抗体的制备与应用课件

抗体的制备与应用抗体的制备与应用1EmilvonBehring(1845-1917)antibody-In1890byvonBehringandKitasatodescribedanactivityinserumoftoxin-immunizedanimalsthatneutralizedtoxin.Transferofimmuneserumcouldprotectnaïveanimalsfromdiphtheriaortetanus.HistoryEmilvonBehringantibody-In12Antibodies(Ab)

areproductsobtainedbyantigenstimulatingBlymphocytes,thenBcellswillproliferateintoplasmacellstoproducespecificantibodieswhichcanreactspecificallywithcorrespondingantigens.Immunoglobulins(Ig)

areallthoseglobulinswhichhavethefunctionorstructureofantibody.Twokindsofimmunoglobulins:

>secretedimmunoglobulins(sIg):Antibody >membraneimmunoglobulins(mIg):BCRAntibodies(Ab)areproductso3Day02468RestingBcellAntibodyformingcell(plasmacell)YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYDay0RestingBcellAntibodyYY4AntibodyStructureandFunctionAntibodyStructureandFunctio5StructureofimmunoglobulinsBasicstructureHeavychainandLightchain（重链和轻链）VariableregionandConstantregion（可变区和恒定区）OtherstructuresHingeregion（铰链）Joiningchain（J链）Secretorycomponent(SC，分泌片)Domains（功能区）StructureofimmunoglobulinsBa6抗体的制备与应用课件7peptidepeptideepitopebindingofHV(CDR)andepitopepeptidepeptideepitopebindingo8ThefunctionofIgV区的功能：特异性结合抗原（neutralization，中和作用）

抗体结合相应抗原分子，发挥免疫效应（生理与病理）；BCR特异性识别并结合抗原分子，介导体液免疫应答。ThefunctionofIgV区的功能：特异性结合抗9C区的功能

激活补体

Immunecomplex（IC）

激活补体经典途径与细胞表面FcR结合

1）调理作用（opsonization)；IgG或IgM的Fc段与吞噬细胞表面FcR结合促吞噬；2）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（Ab-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)3)介导I型超敏反应IgE的Fc段与肥大细胞表面FcR结合受体桥联细胞活化

穿过胎盘和粘膜

IgG通过胎盘；sIgA穿过粘膜C区的功能10抗体的制备与应用课件11

抗原是启动机体免疫系统的先决条件Antigensaresubstancescapableofstimulatingimmunesystem,generatingantibodiesand/oreffectorlymphocytesandbindingspecificwiththeantibodyandeffectorlymphocytesinvivoorinvitro.抗原是启动机体免疫系统的先决条件12

ImmunologicpropertiesofAgsImmunogenicity免疫原性antigenicity/immunoreactivity抗原性/反应原性/免疫反应性刺激免疫系统Immunologicproperties13抗原决定基-抗原特异性的分子基础抗原决定基（antigenicdeterminant)指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。也称为表位(epitope)。抗原决定基的位置、数目和空间结构决定抗原特异性。抗原决定基-抗原特异性的分子基础抗原决定基（antigeni14T细胞决定基（T细胞表位）：T细胞决定基主要位于抗原分子内部，必须由APC将抗原加工处理为小分子多肽并与MHC分子结合，然后才能被TCR所识别。B细胞决定基（B细胞表位）：BCR能直接识别未经APC加工的天然抗原，其识别的B细胞表位主要位于抗原分子的表面，与BCR具有易接近性。根据抗原决定基由TCR还是BCR识别分类T细胞决定基（T细胞表位）：T细胞决定基主要位于抗原分子内部15主要内容概述多克隆抗体的制备与应用单克隆抗体的制备与应用基因工程抗体的制备与应用主要内容概述16概述

第一代抗体：多克隆抗体(polyclonalantibody，PcAb)第二代抗体：单克隆抗体(monoclonalantibody，McAb)第三代抗体：基因工程抗体(geneticengineeringantibody，GeAb)概述

17第一节多克隆抗体的制备与应用

（polyclonalantibody，PcAb)

概念：采用含有多种抗原决定基(B细胞表位)的抗原免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。制备流程：免疫原（佐剂）免疫动物，分离抗血清，鉴定，保存。第一节多克隆抗体的制备与应用

（polyclonala18传统抗血清（多克隆抗体）抗原(含多种表位)免疫123412341234脾脏淋巴結B細胞传统抗血清抗原免疫123412341234脾脏淋巴結B19多克隆抗体的优缺点优点：制备流程简便，操作技术要求低；制备周期短，一个月左右就能获得目的抗体；缺点：制备的抗体是针对多种抗原决定基的混合物，特异性不高，易出现交叉反应；抗体来源于动物，应用于人体会产生严重的过敏反应。应用：主要用于免疫学检测，被动免疫治疗和紧急预防。其缺点限制了其在疾病诊断和治疗中的应用。

多克隆抗体的优缺点优点：20

抗A抗BABCrossreactionSameepitope抗AABCrossreactionSame21第二节单克隆抗体的制备与应用

(monoclonalantibody，McAb)

概念：通过小鼠杂交瘤细胞和单克隆抗体技术生产的抗体。这种杂交瘤细胞既具有骨髓细胞能大量无限增殖的特性，又具有B细胞合成和分泌抗体的能力。每一个杂交瘤单克隆是用一个B细胞融合而产生的克隆，因此，由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的抗体，称为单克隆抗体。制备流程：免疫—融合—筛选第二节单克隆抗体的制备与应用

(monoclonala22单克隆抗体制备流程单克隆抗体制备流程23杂交瘤技术的原理1.亲本细胞的选择

－小鼠骨髓瘤细胞：不产生Ig的重链和轻链；HGPRT-;TK-；与提供淋巴细胞的动物品系相同。能永生化。

备注：HGPRT:次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶TK:胸腺嘧啶激酶

－免疫脾细胞：经抗原免疫的BALB/c小鼠的脾脏。不能永生化，但能分泌抗体，HGPRT+;TK+。杂交瘤技术的原理24

2.细胞融合骨髓瘤细胞

PEG

杂交瘤细胞

脾细胞融合后细胞的类型:

未融合的脾细胞杂交瘤细胞未融合的瘤细胞

2.细胞融合253.杂交瘤细胞的筛选采用筛选培养基：HAT培养基H-次黄嘌呤、A-氨基喋呤、T-胸腺嘧啶只有融合成功的细胞（杂交瘤）才能在HAT培养基上长期生长，原因在于只有杂交瘤能成功合成DNA。

3.杂交瘤细胞的筛选采用筛选培养基：HAT培养基26DNA合成途径内源性途径（主要途径）利用谷氨酰胺（Gln）或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下合成DNA

(氨基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，因此能有效阻断DNA的合成)。外源性途径（补救途径）利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）或TK（胸腺嘧啶激酶）的催化作用下补救合成DNADNA合成途径内源性途径（主要途径）27融合后细胞在HAT培养基中存活情况脾细胞（HGPRT+,TK+,能生长，但不能永生化）骨髓瘤细胞（HGPRT-,TK-，不能生长）杂交瘤细胞（HGPRT+,TK+，能生长，且能永生化）融合后细胞在HAT培养基中存活情况284、杂交瘤细胞的筛选和克隆化

筛选：免疫荧光ELISA等

克隆化：有限稀释法单个细胞显微操作法软琼脂培养法4、杂交瘤细胞的筛选和克隆化29配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml)+细胞冻存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏5.杂交瘤细胞的冻存与复苏配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml)+细胞冻306.单克隆抗体的生产

体内：BALB/c小鼠体内诱发含有单抗的腹水体外：无血清培养基悬浮培养等7.单克隆抗体的纯化

硫酸铵沉淀法离子交换层析A蛋白-Sepharose亲和层析6.单克隆抗体的生产31抗体的制备与应用课件32单克隆抗体（McAb）的优缺点优点：成分、结构均一，特异性强。一种McAb分子的所有区域完全相同，只针对一种抗原决定基，避免了交叉反应。效价高使用一种抗原免疫动物，可以获得针对不同抗原决定基的不同特异性的McAb。杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖、传代，因此产量高，可连续生产单克隆抗体（McAb）的优缺点33缺点：制备McAb成本昂贵，制备流程长，操作烦琐，技术要求较高。McAb为鼠源性，应用于人体将产生人抗鼠抗体（Humananti-mouseantibody,HAMA）,治疗中可能引起过敏反应且疗效大大降低。抗体为全Ig，相对分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效杀伤浓度。缺点：34单克隆抗体在医学上的应用（一）用作诊断试剂

1.检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。2.鉴定病原体，准确诊断传染病。3.用于肿瘤的诊断和分型4.激素类单抗用于测定体内激素含量，判断内分泌的功能状态

单克隆抗体在医学上的应用（一）用作诊断试剂35（二）用作研究工具纯化抗原分析和探查抗原结构分析抗原决定基的功能（三）用于疾病的治疗抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗（二）用作研究工具36单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题单克隆抗体的特异性由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应异种抗体反应鼠源性单抗用于人体，导致超敏反应生产成本高,技术要求高，稳定性差，难于普及应用单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题37第三节基因工程抗体的制备与应用

(geneticengineeringantibody，GeAb)

概念：利用基因工程及蛋白工程技术，对抗体基因进行改造，按人们需要重新组装抗体或抗体基因片段，并转化适当的受体细胞后表达的规模化抗体。基本原理：利用分子生物学技术分离纯化抗体基因或基因片段，在最大限度保留其抗原结合活性，降低其异源性的原则指导下，按临床或科研需要对抗体基因进行拼接组装，在转化适当的受体细胞表达，制备具有不同大小和不同功能的抗体。第三节基因工程抗体的制备与应用

(geneticeng38基因工程抗体产生的时代背景1、单克隆抗体的毒副作用2、人杂交瘤技术未获真正突破:融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫3、现代免疫学和分子生物学技术的推动4、基因工程抗体的优点基因工程抗体产生的时代背景39基因工程抗体的优点：易于获得稀有抗体;人抗鼠抗体反应（Humananti－mouseantibodyreaciton,HAMAR）低;小分子抗体：渗透力强、HAMAR低、亲和性高、靶向性高、组织非特结合少等。基因工程抗体的优点：40基因工程抗体的分类1、全抗体（1）嵌和抗体（chimericantibody）（2）人源化抗体（humanizedantibody）2、小分子抗体（1）Fab（2）ScFv（3）单域抗体（4）分子识别单位基因工程抗体的分类413、其它抗体多价微型抗体双链抗体（diabody）微型抗体(minibody)三链抗体(triabody)新型抗体分子新效能抗体双特异性抗体（bispecificantibody,BsAb）胞内抗体（intrabody）免疫黏连素（immunoadhesin）催化抗体（catalyticantibody）3、其它抗体多价微型抗体42抗体的制备与应用课件43一、基因工程全抗体一、基因工程全抗体44基因工程全抗体研发的演变历程鼠抗体100%鼠源鼠/人崁合抗体(66-75%人源)人源化抗体(90-95%人源)100%人源基因工程全抗体研发的演变历程鼠抗体鼠/人崁合抗体人源化抗体145（一）嵌和抗体（chimericantibody)

1、概念指由两种不同种系来源的基因所编码的抗体。2、原理从鼠源的单克隆抗体杂交瘤细胞株分离并鉴定抗体V区基因，再通过适当的技术将其连接到人抗体C区基因上，构建Vm（mouse）-Ch（human）嵌和基因，并转入适当的受体细胞表达。（一）嵌和抗体（chimericantibody)46嵌合抗体嵌合抗体47抗体的制备与应用课件483、嵌和抗体的优缺点：优点：特异性强亲和性高具有全抗体的所有功能半衰期长、疗效显著缺点：有10－50%发生HAMA靶向性差3、嵌和抗体的优缺点：49（二）人源化抗体（humanizedantibody）1、概念指利用基因工程技术，在嵌合抗体基础上，针对嵌合抗体仍然具有较高的HAMA反应的问题，进一步对抗体进行CDR及FR区域置换。通过这种方式获得的抗体人源部分可达97%，又称为CDR移植抗体（CDRgraftingantibody）。2、原理首先利用计算机模建技术，模拟抗体立体结构。再根据同源性原理从人抗体基因库中筛选人FR序列。通过分子模拟技术鉴别出与抗原结合位点密切相关的鼠单抗FR上氨基酸残基，将这些残基与CDR重组并一同移植到人FR上。（二）人源化抗体（humanizedantibody）50抗体的制备与应用课件513、方法

在抗体可变区，具有较高变异的是位于超变区内（互补决定区，CDR）少数核心氨基酸，它决定了抗体的特异性，而可变区中的“框架区（FR）”则决定了可变区的三维空间结构。通过同源蛋白三维结构模建技术预测抗体可变区三维结构后，对鼠及人VH、VL表面容易引起较强免疫反应的氨基酸进行比较分析，进行人源化分子设计。3、方法52二、基因工程小分子抗体二、基因工程小分子抗体53小分子抗体1．Fab抗体片段2．单链抗体（singlechainFv,ScFv）3．单域抗体（singledomainantibody）4．分子识别单位（molecularrecognizationunit,MRU）

小分子抗体1．Fab抗体片段54（一）Fab抗体

由V链的VH、CH1及完整的L链构成（一）Fab抗体55优点：分子小，HAMAR低亲和性高靶向性高于McAb缺点：仍然有一定的HAMAR发生靶向性不如ScFv稳定性差优点：56（二）单链抗体（ScFv）概念是指通过特定的方法将抗体分子VH和VL连接在一起构成的只有一条链的抗体。优点：克服了HAMAR的问题分子量小、渗透性高，靶向性增加ScFv可保留较高活性在体内半衰期长、稳定性高没有Fc段，非特异结合减少，在肿瘤导向治疗及成像诊断中有特别的意义（二）单链抗体（ScFv）57类型（1）二硫键稳定的单链抗体(dsFv）（2）由连接肽连接的单链抗体（ScFv）类型581、dsFv（二硫键稳定的单链抗体）利用基因突变技术在VH和VL上加入半胱氨酸，利用两者形成的二硫键将VH和VL连接在一起。突变部位的确定：由Jung等人在1994年用分子模建技术确定：VH44/VL100及VH105/VL43。1、dsFv（二硫键稳定的单链抗体）59抗体的制备与应用课件602、ScFv（由连接肽连接的单链抗体）2、ScFv（由连接肽连接的单链抗体）61

Linker的设计原则长度和性质以不干扰VH和VL的折叠和不影响抗原结合部位的功能为标准。过短的接头会影响VH和VL之间的相互作用，过长的接头会影响抗体与抗原的结合，而且易受酶水解，不稳定。接头中尽量不含疏水氨基酸。常采用3次重复出现的4个甘氨酸和1个丝氨酸即（Gly4Ser）3,的15氨基酸接头。

Linker的设计原则62（三）单域抗体只有一个VH或VL的抗体，通常为VH（三）单域抗体只有一个VH或VL的抗体，通常为VH63（四）分子识别单位只有一个CDR，通常为CDR3（四）分子识别单位只有一个CDR，通常为CDR364三、其它基因工程抗体多价微型抗体双链抗体（diabody）微型抗体(minibody)三链抗体(triabody)新型抗体分子新效能抗体双特异性抗体（bispecificantibody,BsAb）胞内抗体（intrabody）免疫黏连素（immunoadhesin）催化抗体（catalyticantibody）三、其它基因工程抗体多价微型抗体65（一）多价微型抗体1．双链抗体（diabody）2．微型抗体(minibody)3．三链抗体(triabody)（一）多价微型抗体1．双链抗体（diabody）661．双链抗体（diabody）双链抗体是通过化学铰链、黏性蛋白结构域融合法和接头长度控制三种主要手段将两个ScFv通过非共价键结合形成刚性、稳定的二聚体结构。具有两个抗原结合位点，分子量约60KD。具有穿透力强的优势，易于通过血管壁进入实体瘤。与ScFv比较，其肾脏的清除速度减慢。具有更大的临床应用价值。

1．双链抗体（diabody）双链抗体是通过化学铰链、黏性蛋672．微型抗体(minibody)

采用基因工程的手段，使用不同的接头把单链抗体(VL-VH)的VH功能区与IgG的CH3功能区融合，构成VL-VH-CH3的融合蛋白，称之为微型抗体（minibody）。该抗体合成后通过CH3功能区形成稳定的二聚体，发挥其双价抗体的作用。微型抗体的分子量约为80KD，较双链抗体(约60KD)的大，降低了体内清除速度，增加了滞留时间。此抗体具有（Fab’）2的类似性质，但没有（Fab’）2需对完整抗体进行酶切消化及二次纯化的繁琐过程，是一种较为理想的基因工程抗体形式。2．微型抗体(minibody)

采用基因工程的手段，使用不68抗体的制备与应用课件693．三链抗体(triabody)

制备单链抗体时，把接头的长度降2个或2个以下氨基酸残基，或者直接把VH功能区的N末端与VL功能区的C末端相连，这样可通过非共价键形成三聚体，称为三链抗体。VH和VL直接连接构成无连接肽（ScFv-0）三聚体的亲和力高，其与抗原结合比较牢固，解离速度慢。3．三链抗体(triabody)

制备单链抗体时，把接头的长70（二）新型抗体分子1．新效能抗体2．双特异性抗体（bispecificantibody,BsAb）3．胞内抗体（intrabody）4．免疫黏连素（immunoadhesin）5．催化抗体（catalyticantibody）

（二）新型抗体分子1．新效能抗体711．新效能抗体

通过基因拼接、化学交联等多种方法，将抗体分子与酶、化学药物、放射性核素、生物毒素、超抗原等相结合。通过抗体发挥导向或载体效应，使抗体携带物靶向结合于特异细胞上，发挥抗体携带物的效应功能。

1．新效能抗体

通过基因拼接、化学交联等多种方法，将抗体分子722．双特异性抗体（bispecificantibody,BsAb）又称双功能抗体（bifunctionalantibody,BFA），具有两个能结合不同特异性抗原位点的抗体。具有小分子抗体低副作用，又能有效促进细胞或分子聚合，介导高效生物学效应，在肿瘤、病毒感染治疗中具有较大优势。

2．双特异性抗体（bispecificantibody,B733、胞内抗体（intrabody)概念：

利用基因工程技术，在ScFv抗体基因的C端或N段加上先导序列，使抗体分子定向分布于非淋巴细胞的细胞核、细胞浆或某些特定的细胞器中表达，从而特异性干扰或阻断分布于该部位的生物大分子的加工、分泌或活性，引起胞内一系列生物过程改变的抗体。3、胞内抗体（intrabody)概念：74胞内抗体的构建首先获得ScFv基因，再通过PCR技术在其N或C端插入胞内定位信号序列。N端定位信号序列可引导抗体进入相关的细胞部位。而C端信号序列可使抗体滞留在该细胞特定部位。常用的胞内定位信号肽：核定位信号肽：PKKKPTV内质网定位信号肽：MWIWRILFVGAATGAAS内质网滞留信号肽：KDEL胞内抗体的构建75胞内抗体的作用机制抑制或稳定大分子之间的相互作用，改变蛋白所在的区室。通过对配体的修饰使其功能丧失。通过调节酶或阻碍酶活性位点、隐蔽酶底物，使酶固定在活化或失活构象。胞内抗体的作用机制764．免疫黏连素（immunoadhesin）抗体C区和细胞膜表面受体或细胞黏附分子等细胞表面结合位点通过一定的方式连接后，在真核细胞表达出的抗体样融合蛋白，称为免疫黏连素。其不含抗体Fab段，与抗原特异性无关，但与表达相应受体或黏附分子的靶细胞结合后可发挥抗体的部分效应功能，如ADCC、CDC等功能。

4．免疫黏连素（immunoadhesin）抗体C区和细胞膜775．催化抗体（catalyticantibody）根据免疫学及有机化学的基本原理，利用基因工程技术制备的具有催化活性的抗体，不仅能与抗原特异性结合，还能促使其发生化学转变。特点：能选择性结合并降解病毒、肿瘤细胞及其它生理靶细胞表面表达的蛋白及碳水化合物。其高效催化活性及位点特异性蛋白降解作用为临床疾病的治疗提供新的途径，有可能成为肿瘤导向治疗的新方法。5．催化抗体（catalyticantibody）根据免疫78四、基因工程抗体的应用四、基因工程抗体的应用79（一）肿瘤基因工程抗体由于分子量小，渗透能力强，容易进入肿瘤组织局部等优点，可将细胞毒素、酶、药物或放射性同位素偶连在抗体上，通过抗体的导向作用，特异性杀伤肿瘤组织或显像。对术后残留灶、术后复发、晚期肿瘤、肿瘤转移灶的诊断治疗具有重要的意义。

（一）肿瘤基因工程抗体由于分子量小，渗透能力强，容易进入肿瘤80（二）感染性疾病病毒感染细菌感染（二）感染性疾病病毒感染81（三）器官移植抗IL-2R人/鼠嵌合抗体已进入预防和治疗移植排斥反应Ⅲ临床实验，结果显示：能使肾移植排斥反应的发生率降低29%。（三）器官移植抗IL-2R人/鼠嵌合抗体已进入预防和治疗移植82（四）自身免疫性疾病

美国已用抗肿瘤坏死因子的嵌合抗体治疗类风湿性关节炎，疗效显著。

（四）自身免疫性疾病

美国已用抗肿瘤坏死因子的嵌合抗体治疗类83抗体的制备与应用抗体的制备与应用84EmilvonBehring(1845-1917)antibody-In1890byvonBehringandKitasatodescribedanactivityinserumoftoxin-immunizedanimalsthatneutralizedtoxin.Transferofimmuneserumcouldprotectnaïveanimalsfromdiphtheriaortetanus.HistoryEmilvonBehringantibody-In185Antibodies(Ab)

areproductsobtainedbyantigenstimulatingBlymphocytes,thenBcellswillproliferateintoplasmacellstoproducespecificantibodieswhichcanreactspecificallywithcorrespondingantigens.Immunoglobulins(Ig)

areallthoseglobulinswhichhavethefunctionorstructureofantibody.Twokindsofimmunoglobulins:

>secretedimmunoglobulins(sIg):Antibody >membraneimmunoglobulins(mIg):BCRAntibodies(Ab)areproductso86Day02468RestingBcellAntibodyformingcell(plasmacell)YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYDay0RestingBcellAntibodyYY87AntibodyStructureandFunctionAntibodyStructureandFunctio88StructureofimmunoglobulinsBasicstructureHeavychainandLightchain（重链和轻链）VariableregionandConstantregion（可变区和恒定区）OtherstructuresHingeregion（铰链）Joiningchain（J链）Secretorycomponent(SC，分泌片)Domains（功能区）StructureofimmunoglobulinsBa89抗体的制备与应用课件90peptidepeptideepitopebindingofHV(CDR)andepitopepeptidepeptideepitopebindingo91ThefunctionofIgV区的功能：特异性结合抗原（neutralization，中和作用）

抗体结合相应抗原分子，发挥免疫效应（生理与病理）；BCR特异性识别并结合抗原分子，介导体液免疫应答。ThefunctionofIgV区的功能：特异性结合抗92C区的功能

激活补体

Immunecomplex（IC）

激活补体经典途径与细胞表面FcR结合

1）调理作用（opsonization)；IgG或IgM的Fc段与吞噬细胞表面FcR结合促吞噬；2）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（Ab-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)3)介导I型超敏反应IgE的Fc段与肥大细胞表面FcR结合受体桥联细胞活化

穿过胎盘和粘膜

IgG通过胎盘；sIgA穿过粘膜C区的功能93抗体的制备与应用课件94

抗原是启动机体免疫系统的先决条件Antigensaresubstancescapableofstimulatingimmunesystem,generatingantibodiesand/oreffectorlymphocytesandbindingspecificwiththeantibodyandeffectorlymphocytesinvivoorinvitro.抗原是启动机体免疫系统的先决条件95

ImmunologicpropertiesofAgsImmunogenicity免疫原性antigenicity/immunoreactivity抗原性/反应原性/免疫反应性刺激免疫系统Immunologicproperties96抗原决定基-抗原特异性的分子基础抗原决定基（antigenicdeterminant)指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。也称为表位(epitope)。抗原决定基的位置、数目和空间结构决定抗原特异性。抗原决定基-抗原特异性的分子基础抗原决定基（antigeni97T细胞决定基（T细胞表位）：T细胞决定基主要位于抗原分子内部，必须由APC将抗原加工处理为小分子多肽并与MHC分子结合，然后才能被TCR所识别。B细胞决定基（B细胞表位）：BCR能直接识别未经APC加工的天然抗原，其识别的B细胞表位主要位于抗原分子的表面，与BCR具有易接近性。根据抗原决定基由TCR还是BCR识别分类T细胞决定基（T细胞表位）：T细胞决定基主要位于抗原分子内部98主要内容概述多克隆抗体的制备与应用单克隆抗体的制备与应用基因工程抗体的制备与应用主要内容概述99概述

第一代抗体：多克隆抗体(polyclonalantibody，PcAb)第二代抗体：单克隆抗体(monoclonalantibody，McAb)第三代抗体：基因工程抗体(geneticengineeringantibody，GeAb)概述

100第一节多克隆抗体的制备与应用

（polyclonalantibody，PcAb)

概念：采用含有多种抗原决定基(B细胞表位)的抗原免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。制备流程：免疫原（佐剂）免疫动物，分离抗血清，鉴定，保存。第一节多克隆抗体的制备与应用

（polyclonala101传统抗血清（多克隆抗体）抗原(含多种表位)免疫123412341234脾脏淋巴結B細胞传统抗血清抗原免疫123412341234脾脏淋巴結B102多克隆抗体的优缺点优点：制备流程简便，操作技术要求低；制备周期短，一个月左右就能获得目的抗体；缺点：制备的抗体是针对多种抗原决定基的混合物，特异性不高，易出现交叉反应；抗体来源于动物，应用于人体会产生严重的过敏反应。应用：主要用于免疫学检测，被动免疫治疗和紧急预防。其缺点限制了其在疾病诊断和治疗中的应用。

多克隆抗体的优缺点优点：103

抗A抗BABCrossreactionSameepitope抗AABCrossreactionSame104第二节单克隆抗体的制备与应用

(monoclonalantibody，McAb)

概念：通过小鼠杂交瘤细胞和单克隆抗体技术生产的抗体。这种杂交瘤细胞既具有骨髓细胞能大量无限增殖的特性，又具有B细胞合成和分泌抗体的能力。每一个杂交瘤单克隆是用一个B细胞融合而产生的克隆，因此，由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的抗体，称为单克隆抗体。制备流程：免疫—融合—筛选第二节单克隆抗体的制备与应用

(monoclonala105单克隆抗体制备流程单克隆抗体制备流程106杂交瘤技术的原理1.亲本细胞的选择

－小鼠骨髓瘤细胞：不产生Ig的重链和轻链；HGPRT-;TK-；与提供淋巴细胞的动物品系相同。能永生化。

备注：HGPRT:次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶TK:胸腺嘧啶激酶

－免疫脾细胞：经抗原免疫的BALB/c小鼠的脾脏。不能永生化，但能分泌抗体，HGPRT+;TK+。杂交瘤技术的原理107

2.细胞融合骨髓瘤细胞

PEG

杂交瘤细胞

脾细胞融合后细胞的类型:

未融合的脾细胞杂交瘤细胞未融合的瘤细胞

2.细胞融合1083.杂交瘤细胞的筛选采用筛选培养基：HAT培养基H-次黄嘌呤、A-氨基喋呤、T-胸腺嘧啶只有融合成功的细胞（杂交瘤）才能在HAT培养基上长期生长，原因在于只有杂交瘤能成功合成DNA。

3.杂交瘤细胞的筛选采用筛选培养基：HAT培养基109DNA合成途径内源性途径（主要途径）利用谷氨酰胺（Gln）或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下合成DNA

(氨基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，因此能有效阻断DNA的合成)。外源性途径（补救途径）利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）或TK（胸腺嘧啶激酶）的催化作用下补救合成DNADNA合成途径内源性途径（主要途径）110融合后细胞在HAT培养基中存活情况脾细胞（HGPRT+,TK+,能生长，但不能永生化）骨髓瘤细胞（HGPRT-,TK-，不能生长）杂交瘤细胞（HGPRT+,TK+，能生长，且能永生化）融合后细胞在HAT培养基中存活情况1114、杂交瘤细胞的筛选和克隆化

筛选：免疫荧光ELISA等

克隆化：有限稀释法单个细胞显微操作法软琼脂培养法4、杂交瘤细胞的筛选和克隆化112配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml)+细胞冻存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏5.杂交瘤细胞的冻存与复苏配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml)+细胞冻1136.单克隆抗体的生产

体内：BALB/c小鼠体内诱发含有单抗的腹水体外：无血清培养基悬浮培养等7.单克隆抗体的纯化

硫酸铵沉淀法离子交换层析A蛋白-Sepharose亲和层析6.单克隆抗体的生产114抗体的制备与应用课件115单克隆抗体（McAb）的优缺点优点：成分、结构均一，特异性强。一种McAb分子的所有区域完全相同，只针对一种抗原决定基，避免了交叉反应。效价高使用一种抗原免疫动物，可以获得针对不同抗原决定基的不同特异性的McAb。杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖、传代，因此产量高，可连续生产单克隆抗体（McAb）的优缺点116缺点：制备McAb成本昂贵，制备流程长，操作烦琐，技术要求较高。McAb为鼠源性，应用于人体将产生人抗鼠抗体（Humananti-mouseantibody,HAMA）,治疗中可能引起过敏反应且疗效大大降低。抗体为全Ig，相对分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效杀伤浓度。缺点：117单克隆抗体在医学上的应用（一）用作诊断试剂

1.检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。2.鉴定病原体，准确诊断传染病。3.用于肿瘤的诊断和分型4.激素类单抗用于测定体内激素含量，判断内分泌的功能状态

单克隆抗体在医学上的应用（一）用作诊断试剂118（二）用作研究工具纯化抗原分析和探查抗原结构分析抗原决定基的功能（三）用于疾病的治疗抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗（二）用作研究工具119单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题单克隆抗体的特异性由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应异种抗体反应鼠源性单抗用于人体，导致超敏反应生产成本高,技术要求高，稳定性差，难于普及应用单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题120第三节基因工程抗体的制备与应用

(geneticengineeringantibody，GeAb)

概念：利用基因工程及蛋白工程技术，对抗体基因进行改造，按人们需要重新组装抗体或抗体基因片段，并转化适当的受体细胞后表达的规模化抗体。基本原理：利用分子生物学技术分离纯化抗体基因或基因片段，在最大限度保留其抗原结合活性，降低其异源性的原则指导下，按临床或科研需要对抗体基因进行拼接组装，在转化适当的受体细胞表达，制备具有不同大小和不同功能的抗体。第三节基因工程抗体的制备与应用

(geneticeng121基因工程抗体产生的时代背景1、单克隆抗体的毒副作用2、人杂交瘤技术未获真正突破:融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫3、现代免疫学和分子生物学技术的推动4、基因工程抗体的优点基因工程抗体产生的时代背景122基因工程抗体的优点：易于获得稀有抗体;人抗鼠抗体反应（Humananti－mouseantibodyreaciton,HAMAR）低;小分子抗体：渗透力强、HAMAR低、亲和性高、靶向性高、组织非特结合少等。基因工程抗体的优点：123基因工程抗体的分类1、全抗体（1）嵌和抗体（chimericantibody）（2）人源化抗体（humanizedantibody）2、小分子抗体（1）Fab（2）ScFv（3）单域抗体（4）分子识别单位基因工程抗体的分类1243、其它抗体多价微型抗体双链抗体（diabody）微型抗体(minibody)三链抗体(triabody)新型抗体分子新效能抗体双特异性抗体（bispecificantibody,BsAb）胞内抗体（intrabody）免疫黏连素（immunoadhesin）催化抗体（catalyticantibody）3、其它抗体多价微型抗体125抗体的制备与应用课件126一、基因工程全抗体一、基因工程全抗体127基因工程全抗体研发的演变历程鼠抗体100%鼠源鼠/人崁合抗体(66-75%人源)人源化抗体(90-95%人源)100%人源基因工程全抗体研发的演变历程鼠抗体鼠/人崁合抗体人源化抗体1128（一）嵌和抗体（chimericantibody)

1、概念指由两种不同种系来源的基因所编码的抗体。2、原理从鼠源的单克隆抗体杂交瘤细胞株分离并鉴定抗体V区基因，再通过适当的技术将其连接到人抗体C区基因上，构建Vm（mouse）-Ch（human）嵌和基因，并转入适当的受体细胞表达。（一）嵌和抗体（chimericantibody)129嵌合抗体嵌合抗体130抗体的制备与应用课件1313、嵌和抗体的优缺点：优点：特异性强亲和性高具有全抗体的所有功能半衰期长、疗效显著缺点：有10－50%发生HAMA靶向性差3、嵌和抗体的优缺点：132（二）人源化抗体（humanizedantibody）1、概念指利用基因工程技术，在嵌合抗体基础上，针对嵌合抗体仍然具有较高的HAMA反应的问题，进一步对抗体进行CDR及FR区域置换。通过这种方式获得的抗体人源部分可达97%，又称为CDR移植抗体（CDRgraftingantibody）。2、原理首先利用计算机模建技术，模拟抗体立体结构。再根据同源性原理从人抗体基因库中筛选人FR序列。通过分子模拟技术鉴别出与抗原结合位点密切相关的鼠单抗FR上氨基酸残基，将这些残基与CDR重组并一同移植到人FR上。（二）人源化抗体（humanizedantibody）133抗体的制备与应用课件1343、方法

在抗体可变区，具有较高变异的是位于超变区内（互补决定区，CDR）少数核心氨基酸，它决定了抗体的特异性，而可变区中的“框架区（FR）”则决定了可变区的三维空间结构。通过同源蛋白三维结构模建技术预测抗体可变区三维结构后，对鼠及人VH、VL表面容易引起较强免疫反应的氨基酸进行比较分析，进行人源化分子设计。3、方法135二、基因工程小分子抗体二、基因工程小分子抗体136小分子抗体1．Fab抗体片段2．单链抗体（singlechainFv,ScFv）3．单域抗体（singledomainantibody）4．分子识别单位（molecularrecognizationunit,MRU）

小分子抗体1．Fab抗体片段137（一）Fab抗体

由V链的VH、CH1及完整的L链构成（一）Fab抗体138优点：分子小，HAMAR低亲和性高靶向性高于McAb缺点：仍然有一定的HAMAR发生靶向性不如ScFv稳定性差优点：139（二）单链抗体（ScFv）概念是指通过特定的方法将抗体分子VH和VL连接在一起构成的只有一条链的抗体。优点：克服了HAMAR的问题分子量小、渗透性高，靶向性增加ScFv可保留较高活性在体内半衰期长、稳定性高没有Fc段，非特异结合减少，在肿瘤导向治疗及成像诊断中有特别的意义（二）单链抗体（ScFv）140类型（1）二硫键稳定的单链抗体(dsFv）（2）由连接肽连接的单链抗体（ScFv）类型1411、dsFv（二硫键稳定的单链抗体）利用基因突变技术在VH和VL上加入半胱氨酸，利用两者形成的二硫键将VH和VL连接在一起。突变部位的确定：由Jung等人在1994年用分子模建技术确定：VH44/VL100及VH105/VL43。1、dsFv（二硫键稳定的单链抗体）142抗体的制备与应用课件1432、ScFv（由连接肽连接的单链抗体）2、ScFv（由连接肽连接的单链抗体）144

Linker的设计原则长度和性质以不干扰VH和VL的折叠和不影响抗原结合部位的功能为标准。过短的接头会影响VH和VL之间的相互作用，过长的接头会影响抗体与抗原的结合，而且易受酶水解，不稳定。接头中尽量不含疏水氨基酸。常采用3次重复出现的4个甘氨酸和1个丝氨酸即（Gly4Ser）3,的15氨基酸接头。

Linker的设计原则145（三）单域抗体只有一个VH或VL的抗体，通常为VH（三）单域抗体只有一个VH或VL的抗体，通常为VH146（四）分子识别单位只有一个CDR，通常为CDR3（四）分子识别单位只有一个CDR，通常为CDR3147三、其它基因工程抗体多价微型抗体双链抗体（diabody）微型抗体(minibody)三链抗体(triabody)新型抗体分子新效能抗体双特异性抗体（bispecificantibody,BsAb）胞内抗体（intrabody）免疫黏连素（immunoadhesin）催化抗体（catalyticantibody）三、其它基因工程抗体多价微型抗体148（一）多价微型抗体1．双链抗体（diabody）2．微型抗体(minibody)3．三链抗体(triabody)（一）多价微型抗体1．双链抗体（diabody）1491．双链抗体（diabody）双链抗体是通过化学铰链、黏性蛋白结构域融合法和接头长度控制三种主要手段将两个ScFv通过非共价键结合形成刚性、稳定的二聚体结构。具有两个抗原结合位点，分子量约60KD。具有穿透力强的优势，易于通过血管壁进入实体瘤。与ScFv比较，其肾脏的清除速度减慢。具有更大的临床应用价值。

1．双链抗体（diabod