基不是由标准的A/T/C/G组成的。

Example：

T4噬菌体DNA没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞嘧啶（HMC）；SP01噬菌体DNA中没有T碱基，取代的是5-羟甲基尿嘧啶（HMU）。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第5页!噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第6页!三、噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：1、吸附吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上2、注入噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞3、转变被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所4、合成大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质5、组装包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒6、释放子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第7页!1、概念温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期。溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌溶源化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第8页!2、溶源周期的主要特征λ噬菌体和P1噬菌体λ噬菌体的特征：(1)噬菌体的DNA分子注入细菌细胞(2)经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭(3)噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体(4)细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第9页!噬菌体P1基本特征：不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒DNA分子。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第10页!①超敏感免疫性阻遏－操纵体系：cⅠ基因编码阻遏蛋白，启动子PL和PR，操纵基因OL和OROLPLcⅠPROR阻遏蛋白同操纵基因结合使RNA聚合酶不能起始转录，这种状态有充分的能力使原噬菌体保持“关闭”形式，溶源细菌能够正常生长。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第11页!整合酶必须首先与宿主编码的宿主整合因子(hostintegrationfactor，Hif)结合形成复合体，才能催化attP和attB在O区进行重组而形成原噬菌体。Hif噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第12页!1、λ噬菌体特性及基因组结构2、λ噬菌体载体类型及特点第二节λ噬菌体载体back噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第13页!λphage一、λ噬菌体的分子生物学概述1、基因组结构（1）cos位点线性双链DNA分子两端各有一条12nt组成的彼此完全互补的5’突出单链注入宿主后，粘性末端互补形成双链区，成为cos位点。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第14页!cos位点的两个作用：使进入细菌的DNA分子成为环状，这是插入细菌基因组的先决条件。作为识别位点，由内切酶将滚环复制的多联体DNA切开噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第15页!左侧区A～J中间区J～N右侧区N右侧（2）基因组噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第16页!感染早期：从单一复制起点开始双向θ型复制，由O基因和P基因产物激活；随后开始滚环复制，产生的线性DNA为基因组首尾串连的多联体DNA分子①DNA复制——O基因和P基因早期蛋白表达θ型复制cos噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第17页!②溶源化控制基因——attintxisXis：控制一种蛋白质删除酶的合成int：控制整合酶的合成att：提供整合酶的识别位点③控制基因cIII、N、cI、cro、cII④溶菌基因——S、R噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第18页!1、插入式载体一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体。只能插入较小分子量的外源（＜10kb），广泛用于cDNA及小片段DNA的克隆2、替换型载体（取代型载体）具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。可以克隆较大分子量的外源，克隆高等真核生物DNA二、λ噬菌体载体的主要类型噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第19页!

cIEcoRI

LA32.7RA10.6

λgt10

λgt10噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第20页!噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第21页!Charon4A载体

Charon4A载体是用Lac5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的LacZ）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择标记使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑Lac5

EcoRICharon4A噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第22页!Charon40的中间可取代区段是一种DNA短片段多次重复而成，称为多节段区，两个短片段之间可被NaeⅠ识别，因此用它做载体可以有效的将其中的多节段区清除，从而得到的多是重组的噬菌体。克隆能力达到9～22kb短片段重复替换区

MCSMCSCharon40LA19.2RA9.6噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第23页!替换型载体克隆外源DNA的步骤1、应用适当的核酸内切酶消化λ载体，除去可取代的DNA片段；2、将上述所得的

λDNA载体臂同外源DNA片段的连接；3、对重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第24页!（三）凯伦噬菌体载体在λ噬菌体基础上发展起来的，既有插入型又有替换型；在基因工程实验中的用途十分广泛承受外源DNA的能力：几个kb到23kb噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第25页!三、λ噬菌体载体的改良改良的目标：扩大克隆容量设计可对重组体分子作正选择的克隆载体构建可以方便的通过转录作用制备外源DNA插入序列之RNA探针的克隆载体发展可以使插入的真核cDNA与β－半乳糖苷酶形成融合蛋白的克隆载体噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第26页!基因red和gam位于非必需区域内，外源DNA片段能置换基因red和gam形成重组体，其重组体不能在recA-的P2溶源菌中繁殖可以在recA＋的P2溶源菌中繁殖并且显示出Spi-的表型。因此只要选用recA+的P2溶源菌作为宿主菌，就可以对重组体进行筛选。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第27页!λDNA的复制是由θ型向滚环型的转变，受到gam基因控制基因gam功能：蛋白产物和寄主细胞的外切核酸酶Ⅴ（宿主recB和recC基因产物）结合成复合物，失去对λDNA的作用活性，因而λ噬菌体能够合成成熟的多联体DNA，供作包装底物基因red功能：参与裂解性生长早期发生的重组反应，是核酸外切酶，使θ型复制中的病毒DNA分离形成子代闭环DNA分子噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第28页!chi位点的引入

red和gam基因缺失(red-和gam-)的λ噬菌体在P2溶源菌或野生型大肠杆菌中生长较差，形成的噬斑很少，然而当在λDNA中引人chi位点后，Spi-噬菌体在宿主菌中的繁殖力便会随之增强，噬斑变大。chi位点（交换热点激活区）由一段长度为八核苷酸的DNA序列组成，其序列为5’GCTGGTCG3’。野生型λDNA中并无此序列，但在大肠杆菌染色体DNA和真核基因组中都存在有chi序列，大肠杆菌DNA平均每5000bp出现一次chi序列。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第29页!四、体外包装1、λ重组体DNA分子的转染作用λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染（转导）的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。因为以感染方式导入细胞的频率可达106~108/μgDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103~104/μgDNA。

噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第30页!2、λ重组体DNA的体外包装在A蛋白（有终止复制功能），E蛋白（是包装蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组体DNA转入头部。主要外壳蛋白是基因E的产物基因A的产物在cos位点切割后进入头部包含在外壳中基因D的产物基因W和FⅡ的产物组装成完整的尾部噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第31页!使用具有cⅠ857突变基因的λ噬菌体的溶源大肠杆菌：BHB2690（Dam）和BHB2685（Eam）菌株培养获得头部和尾部cⅠ857是温度敏感性阻遏基因，32℃为溶源状态，44～45℃诱发，溶菌的S基因突变，因而不会溶菌。大量收集头部尾部蛋白，在体外与重组λDNA包装噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第32页!计算包装范围（KB）48×75%＝3648×105%＝51必需基因为28包装范围8kb～23kb《分子克隆试验指南》78%～105%，包装范围在10～23kb噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第33页!由于λ噬菌体头部组装时容纳DNA的量是固定的，因此插入外源DNA长度必须控制在使重组DNA为野生型λDNA长度的75%~105%之间，否则难以正常组装。③具有较高的感染效率，其感染宿主细胞的效率几乎可达100%，而质粒DNA的转化率却只0.1%。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第34页!第三节柯斯质粒载体（Cosmidvector）1978年，J.collins和B.Hohn等人发展出的一种人工载体

带有cos位点的质粒载体

4-6kb，带有选择标记，在构建cDNA文库中很有用。可携带大的外源DNA片段，克隆45kb基因。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第35页!cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第36页!二、柯斯质粒载体的特点1、具有λ噬菌体的特性；插入合适长度外源基因后，可以在体外被包装成噬菌体，可以高效的感染大肠杆菌，进入细胞后环化，并且不形成子代噬菌体噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第37页!3、具有较高容量的克隆能力；分子量较小，一般4-6kb，因此插入的载体上并且可以被成功包装的外源可以达到45kb最低极限，如果柯斯质粒有5kb，外源必需要至少30kb4、具有与同源性序列的质粒进行重组的能力在同一个宿主中的柯斯质粒和质粒会形成共合体。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第38页!三、柯斯克隆柯斯克隆（cosmindcloning）：在大肠杆菌中克隆大片段的真核基因组DNA的技术依据原理:λ噬菌体在生命周期可以产生数百个由cos位点连接的多连体分子噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第39页!DigestionLigationC)PackagingandinfectFormationofacosmidclone噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第40页!四、柯斯克隆的改良优点：1、兼具质粒和噬菌体的特性，提高了克隆容量，对于构建真核生物基因文库十分有用；2、形成的非重组体克隆本底比较低噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第41页!②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第42页!1、Ish－Horowicz－Burke柯斯克隆方案pJB8是由高拷贝的质粒pAT153派生而来，能够克隆大片段的外源DNA，适合于真核基因文库构建特点：在BamHⅠ两端各有一个EcoRⅠ噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第43页!2、Bates－Swift柯斯克隆方案c2XB具有两个cos位点，一个BamH和SmaⅠ切点c2XB6.8kbcoscosBamHⅠSmaⅠSmaⅠBamHⅠcoscosSmaⅠ平末端BamHⅠBamHⅠSmaⅠ平末端真核基因组Sau3AI局部消化磷酸酶OHOH32～47kb噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第44页!第四节单链DNA噬菌体载体单链DNA噬菌体载体M13、f1、fd优越性：1、单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式的DNA简称RFDNA；2、不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌；噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第45页!一、M13噬菌体生物学特性M13是一种含单链（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种单链ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第46页!10个基因，90％以上都编码蛋白质仅有2个基因间隔区间隔区基因Ⅷ——噬菌体颗粒的主要结构蛋白基因Ⅲ——噬菌体颗粒的次要结构蛋白基因Ⅱ——在RFDNA上形成切口

基因Ⅴ作用——单链DNA结合蛋白噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第47页!3、进行θ复制后，在基因Ⅱ的作用下，在RFDNA正链的特定位点上作切割反应4、利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，M13（－）为模板合成正链5、基因Ⅱ切割出完整的M13（＋）6、环化返回噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第48页!形态建成：

基因Ⅴ蛋白－DNA（正链）复合物移动至细菌的细胞膜的同时，基因Ⅴ蛋白脱落，病毒基因组从细菌溢出时被衣壳蛋白包裹噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第49页!proAB：细菌脯氨酸合成酶编码区，proAB常出现在F’附加体上，可以弥补宿主的基因缺失，以确保F’在宿主体内稳定traD36：抑制F’接合转移△（lac－proAB）：缺失乳糖操纵子及比邻的脯氨酸生物合成酶类的编码基因，这类寄主不能利用乳糖，生长必需脯氨酸噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第50页!M13克隆载体分子结构图噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第51页!3、对克隆基因的调节控制——lacIqlacI基因的突变体，可使lac操纵子阻遏物的合成量增加到野生型的10倍，合成大量的阻遏物阻止M13载体表达。加入诱导物IPTG，可以诱导合成Xgal显色底物噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第52页!返回噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第53页!返回噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第54页!M13mp18MCSM13mp19MCSEcoRIBamHIHindIIIPstIBglIBglIPstIHindIIIBamHIEcoRI

BP

PBBP

BPPBBamHI&PstI噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第55页!非展示系统展示系统噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第56页!LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII基因型表达型噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第57页!biotin

antigenSolutionphaseselectionwithbiotinylatedantigen噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第58页!Washtoremoveunboundphageparticles.噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第59页!AmplifyelutedphageRepeatselectionAnalyze a)ELISA b)Specificity c)Sequencing d)Affinity e)ActivityE.coli感染和扩增二、噬菌体抗体库展示技术back噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第60页!噬菌粒的特点比M13小，约为3000bp，易于体外操作，可以克隆10kb外源两种复制方式可以得到直接用于测序的单链结构，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第61页!二、噬菌粒载体pUC118和pUC119

在pUC18和19的NdeⅠ位点上插入来源于M13的IG区，长度476bp，含有M13的复制起点噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第62页!在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA；噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第63页!三、辅助噬菌体M13KO7辅助噬菌体（一）结构M13的衍生株，大小为8.7kb来自p15A质粒的复制起点，因此可以象质粒一样复制，且可以与带ColE1的质粒共存于同一个宿主菌中。来自转座子Tn903的卡那霉素抗性基因（kanr）基因Ⅱ带有一个G至T的突变（第6125核苷酸），40位氨基酸由甲硫氨酸变为异亮氨酸。

噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第64页!当M13K07感染带有噬菌粒的大肠杆菌后，如E.coli（pUC118），进入宿主细胞内的单链DNA，在宿主胞内酶的作用下转变为双链形式，后者可在质粒p15A的复制起点控制下进行复制。细胞内M13K07双链DNA的积累并不需要病毒基因产物，细胞内的噬菌粒几乎没有机会干扰所进入的M13K07病毒基因组的早期复制。（二）作用噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第65页!三、pBluescript噬菌粒载体（一）基本结构

1、在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动；

2、同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的DNA；噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第66页!T7T3用于体外转录总结噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第67页!可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭环境化学物质的破坏；2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞；3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而生长出大量的子代噬菌体颗粒；4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第68页!噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第69页!二、噬菌体的感染性噬菌斑形成噬菌体感染高浓度细菌在未发生次裂解前涂布平板噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第70页!噬菌体的感染过程尾部粘至细胞壁尾部蛋白质收缩核酸注入细菌利用细菌的RNA聚合酶和核糖体翻译得到噬菌体蛋白使细菌的DNA降解合成自身的DNA至数百个拷贝合成头部尾部蛋白进行组装噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第71页!四、噬菌体的溶源生命周期溶源生长周期：是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第72页!整合：噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体DNA中原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第73页!噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第74页!3、超感染免疫性（1）溶源细菌的两个重要特点：不能被头一次感染的噬菌体再次感染，称为超感染免疫性；经过许多世代以后，溶源性细菌可以进入溶菌周期，称为溶源性诱发。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第75页!②溶源噬菌体的诱发依赖于阻遏基因与操纵基因的相互作用。阻遏物被一种蛋白酶切割，失活，使噬菌体转录。需要删除酶将噬菌体的DNA从大肠杆菌染色体上删除下来，使之形成环形的DNA分子，恢复溶源周期开始时的状态。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第76页!五、重组噬菌体的分离大肠杆菌培养至对数生长期•加入λ噬菌体悬浮液，37℃培养1小时•用新鲜培养稀释，继续培养4-12小时•高速离心，沉淀噬菌体•苯酚抽提，释放λ-DNA•乙醇或异丙醇沉淀DNA。back噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第77页!λ噬菌体分子量31×106dal，中等大小的温和噬菌体，目前已经定位61个基因，其中一半参与了生命周期，为必要基因；余下的为非必要基因。溶菌阶段(复制和释放)

溶源阶段

(整合寄主染色体)噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第78页!噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第79页!

5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephagecosendsCircularformLinearform噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第80页!COSAWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSR

attintxis

gamredcIIIN

COS头部基因尾部基因功能不明区溶源化重组早期控制阻遏DNA合成溶菌生长非必要区段cI基因：溶源过程控制基因λ噬菌体的基因组结构噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第81页!早期蛋白不表达，晚期蛋白表达噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第82页!DNAProteincoatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bp噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第83页!（一）插入式载体λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。1、cI基因插入失活如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶源化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第84页!LacZ基因插入失活：如charon16A，λgt11载体，在非必需区段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRⅠ位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。

lacZLA19.9RA21.9EcoRIcharon16A噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第85页!（二）λ替换型载体（取代型载体）外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段(~20kb)高感染效率(109

转化株/ug载体DNA，比质粒高100-倍)替换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。eg:

EMBL3,DASH噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第86页!λEMBL3/4、Charon40噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第87页!在λNM781替换型载体中，可取代的EcoRⅠ片段，编码有一个supE基因（大肠杆菌突变体tRNA基因），这种λNM781噬菌体感染细胞后，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变被抑制，因此能在X-gal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。如果这个具有supE基因的EcoRⅠ片段被外源DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述指示培养基上只能产生出无色的噬菌斑。λNM781噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第88页!λ取代载体2、组装连接3、侵染噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第89页!（左右臂连接）（三段自身连接）（插入片段）噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第90页!1、Spi-正选择的λ噬菌体载体λ1059、λL47.1Spi-重组体的筛选野生型λ噬菌体不能在携带有P2原噬菌体的溶源菌中生长，λ的这种表型称为Spi+(对P2的干扰敏感)但是当λ基因组中缺少参与重组的两个基因red和gam时，λ突变体可以在P2溶原菌中生长，其表型称为Spi-。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第91页!recA＋的P2溶源菌噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第92页!recA＋的P2溶原菌red-gam-：利用大肠杆菌的重组酶（recA＋），通过单体λDNA间的重组作用，产生出成熟的多联体λDNA以进行包装，大肠杆菌的重组系统依赖于recA基因。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第93页!chi位点：与重组事件有关联的DNA序列，激活以rec为媒介的交换反应，是recB、C系统催化重组作用的底物。但RecB、C重组酶的活性可被基因gam的产物所抑制。因此对于red-、gam-突变体或因外源DNA的插入而呈Spi-表型的重组体而言，chi位点的引人会使噬菌体生长繁殖力变强，噬斑增大。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第94页!体外包装：把重组体DNA分子包装成成熟的噬菌体颗粒，从而能够按照正常的噬菌体感染过程导入宿主细胞，可以提高转染效率，可达107左右。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第95页!λ重组体DNA的体外包装：在体外试管中完成上述反应，利用D基因突变和E基因突变。E基因琥珀突变（Eam）不能形成任何头部，积累大量的尾部D基因琥珀突变（Dam），λ重组体DNA不能进入头部，成熟作用在头部前体阶段被终止，因而它感染的宿主中有大量头部前体蛋白积累。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第96页!由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48KB）的75%～105%左右的ＤＮＡ，要求λ载体DNA和外源DNA长度上限是51kb，必需基因为28kb，外源极限在23kb。3、λ噬菌体的包装限制噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第97页!λ噬菌体克隆载体是基因工程中一类很有价值的克隆载体，具有很多优点：①其分子遗传学背景十分清楚；②载体容量较大，一般质粒载体只能容纳10多个kb，而λ噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片段；噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第98页!back噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第99页!一、柯斯质粒载体的构建cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第100页!柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体λ的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb，克隆能力为31～45kb，能够被包装成具有感染性能的噬菌体噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第101页!2、具有质粒载体的特性；含有质粒复制子，进入寄主后可以象质粒一样复制，抗菌素抗性标记可以进行筛选噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第102页!噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第103页!末端酶（Ter体系）：能识别两个相距适宜的cos位点，将多联体切割成单位长度的片段，并包装至头部，作用有效范围，两个cos之间相距38～54kb。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第104页!噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第105页!采用柯斯质粒作载体的困难①载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第106页!③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第107页!cosBamHⅠHindⅢpJB8SalⅠHindⅢ、磷酸酶SalⅠ、磷酸酶cosOHOHSalⅠBamHⅠBamHⅠcosOHOHSalⅠppcosOHOHBamHⅠBamHⅠcosOHOHppHindⅢ真核基因组Sau3AI局部消化磷酸酶OHOH32～47kb噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第108页!3、其他柯斯克隆方案（1）在多克隆位点两侧引入T3和T7噬菌体的RNA聚合酶启动子（图5-23）（2）构建与大肠杆菌质粒没有同源性序列的克斯载体，避免重组（3）导入真核生物的选择性标记，做为穿梭载体噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第109页!3、单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多寡制约的，不存在包装限制问题；4、容易测定外源DNA片断的插入取向；5、可产生含外源片断的单链DNA分子。噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第110页!感染方式M13噬菌体是大肠杆菌特有的噬菌体，只能感染带有F性须的菌株通过人工方式可以转染雌性的大肠杆菌噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第111页!RFDNA复制方式：1、M13正链在基因Ⅲ编码的蛋白作用下进入大肠杆菌细胞，合成出M13（－）链，双链DNA为复制型（RFDNA）2、开始θ型复制噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第112页!PhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolI±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第113页!二、M13噬菌体载体的寄主菌由于M13噬菌体通过F因子编码的菌毛进入宿主细胞，故只能用雄性细菌来增殖病毒。lacZ△M15：缺失lacZ基因中β-半乳糖苷酶的N端部分编码序列，很多宿主菌的F’附加体带有这种缺失的lacZ基因。lacIq：lacI基因的突变体，可使lac操纵子阻遏物的合成量增加到野生型的10倍，很多宿主菌的F’附加体带有这种lacIq和lacZ△M15基因。JM101：△（lac－proAB）

F’traD36

proAB＋

lacIqlacZ△M15噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第114页!1、M13载体系列的发展IGIG区段：位于基因Ⅱ和基因Ⅳ之间，长度507核苷酸

M13mpn：由M13mp1衍生而来三、M13克隆体系噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第115页!2、α互补作用M13载体：编码β-半乳糖苷酶的N端，来源于β-半乳糖苷酶基因的HindⅡ酶切片段F’附加体：含有lacZ△M15基因，缺失了编码β-半乳糖苷酶中第11-41个氨基酸的lacZ基因，不能形成四聚体。蓝白筛选噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第116页!Blue-whiteselection噬菌体载体和柯斯载体共132页，您现在浏览的是第117页!四、M13载体系列的优点1、在这类载体的基因组中有一条饰变的β-半乳糖苷酶基因片段（HindⅡ片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列；2、M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。