基因工程动物细胞培养制药工艺oweroin演示

第四讲基因工程动物细胞培养制药工艺

药用蛋白质的合成复杂，要有精确折叠的空间结构，要有糖基化，才能使药物发挥真正的功能。细菌和酵母等产品要么是包涵体，要么难以糖基化功能修饰。动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋白质，大规模动物细胞特别是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要。人畜病毒疫苗:口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓灰质炎、乙肝疫苗。干扰素、单克隆抗体、重组基因工程产品。组织型血纤蛋白溶酶原激活剂、免疫珠蛋白G、M、尿激酶、人生长因子等。第一节动物细胞制药的表达系统与特征

昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、重要表达活性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。

一、哺乳动物细胞表达系统与特征1.动物细胞的特征细胞膜、细胞质和细胞核没有细胞壁。亚细胞器，功能独特。2.动物细胞代谢动物细胞的不同代谢途径及其相应的酶体系定位于特定的亚细胞区域。通过胞内运输（囊泡包裹）实现区域之间的物质、信息和能量流动，通过穿梭实现不同代谢途径之间的交换。在动物细胞培养中，葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作为合成代谢的前体，因此动物细胞的培养具有一定的灵活性。葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以补偿，反之亦然。谷氨酰胺是动物细胞的氮源，谷氨酰胺受限时，可增加其他氨基酸的消耗得以补偿。糖代谢特点：动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分解为丙酮酸，进一步被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。丙酮酸还可转化为乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，彻底氧化产生CO2和水。小部分（4％～8％）葡萄糖进入戊糖磷酸途径，把葡萄糖转化为4、5、7碳糖和还原力NADPH，5碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，会产生大量的乳酸，对细胞产生毒性。

氨基酸代谢特点：吸收谷氨酰胺后，进入氨基酸代谢途径，通过脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨，对细胞产生毒性。小部分谷氨酰胺通过转氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代谢的前体。谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物α-酮戊二酸，进入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰胺在细胞能量代谢中具有重要作用。谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培养液并积累。在快速生长的动物细胞培养体系，转氨作用是主要的代谢途径。

不同的培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸。在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸来源于谷氨酰胺。在连续细胞系中，没有这种流动。能量是以ATP和NADPH的形式提供，来源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二种细胞系对各个代谢途径的贡献和所起的作用不同。常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒废物积累。

3.蛋白质糖基化蛋白质合成是以mRNA为模板，在核糖体上完成。而蛋白质的糖基化无需模板指导，因此糖蛋白的寡糖结构容易发生变化。糖蛋白的单糖单元:α-D-葡萄糖、α-D-半乳糖、α-D-甘露糖、α-D-木糖、α-D-岩藻糖、N-乙酰-α-D-葡萄糖胺、N-乙酰-α-D-半乳糖胺和α-N-乙酰神经氨酸（或唾液酸）。糖基化类型：寡糖基以共价键与蛋白质的氮原子结合为N-糖基化，或与氧原子结合为O-糖基化。这两种糖基化的位点和数量及糖的种类都不同。N-糖基化：聚糖部分连接在天门冬酰胺的氨基上，其模体的保守序列为Asn-X-Thr/Ser(X为除脯氨酸以外的任意氨基酸)。如果X为Trp、Asp、Glu和Leu，对糖基化有负影响，而第三位Thr能增强糖基化。N-糖基化分为高甘露糖型、复合型和杂合型三种类型，共同核心是3个甘露糖和2个N-乙酰葡萄糖胺组成的5糖（Man3GluNAc2），其他糖形成支链。高甘露糖型的支链为甘露聚糖（5～9聚体），无其他糖。复合型含有2个以上支链，如乙酰半乳糖胺、果糖和唾液酸等。杂合型至少含有一条复合糖链，另一个链含有甘露糖。O-聚糖连接在Thr/Ser的羟基上，还没有发现保守序列。O-聚糖有四种不同的核心结构，都含有N-乙酰半乳糖胺基，糖基化会影响蛋白质的局部构象。O-糖基化比较小，一般为1～6个寡聚糖，但比N-糖基化变化更大。O-糖基化只在高尔基体上进行，糖基单元有木糖、葡萄糖。糖基化磷脂酰肌醇锚着点：它在膜与蛋白质之间形成稳定的相互作用，都具有相同的核心结构：胆胺-PO4-Man2-GlcHN2-肌醇-PO4-脂。胆胺形成膜内蛋白的桥，而肌醇在膜内。在细胞培养生产重组蛋白时，磷脂酶C可切割此类蛋白，有利于纯化。细胞特异性糖糖基化途径———淋巴细胞胞中进行，它它不依赖于内内质网和高尔尔基体。IgG的糖基基化，等分GlcNAc残基连接在在核心甘露糖糖上，该糖基基化在抗体依依赖性细胞介介导的细胞毒毒性中起重要要作用。IgG蛋白的的铰链区，富富含Ser、、Thr和Pro，5个个Ser全部部糖基化。促黄体激素、、促甲状腺素素等的硫酸化化只能在垂体体中发生。尽管哺乳动物物细胞具有细细胞内的糖基基化装置，但但不同细胞系系，糖基化特特征不同。鼠和猪细胞倾倾向于添加乙乙酰果糖而不不是乙酰唾液液酸，在鼠杂杂交瘤或人鼠鼠杂交瘤生产产的抗体中，，乙酰果糖占占优势。CHO细胞不能合成成等分N-乙酰葡萄糖胺胺，而鼠细胞胞系却能形成成半乳糖末端端，对人有免免疫原性。要根据糖基化化的结构，选选择适宜的细细胞系。细胞系FucGal唾液酸α1,6α1,3Fucα1,3GalSO4-GalNAcα2,3

α2,6糖基化等分GluNAcBHK++0+0++0-0CHO++-00++0+0鼠杂交瘤++0++0++0+++0C127++0+++++++++++0J558L++0++-+++++++0人淋巴细胞++000++0++人垂体++00+++++0++Namalwa++000++++--人鼠杂交瘤++000+++02.哺乳动动物细胞表达达系统基因工程哺乳乳动物细胞系系：失去分化化能力的无限限生长细胞系系，即永久性性细胞。表达达的蛋白质能能正确加工、、修饰并折叠叠形成具有生生物活性的功功能分子，接接近或类似天天然产物。糖基化等修饰饰是糖蛋白行行使功能所必必需的，而且且对产品质量量有影响，如如生物活性、、稳定性、免免疫原性等。。原核细胞表表达的EPO无糖基化，，在体内表现现无活性。原原核表达的GM－CSF虽有活性，，但在体内产产生抗体。动物细胞表达达产物分泌到到培养液，容容易分离纯化化。约有70％批准的蛋蛋白质药物由由哺乳动物细细胞系统表达达制造，而且且数目还在不不断增加。表达系统O-糖基化寡聚甘露糖高甘露糖复合体大肠杆菌0000酿酒酵母＋＋0＋＋＋＋－昆虫Sf9＋＋＋＋＋＋0－仓鼠CHO＋＋＋＋0＋＋仓鼠BHK＋＋＋＋0＋＋鼠杂交瘤＋＋＋＋0＋＋鼠骨髓瘤＋＋＋＋0＋＋C127＋＋＋＋0＋＋J558L＋＋－0＋＋人淋巴细胞＋＋00＋Namalwa＋＋＋＋0＋＋人鼠杂交瘤－＋＋0＋＋

大肠杆菌酵母哺乳动物细胞产物浓度高高低分子量低高高二硫键有限不受限制不受限制分泌无有或无有形式包涵体单链，天然单链，天然折叠不正确正确正确糖基化无可能完全逆转录病毒无无可能热原可能无无培养特点容易容易较难，成本高分离纯化复杂复杂简单细胞类型表达水平（μg/ml）猴CV11～10猴CV10.05猴COS1小鼠成纤维细胞C1271～5小鼠成纤维细胞3T30.1～0.5CHO（dhfr－）0.01~0.05CHO（dhfr－）10动物细胞表达达系统的不足足是细胞生长长缓慢，生产产效率较低，，产量远远落落后于其他表表达系统。骨髓细胞MPG－11生生产IgG的的能力为5pg/(细胞胞.分钟)，，10L反应应器，密度为为107/ml，生产能能力不到1g/d。连续细胞系增增加了生长和和代谢速率，，但同时导致致了副产物的的增加。动物细胞对培培养条件要求求苛刻和敏感感，对温度、、pH、渗透透压、剪切力力等忍受能力力差。培养基基要求高，需需要添加氨基基酸、维生素素等，往往需需要附加血清清，提供生长长因子，费用用较高。同时时可能有潜在在的致病因子子、免疫原性性存在。表达载体的改改进和宿主细细胞的改造是是动物细胞表表达系统的研研发重要内容容。3.昆虫细细胞表达系统统与特征表达载体为昆昆虫病毒，转转染昆虫细胞胞，表达出目目标蛋白质。。昆虫病毒主主要有杆状病病毒科核多角角体病毒。苜蓿尺蠖核多多角体病毒－－秋黏虫细胞胞表达系统，，家蚕核多角角体病毒－家家蚕幼虫表达达系统。Micro－－GeneSys公司司表达艾滋病病基因工程疫疫苗，随后猪猪生长素、CD4膜蛋白白及疟疾疫苗苗、鸡新城病病毒疫苗、血血吸虫GST疫苗、乙肝肝表面抗原、、重组人GM－CSF等等。日本批准准用家蚕系统统生产干扰素素已上市。生生物试剂盒的的标准品大多多用昆虫表达达系统生产。。至少有600多种昆虫可可以作为宿主主，每年有数数百个基因利利用昆虫系统统进行表达，，越来越成为为非常有用的的表达宿主。。优点1）安全：杆杆状病毒无致致病性，产品品安全性受FDA认可。。2）易饲养：：家蚕丧失了了野外生存能能力，饲养，，发育快，3）高量表达达：用强启动动子，外源基基因可超量表表达。表达产产物在昆虫细细胞内能结晶晶，对产物纯纯化非常有意意义。4）高效表达达：可容纳较较大的外源基基因（12kb），表达达数个外源基基因，并且正正确装配成有有功能的分子子。如表达抗抗体的重链和和轻链，自主主装配成有功功能的抗体。。5）翻译后的的加工：昆虫虫细胞能进行行一系列翻译译后的加工，，包括糖基化化、脂肪酸酰酰基化、磷酸酸化、氨基酸酸的乙酰化、、氨酰化等，，大部分产物物显示出良好好的活性。缺点：1）重组率低，，筛选困难，，周期长，需需要4－10天。2）外源基因的的表达在转染染的晚期，大大约在20h后起始基因表表达，在72－94h细胞裂解死亡亡，基因表达达时间约30－50h，高水平表达达不连续且时时间短，这对对表达不利。。3）昆虫细胞糖糖基化等加工工途径与哺乳乳动物细胞不不完全相同，，它不提供复复杂的N糖基化，如添添加半乳糖和和唾液酸残基基，有可能造造成溶解性、、稳定性、免免疫性等变化化。表达水平平非常高，加加工装备跟不不上，蛋白质质修饰效率可可能不高。研究开发的主主要方向：有有效的病毒表表达载体；决定基因表达达时期启动子子，无血清培培养昆虫细胞胞系。第二节基因因工程动物细细胞系的构建建构建高效表达达载体转染动物细胞胞筛选鉴定获得生产用工工程化细胞系系动物细胞的表表达载体：病病毒载体，质质粒载体。病毒载体：逆转录病毒、、腺病毒、痘痘苗病毒、杆杆状病毒等载载体，对原始始病毒改造而而来。同源重组构建建腺病毒载体体，在静止期期转染细胞，，表达时间较较长。痘病毒载体可可插入25～40kb外源基因，甚甚至是多个基基因。无感染染性和致癌性性，可用于构构建基因工程程疫苗。美国Genentech公司已用SV40载体生产乙肝肝疫苗，其他他载体可用于于基因治疗。。质粒载体：微生物的质粒粒载体类似，，一般是穿梭梭质粒，具有有两个复制子子和抗性筛选选标记基因。。大肠杆菌的复复制子，细菌菌中繁殖。抗生素抗性标标记，原核细细胞筛选。动物细胞的复复制子，在宿主细胞中中稳定表达。。还有丝状噬菌菌体复制子。。启动子序列：：含有RNA聚合酶识别别和结合位点点，以便有效效转录。TATA盒，确确定起始位置置；GG盒，，影响转录频频率。来源于病毒、、动物基因和和噬菌体的启启动子。动物病毒启动动子：逆转录录病毒的长末末端重复序列列（LTRS）、SV40病毒的早早期和晚期启启动子、腺病病毒的晚期启启动子、人巨巨噬病毒（CMV）立即即早期基因启启动子。动物基因的启启动子：转录录因子EF-1α启动子子、泛素蛋白白启动子、ββ-肌动蛋白白启动子、干干扰素-α启启动子、IgG启动子、、鼠金属硫蛋蛋白基因启动动子等。噬菌体T7启启动子比动物物基因启动子子表达水平高高。PolyA信信号序列：保保持mRNA的稳定性，，防止降解，，保证了转录录产物的加工工和正确性，，但序列不宜宜太长，避免免能量过度消消耗。添加PolyA信信号和5′端端转录暂停位位点，可以减减少上游序列列转录通读造造成的背景。。牛生长素（BGH）基因因的PolyA信号比SV40PolyA更更强，常用于于高效表达载载体中。终止序列：AAUAAA或连续的终终止密码UGA、UAA和UAG，，能防止转录录通读，使转转录在正确的的位点结束。。在转录起始点点上游或下游游使用相同类类型的增强子子，有利于提提高外源基因因的转录水平平。双顺反子表达达载体：两个基因在同同一启动子控控制之下，内内部核糖体进进入位点使同同一mRNA中的第二个基基因得到翻译译。将dhfr与目标基因串串连，dhfr的cDNA插入内含子中中，其转录产产物被剪切，，翻译不出蛋蛋白质，而目目标基因的转转录产物得到到翻译。顺反子在多亚亚基蛋白的偶偶联表达及其其控制策略等等方面有广泛泛应用前景。。使筛选容易，，而且能高效效表达。选择适宜的启启动子，可实实现定向表达达。CMV启动子子和人EF-1α启动子子，可实现同同一载体上的的二个基因的的独立表达。。组织特异性启启动子：如鼠鼠、山羊酪蛋蛋白启动子，，可使基因主主要在乳腺中中表达。N端设计分泌泌信号肽：如如Igκ链链的可变区和和恒定区之间间序列，使外外源基因的表表达产物向胞胞外分泌。C端设计跨膜膜锚定序列：：可使外源蛋蛋白展示在细细胞表面。亚细胞定位信信号肽：目标标基因产物将将转运到细胞胞核、线粒体体、内质网或或细胞质中，，这对基因的的功能研究非非常合适。基因的扩增系系统：在逐渐提高选选择压的情况况下，使选择择标记基因拷拷贝数增加，，并可连带其其两侧序列一一起扩增，从从而提高表达达基因水平。。最常用二氢叶叶酸二氢叶酸酸还原酶（DHFR）基因系统和和谷氨酰氨合合成酶（GS）基因系统。。氨甲喋呤基因因与目标基因因重组，氨甲甲喋呤使dhfr基因与目标基基因大量增加加，达到数千千拷贝。硫胺蛋氨酸使使GS系统的基因得得到大量扩增增。二、受体细胞胞1．人源细胞胞株系Namalwa：类淋巴巴母细胞，非非整体核型。。表达IgM，悬浮生长长。外源基因因的表达水平平较高，可用用无血清培养养基高密度培培养，已成功功地表达了rhEPO、、rhG-CSF、tPA等。英国国Wellcome公司司用Namalwa细胞胞的反应器达达8000L，用Sendai病毒毒诱导，大规规模生产α干干扰素，并批批准上市。WI-38：：二倍体成纤纤维细胞系，，2n=46，第一个被被用于制备疫疫苗。贴壁生生长，对很多多病毒敏感，，广泛用于疫疫苗生产。MRC-5：：二倍体成纤纤维细胞系，，但生长较WI-38快快，对逆境有有一定抗性也也用于制备疫疫苗。2．哺乳动物物细胞株系CHO细胞：：中国仓鼠卵卵巢中分离的的上皮样细胞胞系，贴壁型型生长，是目目前使用最为为普遍和成熟熟的表达糖基基化蛋白药物物的宿主细胞胞。核型为亚亚二倍体，分分泌表达外源源蛋白，而内内源蛋白分泌泌很少。贴壁壁型生长细胞胞，但可进行行悬浮培养，，对剪切力和和渗透压有较较高的忍受能能力。蛋白质质翻译后的修修饰准确，表表达产物的结结构、性质和和生物活性接接近天然。有多种衍生突突变株应用于于药物的生产产，培养时需需要添加脯氨氨酸。二氢叶叶酸还原酶缺缺陷株表达的的药物有tPA、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、、凝血因子ⅧⅧ、DNA酶酶Ⅰ，已上市市。使用氨甲酰喋喋呤，增加外外源基因的拷拷贝数，提高高蛋白质表达达水平。BHK－21：幼仓鼠肾肾脏中分离的的成纤维样细细胞，非整倍倍体。用于增增殖病毒、制制备疫苗和重重组蛋白。BHK-21表达的重组组凝血因子ⅧⅧ已被获准上上市。C127：从从小鼠乳腺肿肿瘤中分离获获得的上皮样样细胞，贴壁壁型生长。C127细胞胞系已表达多多种外源基因因，其中EPO的水平达达10mg/L，生产产rhGH已已被批准上市市。3T3：HINSwiss小鼠胚胎培养养物中分离建建立的连续细细胞系，能大大量表达外源源蛋白，广泛泛用于药物毒毒理学研究。。骨髓瘤细胞胞：J558L是小鼠BALB/c骨髓瘤细胞胞，分泌IgA，用于转染染研究。NSO和SP2/O－Ag14不分泌Ig，与淋巴细细胞融合筛筛选杂交瘤瘤，分泌制制备特异性性抗体。杂交瘤细胞胞：从小鼠鼠脾细胞与与骨髓瘤细细胞的融合合细胞中分分离获得杂杂交瘤细胞胞系，能在在无血清培培养基中高高密度悬浮浮生长，容容易转染和和生长，能能进行糖基基化等加工工修饰，大大量分泌和和高效表达达。很多杂杂交瘤细胞胞系用于抗抗体的制备备。Vero：：从成年非非洲绿猴肾肾中分离获获得的贴壁壁型成纤维维细胞，多多倍体核型型，能适应应灌流操作作，进行连连续培养。。已有突变变细胞系能能用无血清清培养。最最为常用VeroE6增殖殖多种病毒毒，如脊髓髓灰质炎、、狂犬病毒毒、乙脑病病毒等，生生产病毒性性疫苗，已已被批准用用于人体。。也可作为为转染的宿宿主细胞，，用于表达达外源基因因的蛋白质质药物和病病毒的检测测。COS：是从SV40DNA转化的非洲洲绿猴肾细细胞CV1中分离得到到的，广泛泛用于外源源基因瞬时时表达的研研究。GH3用于于生长激素素研究，293细胞胞系用于基基因治疗的的研究。3．昆虫细细胞株系Sf21：：从秋粘虫虫卵巢细胞胞中分离得得到，细胞胞较大，容容易放大，，高效表达达外源基因因。Sf9：从从秋粘虫的的卵巢细胞胞（SF21）中分分离得到，，是最常用用的昆虫表表达细胞。。对杆状病病毒高度敏敏感，生长长快，能高高效表达外外源基因。。抗机械剪剪切，能在在无血清培培养基的搅搅拌反应器器中生长。。TN-5B1-4：：从粉纹夜夜蛾卵细胞胞匀浆中分分离得到，，无血清培培养，快速速倍增。分分泌表达重重组蛋白的的能力比Sf9细胞胞系高20多倍，能能适应悬浮浮培养。三、细胞转转染转染（是将将外源基因因导入哺乳乳动物细胞胞的技术通通用名称。。基因导入入真核细胞胞的方法很很多，主要要有化学转转染、物理理转染和病病毒介导的的转化。方法表达类型毒性细胞类型特点基因枪瞬时，稳定无多种细胞组织，器官有效，仪器操作显微注射瞬时，稳定无多种细胞有效，技术难度大电穿孔瞬时，稳定无多种细胞有效，仪器操作冲击波瞬时，稳定无多种细胞，局部组织简单有效，仪器操作方法表达类型毒性细胞类型特点逆转录病毒瞬时，稳定无对应的宿主细胞有效原生质体融合瞬时，稳定无悬浮细胞技术复杂生物转染特特点化学转染是是最常用的的转染方法法。其基本原理理是磷酸钙钙、二乙氨氨乙基（DEAE）－葡聚糖糖（dextran）和阳离子子树脂与核核酸形成复复合物，附附着于细胞胞表面，通通过细胞的的内吞作用用进入细胞胞。磷酸钙与DNA形成不溶性性沉淀，带带正电荷的的DEAE－葡聚糖与与带负电荷荷的DNA磷酸基团结结合，阳离离子树脂包包裹DNA形成脂质体体。渗透性休克克和DMSO等化学试剂剂能促进DNA进入细胞。。转染试剂剂盒商业化化供应，特特别是脂质质体材料的的转染试剂剂。影响因素：：细胞培养养物的密度度、DNA的大小、纯纯度与用量量、化学试试剂的用量量与处理时时间、促进进剂的使用用等。方法表达类型毒性细胞类型特点磷酸钙瞬时、稳定无贴壁细胞，悬浮细胞简单DEAE-葡聚糖瞬时有CV1，COS简单阳离子树脂瞬时、稳定有或无贴壁、原代悬浮细胞简单，有效化学转染的的特点四、转染体体筛选与分分离转染后1～～6天收获获细胞，进进行核酸分分子杂交或或蛋白质杂杂交，检测测外源基因因的瞬时表表达。为了获得稳稳定整合的的细胞系，，先在非选选择性培养养基上培养养24～48小时，，让细胞倍倍增1～2代，使转转染DNA表达。再再按1：15比例转转移到选择择性培养基基上，每2～4天更更换培养基基，持续2～3周，，促进抗性性细胞生长长，清除死死细胞残骸骸，最后得得到独立的的克隆。在转染中大大约有万分分之一的细细胞将稳定定整合外源源基因，因因此需要显显性选择标标记来分离离转染细胞胞。哺乳动物细细胞的选择择标记，使使用与之相相对应的选选择剂。选择剂基因使用浓度氨甲喋呤dhfr－0.01～300μmol/L氨喋呤tk＋0.4μmol/L5-溴脱氧尿苷tk－30μg/mlG418,Zeocinneo100～800μg/ml潮霉素Bhyg10～400μg/ml杀瘟稻菌素bsd2～10μg/ml霉酚酸gpt25μg/ml嘌呤霉素乙酰基转移酶0.5～10μg/mlXyl-Aada4μmol/L报告基因特点使用与分析方法cat内源活性低，蛋白稳定，线性范围窄，体外，荧光或免疫分析lacZ有内源活性，X-gal染色，线性范围宽体内外，染色，比色、化学发光或荧光分析碱性磷酸酶分泌型，线性范围宽，受到细胞类型限制体外，比色、化学发光或荧光分析gus蛋白质稳定，线性范围宽，X-Gluc染色体内外，染色，比色、化学发光或荧光分析gfp无内源活性，分子量小，稳定，无需底物，紫外线激发体内外，荧光分析第三节动动物细胞培培养的需求求与培养基基的制备动物细胞离离体后，失失去了消化化等系统，，不能利用用多糖、蛋蛋白质等聚聚合程度高高的化合物物。只能利用简简单的单体体化合物如如单糖、氨氨基酸等，，为了维持持细胞正常常生长，还还必须添加加维生素、、无机盐类类、生长类类因子及激激素、结合合蛋白质、、贴附与伸伸展因子及及其它附加加成分等。。动物细胞对对培养环境境的要求高高，不同细细胞系的要要求也不尽尽相同，培培养基要尽尽可能与体体内生活条条件接近。。一、动物细细胞培养的的营养需求求1.糖类糖类是细胞胞主要的营营养物质，，分解后释释放出能量量ATP。。培养基中都都必须添加加葡萄糖，，有时添加加核糖等。。提高细胞生生长的碳源源和能源，，主要是葡葡萄糖和谷谷氨酰胺。。2.氨基基酸氨基酸是蛋蛋白质和酶酶的组成单单位。氨基基酸还参与与合成一些些含氮化合合物，核苷苷酸的四种种嘌呤和嘧嘧啶碱基、、儿茶酚胺胺等含氮激激素及神经经递质等。。氨基酸可可通过生糖糖或生酮途途径转变为为糖或脂肪肪酸，间接接提供能量量。动物细胞：：8－10种必须氨氨基酸。离体容易失失去，20种氨基酸酸中至少12种是必必需氨基酸酸：精氨酸、半半胱氨酸、、组氨酸、、异亮氨酸酸、亮氨酸酸、赖氨酸酸、蛋氨酸酸、苯丙氨氨酸、苏氨氨酸、色氨氨酸、酪氨氨酸、缬氨氨酸等。谷氨酰胺还还可作为重重要的碳源源和能源而而被利用。。3.维生生素维生素是一一类微量的的小分子有有机生物活活性物质，，对代谢和和生长起调调节和控制制作用。水溶性维生生素包括B族维生素素和维生素素C。B族族维生素以以辅酶或辅辅基形式参参与酶反应应，主要调调节酶活性性和代谢活活性。维生生素C，抗抗坏血酸，，在体内参参与还原反反应、羟化化反应，促促进胶原蛋蛋白合成和和粘多糖合合成，抗氧氧化作用。。脂溶性维生生素包括维维生素A、、D、E、、K四种。。维生素A维维持正常视视觉和上皮皮组织。维维生素D为为视固醇类类化合物，，主要是调调节钙磷代代谢。维生生素E即生生育酚，是是抗氧化剂剂，防止生生物膜中磷磷脂的不饱饱和脂肪酸酸被氧化。。维生素K，促进合合成凝血酶酶原，促进进血液凝固固。5.无机机盐类无机盐是细细胞代谢所所需的酶的的辅基，同同时保持细细胞的渗透透压和缓冲冲pH的变变化。Na＋和Cl－参与生理电电活动，维维持水平衡衡、保持渗渗透压和酸酸碱平衡。。离体培养养为细胞提提供足够的的Na和Cl离子是是基本条件件，一般生生理盐水的的离子浓度度（0.9%NaCl）。。Ca2＋、Mg2＋，对细胞间间的互黏稳稳定起重要要作用。在在离体培养养时，螯合合细胞间的的Ca2＋和Mg2＋，可以达到到分散细胞胞的目的。。磷是核酸、、磷脂等的的组成成分分。碳酸盐缓冲冲液是重要要的体内缓缓冲体系，，与K＋、Cl－等在维持酸酸碱平衡具具有重要作作用。6.生长长类因子及及激素细胞之间是是相互联系系的，而非非孤立的。。特别是高高度分化功功能的动物物细胞更是是如此。细胞离体生生长时，必必要添加激激素与细胞胞生长因子子等。胰岛岛素是最常常用的激素素，促进糖糖原和脂肪肪酸的合成成，对细胞胞的生长有有刺激作用用。其它激激素有促卵卵泡激素、、甲状腺素素、乳激素素、生育酚酚等。细胞因子有有表皮生长长因子、成成纤维细胞胞生长因子子和神经细细胞生长因因子，根据据不同细胞胞添加。为了细胞的的贴壁生长长，必需添添加贴附因因子，纤维维结合蛋白白、胶原等等，伸展因因子如表皮皮生长因子子、成纤维维细胞因子子等。二、动物细细胞培养的的环境需求求1.水与与渗透压细胞生长离离不开水，，水是细胞胞反应的重重要介质。。1）水是是一种良好好的溶媒，，营养物质质在水中被被吸收，废废物在水中中被排泄。。2）具有有热稳定性性和导热性性，调节稳稳定温度。。正常血浆渗渗透压主要要是无机盐盐Na＋、K＋、Cl－、HCO3－等构成，蛋蛋白质构成成胶体渗透透压较小。。动物细胞对对渗透压有有较强的耐耐受性，常常用增减NaCl的的浓度调整整渗透压，，每增加1mg/mlNaCl，渗渗透压增加加32mOsm/kg。离体培养细细胞的渗透透压应控制制为等渗透透溶液。2.温度度不同种类的的动物细胞胞对温度的的要求是不不同的，变变温动物对对温度要求求没有恒温温动物严格格。哺乳动物细细胞最佳培培养温度为为37℃，鸡细胞胞为39－－40℃，，而昆虫类类细胞为25－28℃。在培养过程程中，根据据细胞种类类选择确定定适宜的培培养温度。。哺乳动物细细胞的耐受受温度范围围较窄，在在35-37℃内能正常常进行代谢谢和生长，，超出范围围会引起细细胞伤害甚甚至死亡。。细胞对低温温的耐受性性比高温要要强，低温温抑制生长长，但无伤伤害作用，，在冰点温温度附近仍仍能存活。。3.氧气气动物细胞生生长必须有有氧气，无无氧下，能能获得能量量供应，但但细胞缺氧氧时不能生生存。离体体培养的气气体含有5％CO2和95％空空气，其中中氧浓度为为21％。。有时充以以N2气稀释O2浓度。O2浓度在60%以上为为高氧环境境，对细胞胞毒性较大大。4.pH值动物细胞对对pH值很很敏感，低低于6.8或超过7.6会产产生严重影影响。机体体细胞的pH范围为为6－8，，血液和体体液中，变变化范围很很小。人血血液pH维维持7.36-7.44。pH低于7.05会会发生酸中中毒，高于于7.45发生碱中中毒。细胞胞代谢产生生CO2，使使培培养养液液变变酸酸，，pH发发生生波波动动。。合合成成培培养养基基偏偏酸酸性性，，为为了了稳稳定定pH，，可可用用缓缓冲冲体体系系配配制制。。在在开开放放体体系系中中，，CO2逸出，使培养养基变碱。通通入5％CO2，可维持在pH7.2-7.4范围围内。5.生长基基质改变生长表面面特性，促进进细胞贴附的的物质。贴附细胞生长长需要一个支支持介质，采采用在培养液液中添加或在在器皿表面覆覆盖生长基质质，帮助细胞胞的贴附和生生长。生长基质为胞胞外基质成分分，多聚赖氨氨酸、纤维连连接蛋白、胶胶原、层黏蛋蛋白、韧黏素素等。生长基质已有有商业化产品品，用PBS或BBS配成10倍贮存液液，在37℃下包被，静静置2－4小小时或室温过过夜，对器皿皿表面进行包包被，然后无无菌生理盐水水洗涤后使用用。有些还可可以直接加入入培养液。生长基质贮存液浓度使用浓度使用方法多聚赖氨酸0.5mg/L0.05mg/L表面包被纤维连接蛋白10mg/ml1mg/ml加入培养液层粘蛋白

5～10μg/ml表面包被韧粘素75μg/ml5～15μg/ml包被或加入培养液胶原蛋白1～3mg/ml0.1mg/ml表面包被6．抗生素动物细胞培养养过程中，由由于培养基营营养丰富，很很容易被微生生物污染。虽虽然对使用抗抗生素仍存在在质疑，但还还是常添加抗抗生素，以避避免轻度污染染。抗生素使用浓浓度差别很大大，一般范围围为50～100μg/ml。在在大规模生产产中，除了青青霉素和β-内酰胺类抗抗生素外，其其它抗生素可可以使用。抗生素使用对对细胞会产生生毒性，而且且使实验室保保留抗药性微微生物，应加加以注意和克克服。抗生素作用对象工作浓度（μg/ml）稳定性（天）两性霉素B真菌1～2.53制霉菌素真菌503氨苄青霉素G＋、G－细菌1003红霉素G＋细菌，支原体1003四环素G＋、G－细菌，支原体104庆大霉素G＋、G－细菌，支原体505利福平G＋、G－细菌503卡那霉素G＋、G－细菌1005链霉素G＋、G－细菌1003氯霉素G－细菌55青霉素GG＋细菌1003三、动物细胞胞培养基的种种类与组成动物细胞对培培养基的要求求高，不同细细胞系的要求求也不尽相同同，因此培养养基成分复杂杂而且昂贵。。但是要尽可可能提供与体体内生活条件件接近的培养养环境。主要要组成成分如如下：糖类、必需氨氨基酸、维生生素、无机盐盐类、生长类类因子及激素素、结合蛋白白质、贴附与与伸展因子及及其它附加成成分等。不同细胞对葡葡萄糖利用相相似，但对氨氨基酸的利用用相差很大，，不同的细胞胞过程对氨基基酸的需求存存在差别。目目前停留在流流加谷氨酰胺胺上。血清：蛋白质质、氨基酸、、葡萄糖、激激素和生长因因子等。胎牛牛血清、新生生牛或成牛血血清、马血清清、鸡血清、、羊血清及人人血清，最广广泛应用的为为胎牛血清和和新生牛血清清。水解乳蛋蛋白和胶原富富含氨基酸。。血清和水解解酪蛋白应用用于许多细胞胞系和原代及及传代细胞培培养。脂类化合物对对动物细胞培培养是必需的的，实际中类类脂及其前体体和血清常平平行使用。添添加的蛋白质质试剂主要有有铁传递蛋白白，起离子载载体的作用，，有时用无机机铁盐代替。。胰岛素起生生长素的作用用，白蛋白起起保护剂作用用。其他附加加成分如核苷苷类及丙酮酸酸盐等是培养养基的必需成成分，有助于于细胞克隆和和特异化细胞胞的培养。动物细胞培养养过程中，被被微生物污染染。常添加抗抗生素，以避避免轻度污染染。1.天然培培养基直接取自于动动物组织提取取液或体液作作为培养基，，如血浆凝块块、血清、淋淋巴液、胚胎胎浸出液等。。营养价值高高，成分复杂杂，不稳定，，来源受到限限制，不宜大大量培养和生生产使用。2.合成培培养基合成培养基用用化学成分明明确的试剂配配制的培养基基，组分稳定定。现在已有有几十种合成成培养基，大大部分已商品品化。组成：无机盐盐、糖、氨基基酸、维生素素及其他成分分。由于细胞种类类和培养条件件不同，所用用合成培养基基也不同，在在动物细胞培培养中最常用用培养基有7－8种。3.无血清清培养基无血清培养基基是全部用已已知成分组配配的、不加血血清的合成培培养基。在含含有营养和贴贴壁因子的基基础培养基中中，加入适宜宜的细胞生长长因子，细胞胞良好生长，，适合于制药药生产。无血清培养基基提高了培养养的质量，避避免了使用血血清带来的麻麻烦，产品纯纯化容易，组组分稳定，可可大量配制。。无血清培养基基通常需要添添加激素与生生长因子、结结合蛋白、贴贴壁与伸展因因子、低分子子营养成分等等。大多数无血清清培养基含有有蛋白质和激激素等大分子子物质，适宜宜于多种细胞胞系的培养。。对于大规模模生产用的无无血清培养基基，往往成分分不完全清楚楚，但简单而而且低成本。。四、培养基的的控制1.培养用用水质细胞培养水质质最低要求电电导率在1X106Ωcm以上上。水存放时时间不宜超过过2周。对于于制药，必需需使用纯净水水配制培养基基，普通水必必需除去各类类元素有毒或或有害物质及及微生物，还还必需除热源源，达到纯净净水标准。2.缓冲液液缓冲液：弱酸酸与弱酸盐或或弱碱与弱碱碱盐组成的，，pH恒定但但不干扰试验验。不同种类类细胞对pH要求不一一致，不同生生长阶段对pH要求也不不同。原代细细胞pH要求求严格，而传传代细胞要求求较宽。细胞胞培养过程中中代谢产生酸酸性物质，使使培养基的pH不断下降降。缓冲液中中和培养液中中的酸性物质质。最广泛使用为为碳酸氢钠/碳酸,其次次为磷酸二氢氢钠/磷酸氢氢二钠，调节节二者的比例例，配制成不不同pH缓冲冲液。碳酸盐缓冲液液除了直接的的缓冲作用外外，还有间接接作用，碳酸酸生成挥发性性CO2后很快逸出。。细胞呼吸产产生的CO2与水形成碳酸酸，任何碱在在培养液中都都被中和，生生产相应碳酸酸氢盐其他缓冲液:Tricine-Glycine、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、、HEPPSO等等等有机缓冲液液，缓冲能力力强。Tris所含氨基基具有高的化化学反应活性性，能抑制细细胞生长，并并通过生物膜膜，它调节pH要依赖于于温度的变化化，因此不宜宜作为培养液液。离体培养养中，缓冲液液多为平衡盐盐溶液的重要要组分之一，，很少单纯使使用。3.生理盐盐水与平衡盐盐溶液在缓冲液的基基础上，添加加调节渗透压压的盐类，在在一定程度上上能满足细胞胞对pH和盐盐离子要求。。缓冲液或缓冲冲盐溶液用于于:配制溶液液,处理细细胞的溶液。。对于直接接接触、长期培培养的培养液液，常用生理理盐水和平衡衡盐溶液，是是渗透压与胞胞浆渗透压平平衡的溶液。。生理盐水供给给细胞水分和和各种离子，，维持一定渗渗透压，并能能良好溶解试试剂和药物。。有各种不同同成分的生理理盐水，分别别加入pH缓缓冲剂与指示示剂、葡萄糖糖，形成平衡衡盐溶液。平衡盐溶液：：集缓冲液的的缓冲能力、、生理盐水的的等渗能力、、营养供给为为一体，具有有多种功能和和作用。BSS配制：：1）先分别溶溶解CaCl2、MgCl2、MgSO4。2）在另一容容器中依次溶溶解其他试剂剂。3）在另一容容器中用5.6%NaHCO3数滴溶解酚红红。4）将含Ca2+、Mg2+溶液缓慢倒入入步骤2配制制的溶液中，，搅拌，防止止沉淀。5）再加入酚酚红溶液。6）补足水，，并用NaHCO3调节pH。含葡萄糖的BSS过滤除除菌，不含葡葡萄糖时常规规高压灭菌。。小量培养液液可置4度保保存。一旦出出现沉淀，要要重新配制。。注意事项：细胞只利用L型氨基酸，，不能利用D型，对于DL混合型氨氨基酸，使用用量应该加倍倍。谷氨酰胺溶液液中很不稳定定，要单独配配制成浓缩液液。NaHCO3一般配成3.7％、5.6%、7.4%三种浓浓度，过滤除除菌或高压灭灭菌，4度保保存，使用前前加入，调节节培养基pH。为了优化细胞胞生长环境，，还添加其他他成分，如嘌嘌呤和嘧啶类类，维生素C、谷胱甘肽肽、巯基乙醇醇。一般情况下，，培养基成分分如氨基酸、、维生素、葡葡萄糖、缓冲冲液等、补充充因子几类，，先配制成高高倍浓缩的母母液，过滤灭灭菌，冷藏。。使用时按一一定比例稀释释，配制成工工作液。第二节动物物细胞增殖生生长的动力学学过程一、单细胞生生长增殖周期期从一个细胞分分裂形成两个个新细胞的过过程为一个细细胞周期或一一个细胞世代代。单个细胞胞周期包括细细胞间期、细细胞分裂期，，间期又包括括间期1、DNA合成期期和间期2三三个时期。不同的细胞类类型其分裂周周期及各期的的时间都不同同，培养条件件及培养基成成分也会影响响细胞周期,一般地动物细细胞分裂周期期为12－48小时,典型的细胞周周期为24小时。对连续细胞系系，失去了细细胞周期控制制，人工培养养条件不适，，细胞将发生生程序化死亡亡即凋亡。在在培养过程中中，缺乏生长长因子或血清清、营养受限限和逆境等可可引发凋亡发发生。二、细胞群体体的生长过程程细胞群体生长长增殖过程与与微生物的生生长增殖过程程相似1.潜伏期期，细胞经历历一段悬浮状状态，贴附于于器皿表面。。2.对数生生长期：细胞胞分裂旺盛，，指数增加。。细胞相互接接触汇合成片片，接触抑制制，限制分裂裂和运动，密密度不再增加加。3.静止期期：分裂数数与死亡数相相等的相对动动态平衡时期期。4.衰亡期：：细胞死亡数数目大于分裂裂数目的时期期。三、群体细胞胞生长的动力力学参数细胞分裂代数数G就可用下下列公式计算算：G＝logN－logN0）/log2第四节动物物细胞的分离离与培养一、细胞的种种类生物体是由多多种多样的分分化细胞构成成，如人体的的细胞类型达达200余种种。这些细胞都是是由受精卵分分裂产生的细细胞后代生长长增殖分化而而来。不同细细胞具有不同同的功能，细细胞分化异常常导致癌变。。分化程度越越高，脱分化化的能力越差差。在胚胎发育过过程中，高等等动物细胞的的分化是由全全能性变成多多能性，再变变成单能性，，进而失去再再分化的能力力。虽然成熟细胞胞不能再分化化，但其细胞胞核仍然具有有全能性，因因此可以通过过核移植，克克隆动物。体外培养细胞胞，可分为原原代细胞系、、传代细胞。。原代培养：从体内取出的的组织细胞进进行体外接种种培养，原代代培养的细胞胞为原代细胞胞，它生长分分裂并不旺盛盛，与体内细细胞相似，适适合于药物检检测实验。生生产中有些产产品仍沿用原原代细胞，如如鸡胚细胞，，兔或鼠肾细细胞、淋巴细细胞。传代细胞:原代细胞转接接后培养的细细胞。传代后后，细胞分裂裂增殖旺盛，，能保持一致致的二倍体核核型，所以又又成为二倍体体细胞系。传传代细胞的增增殖能力有限限，所以也称称为有限细胞胞系。如WI－38、MRC－5、、2BS等用用于生产。根据细胞的传传代次数和寿寿命，可分为为有限细胞系系和无限细胞胞系或连续细细胞系。有限细胞系:正常细胞经经过多次传代代后，一般可可连续培养30－50代代，就会逐渐渐失去增殖能能力，也就是是说它们只能能生长有限的的时间，经过过若干传代培培养后将老化化死亡。无限细胞系：：当细胞经过过自然或人为为的因素转化化为异倍体后后，才能变为为无限细胞系系。如肿瘤细细胞就是自发发形成的永久久细胞系，没没有分裂次数数的限制。物物理、化学或或生物因素也也能获得。细胞寿命无限限，生长不受受细胞密度的的影响，倍增增时间短不具具接触抑制现现象，它对培培养条件和生生长因子等要要求低，，非非常适合于工工业化生产，，理想的药物物生产细胞系系。根据细胞对生生长特性和对对基质的依赖赖性，可分为为贴壁依赖性性细胞和非贴贴壁依赖性细细胞。贴壁依赖性细细胞：生长需需要在适量带带电荷的固体体或半固体支支持表面，细细胞自身分泌泌或人为在培培养基中加入入贴附因子，，使细胞依附附在支持物表表面，才能生生长和增殖，，大多数动物物细胞都属于于此类。非贴壁依赖性性细胞：生长长不依赖于固固体支持物表表面，可在培培养液中悬浮浮生长，有时时被称为悬浮浮细胞。血液液、淋巴细胞胞、肿瘤细胞胞和某些转化化细胞属于此此类，生长干干扰素的Namalwa细胞。有些细胞对支支持物的依赖赖性不严格，，可贴壁生长长，可悬浮生生长。中国仓仓鼠卵巢细胞胞、小鼠L929细胞、、BHK细胞胞。二、工程细胞胞的获得与保保存目前用于制药药的动物细胞胞有4类，即即原代细胞系系、二倍体细细胞系、异倍倍体细胞系和和融合的或重重组的工程细细胞系。细胞无限传代代，使大规模模工业化生产产药物成为可可能。异倍体细胞用用于产生重组组基因工程产产品，使动物物细胞成为药药物生产的一一个新领域。。1.原代细细胞系的分离离与培养用原代细胞系系生产药物需需要大量的动动物。动物组织或器器官洗涤粉碎酶解消化离心或过滤接种培养培养液稀释细细胞洗涤37度消化，，检查是否充充分和完全。。胰蛋白酶：细细胞间质较少少的软组织，，胚胎、肝、、肾及传代细细胞胶原酶：纤维维、上皮、癌癌组织工作浓度：0.1-0.3mg/ml链霉蛋白酶、、粘蛋白酶、、蜗牛酶2.传代细细胞培养长满器皿表面面的细胞进行行分离，接种种到新的培养养基上，进行行新一轮培养养。掌握好最佳时时期：刚刚全全部汇合的细细胞，过早产产量低，过晚晚健康状态不不佳。过程与原代细细胞相同，用用30－50倍体的0.25％胰蛋蛋白酶和EDTA对细胞胞块消化，消消化后再培养养。要注意消化程程度，细胞对对酶的反应不不同，有的敏敏感，掌握好好适宜的消化化时间和方法法，不要过度度，获得细胞胞浓度均匀，，生长速度一一致的传代细细胞。曾经广泛应用用，但不是理理想的生产细细胞系3.细胞系系的建立与保保存一旦获得了稳稳定的有一定定特性的细胞胞系，就建立立细胞库，进进行长期保存存。根据药品品生产的有关关规定，必须须建立原始细细胞库和生产产用细胞库或或工作细胞库库。WCB1QCWCB2QCQC原始培养物MCBQC内容：细细胞活性检测测、无菌实验验、核型、DNA分析、同工酶酶分析、支原原体试验、其其他外源物试试验、稳定性性和基因型分分析等，工作作细胞库必须须与主细胞库库完全一致。。低温冷冻保存存：用冷冻保护液液（含10％％血清的培养养液，附加10％甘油或或7.5%-10%二甲甲基亚砜）细细胞预冷，稀稀释成106细胞/ml。分分装，，火焰焰下封封口。。缓慢慢冷冻冻，细细胞放放入CO2低温冰冰柜或或液氮氮中，，温度度为-150——-190℃，细胞胞的全全部活活动几几乎处处于停停止状状态。。复苏细细胞：：冷冻细细胞取取出，，立即即在37℃水浴中中，快快速融融化。。在保保护剂剂存在在下，，慢冻冻快融融是保保存复复苏细细胞的的要领领。融融化后后的细细胞可可用于于进一一步实实验。。三、大大规模模培养养方法法根据动动物细细胞的的生长长特点点，只只能采采用悬悬浮培培养、、贴壁壁培养养、固固定化化培养养等三三种主主要方方法进进行大大规模模培养养。1.单单层层贴壁壁培养养细胞贴贴附于于一定定的固固体支支持表表面上上，进进行的的培养养方法法。大大多数数动物物细胞胞属于于贴壁壁依赖赖性，，贴壁壁培养养是动动物细细胞培培养的的一种种重要要方法法。接接种后后，细细胞经经过吸吸附、、接触触而贴附于于基质质表面面，然然后进进行生长、、分裂裂繁殖殖，很很快进进入对对数期期。一一般数数天就就长满满整个个表面面，形形成致致密的的单层层细胞胞。贴壁培培养容容器:转瓶瓶、玻玻璃珠珠、微微载体体和中中空纤纤维等等。滚瓶是是为早早期培培养所所采用用，结结构简简单，，投资资少，，重复复性好好，但但劳动动强度度大，，占用用空间间大，，产量量低，，不易易控制制和监监测。。细胞贴贴壁原原理：：细胞主主要靠靠静电电引力力和范范德华华力贴贴附在在固体体表面面，因因为动动物细细胞在在生理理状态态下带带负电电，贴贴壁培培养的的固体体表面面要求求具有有正电电荷和和高表表面活活性。。适宜的的电荷荷密度度是粘粘附和和贴壁壁的关关键，，电荷荷密度度低，，不能能有效效粘附附，电电荷密密度高高则会会对细细胞产产生毒毒性。。优点：：容易易更换换培养养液，，灌注注培养养时，，能达达到高高细胞胞密度度；有有利于于产物物的分分泌表表达，，可改改变培培养液液与细细胞的的比例例。缺点：：操作作较烦烦杂，，检测测受到到一定定限制制，培培养条条件难难以均均一，，传质质和传传氧差差，放放大培培养是是瓶颈颈。2．微微载体体培养养微载体体为三三维培培养系系统，，细胞胞贴附附于微微载体体上伸伸展和和增殖殖，再再悬浮浮于培培养液液中。。微载体体培养养兼具具贴壁壁和悬悬浮培培养的的双重重优点点，有有很大大的比比表面面积，，供单单层细细胞贴贴附和和增殖殖。悬浮微微球使使细胞胞生长长的环环境均均一，，培养养基利利用率率高，，重复复性好好，减减少了了劳动动强度度，容容易放放大，，于20世世纪80年年代正正式用用于工工业化化生产产干扰扰素、、疫苗苗和尿尿激酶酶原等等。多孔微微载体体或多多孔微微球，，极大大地增增加了了比表表面积积，如如Cytodex-1的的比表表面积积达6000cm2/g，，Cytopore的比比表面面积达达28000cm2/g。。商品品化的的微载载体基基质有有玻璃璃、葡葡聚糖糖、纤纤维素素、塑塑料和和明胶胶等，，表面面带电电基团团为DEAE等等。玻璃珠珠：直直径约约2～3μμm，密度度1.5g/cm3，难以以在低低速下下悬浮浮。在在玻璃璃表面面覆盖盖塑料料，可可得到到低密密度微微载体体，如如Bioglas和Ventreglas，而中中空玻玻璃也也可达达到此此密度度。葡聚糖糖微载载体：：带正正电，，干粉粉可在在pH7.2的磷酸酸盐缓缓冲液液中吸吸胀，，清洗洗灭菌菌后使使用。。Cytodex2：电荷性性大大大下降降，吸吸附能能力很很低，，适合合于蛋蛋白质质药物物的生生产。。纤维素素微载载体DE52和DE53：：适合多多种细细胞培培养。。塑料载载体Biosilon是聚乙乙烯载载体，，无吸吸附性性能，，可重重复使使用，，但贴贴壁较较慢，，对细细胞的的摩擦擦损伤伤较大大。聚丙烯烯酰胺胺载体体贴壁壁较快快，亲亲水性性。微载体体的选选择依依赖于于搅拌拌系统统和工工艺过过程，，可用用于转转瓶、、搅拌拌烧瓶瓶和气气升式式反应应器等等。为了提提高贴贴壁能能力，，对基基质表表面进进行包包埋，，如血血清蛋蛋白、、多聚聚赖氨氨酸处处理，，可加加速贴贴壁过过程。。在悬浮浮培养养早期期，还还可向向培养养液补补充丙丙酮酸酸、腺腺嘌呤呤、次次黄嘌嘌呤、、胸腺腺嘧啶啶等。。多孔微微载体体：直径0.2～5mm，孔径径20～300μμm，达占占总体体积的的85%，可实实现细细胞的的固定定化，，达到到高密密度培培养。。广泛使使用的的多孔孔微载载体有有Cellsnow、Cytocell（纤维维素基基质））、Verax、Cultisphere（胶原原）、、Cytoline1和2（聚苯苯乙烯烯）、、ImmobaSil（硅橡橡胶））及Siran（玻璃璃）等等。主要用用于搅搅拌反反应器器、固固定床床和流流化床床反应应器。。贴壁培培养的的固体体表面面要求求：正电荷荷和高高度表表面活活性。。玻璃璃、聚聚苯乙乙烯塑塑料、、不锈锈钢金金属材材料和和微载载体、、多孔微微载体体或多多孔微微球。。商品品化的的微球球基质质是葡葡聚糖糖、聚聚丙烯烯酰胺胺、明明胶交交联、、聚苯苯乙烯烯和纤纤维素素等，，带电电基团团为DEAE等等。微微载体体有CytodexI、、II、III和DEAE－纤纤维素素等，，已是是主要要的培培养方方法。。理想的的微载载体所所具备备的性性能：：质地柔柔软，，微球球间摩摩擦轻轻；耐耐高温温，可可高压压灭菌菌；透透明性性，便便于观观察细细胞生生长；；细胞胞相容容性，，利于于贴附附和生生长；；无毒毒性和和惰性性，对对细胞胞无毒毒害，，不产产生有有害物物质，，不吸吸附培培养基基；低低速即即悬浮浮，静静止即即沉降降，便便于换换液和和收获获；微微粒大大小均均匀；；可回回收重重复使使用。。3.悬悬浮浮培养养细胞在在反应应器内内游离离悬浮浮生长长的培培养过过程,主要要对于于非贴贴壁性性依赖赖性细细胞，，如杂杂交瘤瘤细胞胞等。。动物细细胞悬悬浮培培养是是在微微生物物发酵酵的基基础上上发展展而来来的，，经常常借鉴鉴发酵酵理论论和经经验，，但有有自身身的特特点，，由于动动物细细胞没没有细细胞壁壁，不不能耐耐受剧剧烈的的搅拌拌和通通气剪剪切，，对环环境适适应性性差。。在悬浮浮培养养中要要注意意发挥挥动物细细胞的的特性性。常用的的反应应器有有通气气式搅搅拌混混和气气升式式生物物反应应器。。方法的的优点点是操操作简简单，，培养养条件件相对对均一一，传传质和和传氧氧较好好，容容易放放大培培养。。细胞胞体积积小，，密度度低，，培养养病毒毒易失失去标标记而而降低低免疫疫能力力。4.固固定化化培养养细胞包包埋在在微载载体内内或胶胶囊内内，即即细胞胞固定定化后后，进进行悬悬浮培培养。。适宜宜于贴贴壁依依赖性性和非非贴壁壁依赖赖性细细胞的的培养养。细细胞密密度高高、抗抗剪切切力和和污染染等优优点，，是生生产首首选方方法。。吸附：：通过过物理理吸附附使细细胞贴贴附在在固体体载体体表面面，微微载体体和中中空纤纤维培培养等等。共价交交联：：双功功能试试剂处处理细细胞，，使细细胞之之间交交联的的固定定化方方法。。包埋：细胞胞包埋在载载体内部。。网格型为为高分子凝凝胶细网格格，而微囊囊型为高分分子半透膜膜。包埋材材料有人工工聚合物、、琼脂糖凝凝胶和血纤纤维蛋白等等。微囊法：：亲水半半透膜把把细胞包包埋在微微囊内。。多聚赖氨氨酸/海海藻酸固固定细胞胞：凝胶胶载体的的表面被被多聚赖赖氨酸覆覆盖，形形成一层层多孔可可透薄膜膜，再使使凝胶载载体液化化，便可可制成微微囊。杂交瘤细细胞与海海藻酸钠钠溶液混混合，经经微囊发发生器，，微球滴滴入氯化化钙溶液液中，形形成凝胶胶，然后后用聚氨氨基酸处处理，使使微球表表面成膜膜，再用用柠檬酸酸去钙离离子，球球内海藻藻酸钠成成液态，，细胞在在在微囊囊内悬浮浮。微囊化固固定培养养工艺在在单克隆隆抗体的的生产中中获得成成功，使使抗体截截留在膜膜内，血血清中的的