基因芯片概述课件

基因芯片

GeneChip基因芯片

GeneChip1什么是基因芯片？基因芯片是干嘛的？基因芯片是啥样的？基因芯片咋做的？基因芯片怎么分析的？我零花钱较多，去哪买个完整基因芯片系统耍耍？什么是基因芯片？基因芯片是干嘛的？基因芯片是啥样的？基因芯片2

定义基因芯片概述

原理

分类基因芯片的应用

载体的准备基因芯片的设计

基因探针的准备

点样及点样后处理基因芯片图片获取及图像分析配置基因芯片系统

3基因芯片概述课件41基因芯片概述

随着人类基因组计划（HPG）的提前完成以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而,怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此，建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。人类基因组计划催生了基因芯片技术。基因芯片近年来又常被称为DNA微阵列（DNAMicroarray）或DNA微阵列芯片。1基因芯片概述随着人类基因组计划（HP51.1基因芯片的定义

基因芯片又称DNA芯片（DNAChip）,是指将大量特定的寡核苷酸探针分子有序地、高密地固定于支持物上，然后与进行了标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而对靶分子的序列和数量进行分析。生物芯片起源于基因芯片。所谓生物芯片指高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子（如寡核苷酸、基因片段、cDNA或多肽、蛋白质）的微阵列，阵列中每个分子的序列及位置都是已知的，并且是预先设定好的。1.1基因芯片的定义6基因芯片概述课件71.2基因芯片的原理

1.2基因芯片的原理8

基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列,据此可重组出靶核酸的序列。大规模基因测序或多态性分析时，每个核苷酸或突变点都必须检测出来。因此，通常设计出一套大量的核苷酸探针，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点的碱基设计上有所不同，根据每套探针在每个位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。如果基因芯片仅是用于检测基因表达的差异，只需设计出针对基因中特定区域的几套寡聚核苷酸即可。

基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通91.3基因芯片的分类

由于基因芯片的制备方法和应用范围的不同，可以将基因芯片依据不同的标准分为不同的种类。按载体材料区分：1）固定在聚合物膜（如尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的膜芯片。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致,相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。2）固定在玻璃板上的玻璃芯片。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。3）固定在硅板上的硅芯片。4）固定在陶瓷表面的陶瓷芯片等。1.3基因芯片的分类由于基因芯片的制备10

按制作方法区分：原位合成芯片、直接点样法芯片等。按载体上探针的种类区分：寡聚核苷酸芯片和cDNA芯片等。按应用又可分为表达谱芯片和检测芯片。平常所说的基因表达谱芯片其实是从应用上讲，可用于对基因及其表达的量进行检测的芯片，寡聚核苷酸芯片和cDNA芯片都可用于表达谱研究，一般而言，基因表达谱芯片主要用于研究基因的功能，是指将待测及对照组的mRNA通过逆转录将荧光分别标记到两种组织的cDNA上，并与基因芯片进行杂交及荧光信号扫描，通过计算机处理就能确定芯片上的基因结合了探针的量，从而来判定此基因是否表达，或在两种组织中的表达是否有变化。

按制作方法区分：原位合成芯片、直接点样112基因芯片的应用

2.1基因表达分析

基因芯片具有高度的敏感性和特异性，它可以监测细胞中几个至几千个mRNA拷贝的转录情况。与用单探针分析mRNA的点杂交技术不同，基因芯片表达探针阵列应用了大约20对寡核苷酸探针来监测每一个mRNA的转录情况。每对探针中，包含一个与所要监测的mRNA完全吻合和一个不完全吻合的探针，这两个探针的差别在于其中间位置的核苷酸不同。比如通过基因芯片绘出基因表达的时空图谱，有助于人类认识生命活动过程和特征；检测基因表达的差异；发现新基因以及进行大规模基因测序等。2基因芯片的应用2.1基因表达分析12

Kanako等利用一个寡聚DNA芯片成功地对普通小麦在盐害逆境中的基因转录图谱进行了分析，最终得到的小麦的转录信息也具有极高的可靠性。Girke等利用基因芯片研究了拟南芥种子发育过程中的基因表达。

Wang等利用5766个cDNA微阵列研究比较正常卵巢和肿瘤卵巢组织基因表达差异,发现了几个和卵巢肿瘤进展相关的基因,为卵巢癌的诊断和治疗提供了新的指导。

Kanako等利用一个寡聚DNA芯片成功地132.2基因型、基因突变和多态性分析

在同一物种不同种群和个体之间，有着多种不同的基因型，而这种不同，往往与个体的不同性状和多种遗传性疾病有着密切的关系。通过对大量具有不同性状的个体的基因型进行比较，就可以得出基因与性状的关系。但是，由于大多数性状和遗传性疾病是由多个基因同时决定的，因此分析起来就十分困难，然而基因芯片技术恰恰解决了这一问题，利用其可以同时反应数千甚至更多个基因的特性，我们就可以分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系。

Halushka等用高密度芯片检测75个非洲和北欧居民的28mb的基因序列,结果获得了1480个等位基因,对人类基因中的SNP性质、图像进行了系统全面的扫描,并试图寻找基因与血压异常性疾病的关系。2.2基因型、基因突变和多态性分析142.3疾病的诊断与治疗

人类的疾病与遗传基因密切相关，基因芯片可以对遗传信息进行快速准确的分析，因此它在疾病的分子诊断中的优势是不言而喻的，是一种新的、强有力的分子工具。基因芯片技术已经被应用于感染性疾病、肿瘤、耐药菌株及耐药性的检测等方面的研究。

Hacia等利用96000种20mer的DNA芯片检测遗传性乳腺癌和卵巢癌基因。在15例患者样品中，发现了14例存在着基因突变，检测准确率达到了99%，这也说明基因芯片技术能够快速准确扫描大量基因，适用于临床试验中的大量患者标本的检测。Falus等利用基因芯片技术来诊断地中海贫血患者体内β-珠蛋白基因的突变，适用于大样本量患者的筛查，高自动化而且准确性极高，他们用红色荧光来标记探针，同时用红色荧光来标记靶基因，这样完全杂交的分子会产生黄色荧光信号，突变可通过分析两种荧光强度的对比度来区分。

2.3疾病的诊断与治疗152.4药物研究中的应用

从经济效益来说，最大的应用领域可能是制药厂用来开发新药。所以已经有多家制药企业介入芯片的开发。如：IncytePharmaaceuticalsInc.，SequanaTherapeutics，MilleniumPharmaceuticalsInc.等。对于寻找新药来说，目标之一是应用芯片可以在基因水平上寻找药物靶标。

Gray

等把基因芯片药物设计和组合化学集成在一起,针对鹅去氧胆酸28p的活性位点设计新的化学制剂,检测了它们在基因组水平上对生物体的影响,就得到了其二类结构。这足以说明，随着基因芯片技术的不断完善，在分子水平上进行药物研究必将达到一个新的高度。2.4药物研究中的应用16探针设计解决杂交条件一致性问题芯片优化提高芯片制备效率公共数据库专用数据库确定目标选择待检测的目标序列数据分析分析杂交检测结果及可靠性基因芯片数据库图像处理数据库查询序列分析生物信息学数据挖掘数据可视化杂交检测图像基因芯片数据流图探针设计芯片优化公共数据库专用数据库确定173基因芯片的设计

载体的准备研究目标的确定基因探针的准备探针的选择和设计参照体系的设计点样及点样后处理3基因芯片的设计183.1载体的准备

制备基因芯片，首先要选择一个合适的固相支持物-载体，以供基因能在上面进行杂交反应，一般的载体包括膜、玻片、塑料、陶瓷及硅等。目前，经过化学修饰的玻片越来越成为人们青睐的对象，比如进行多聚赖氨酸修饰、APS氨基修饰、APS-PDC（异硫氰酸）修饰、APS-GA（戊二醛）修饰以及硫基修饰等，它具有其它载体所不能比拟的诸多优点。很多商业公司可提供修饰好可直接用于基因芯片点样的玻片：比如TeleChem公司、Schott公司和FullMoon公司等。3.1载体的准备19

DNA样品共价链接于载体上可耐受高温、高离子强度不可侵润性，提高退火质量荧光信号本底低，背景干扰弱可使用双杂交系统进行样本平行处理点样密度非常高表面平整，易于实现自动化点样方便，成本较低DNA样品共价链接于载体上203.2基因探针的准备▲研究目标的确定根据不同的实验目的，要设计不同类型的基因芯片，即表达谱芯片还是检测芯片。前者用于检测基因的表达状况，而后者主要用于检测特定基因的突变是否存在。表达谱芯片是目前最成功商业化的基因芯片，和检测芯片一样，表达谱芯片也是检测一群特定的基因，但不同的是，表达谱芯片的检测对象是mRNA，即基因表达的产物。而且要应用双色荧光系统，表达谱芯片可以检测某个基因在两个样本中表达的差异。因此，研究者应当从自己的具体研究出发，设计出符合实验要求的基因芯片。3.2基因探针的准备21▲探针的选择与设计

探针的设计是芯片设计中的核心，探针的特异性决定芯片杂交结果的特异性，同时根据不同的研究目的，探针在选择特异性区域和保守区域时应各有侧重点。另外，探针设计还与检测的灵敏度和稳定性密切相关。就探针的来源，目前比较常用的有cDNA探针和寡核苷酸探针。

cDNA探针就是与mRNA互补的DNA，由逆转录方法获得，一般被认为是真实表达的基因。完整cDNA的长度从几百个碱基对到几千个碱基对之间，由于cDNA文库构建技术已经相当成熟，人们比较容易获得一个组织或个体大量种类的cDNA，这些从文库中扩增的得到的cDNA经纯化、检测、定量分析后溶解在适当的缓冲液中，可作为探针在点样法制备基因芯片时直接使用。▲探针的选择与设计22寡核苷酸探针是人工合成的，随意性好，设计创意的空间也大。设计寡核苷酸探针时，研究人员必须要对该基因有着充分的了解。是选择基因的保守区域还是特异性区域、是一段还是几段、是保留突变点还是另引入新的突变位点等，都要求实验人员根据自己的实际要求来考虑。一般来说，寡核苷酸探针既可以用于检测芯片的制备，也可用于表达谱芯片的制备。长度一般选取在15～70mer左右的片段，探针往往在5端进行氨基修饰，考虑探针在杂交过程中的自由度，在探针的5端氨基后紧跟12个碳原子。探针的杂交区域应尽量避免存在二聚体结构。目前比较通用的DNA合成方法是亚磷酰胺三酯法，合成每个单核苷酸都需要四步以上的操作。美国安捷伦以及国内的赛百盛等公司都可提供寡核苷酸合成服务。当然，如果自己拥有一台DNA合成仪的话，就可以随时依照自己的意愿来合成目的寡核苷酸片段。寡核苷酸探针是人工合成的，随意性好，设计创意的空23▲参照体系的选择一套合适的参照体系的运用，既保证了基因芯片质量的稳定性，又保证了其在不同实验条件下的可对比性。◆阳性对照：一般选用管家基因，是指基因表达水平比较稳定，不太受环境变化而产生变化的一类基因，它能保证各种芯片杂交试验中基本都能保证表达的稳定性，因而它们在各芯片上的信号应该保持一致，以它们作为校验标准，可以保证同一芯片上不同杂交样品间或不同芯片的杂交样品间表达信号的可对比性。◆阴性对照：一般选用与所研究基因无同源性的其它种属的基因作为对照。◆空白对照：一般选用不含任何基因的点样稀释液，空白对照可以作为分析芯片杂交结果时本底信号的参照。▲参照体系的选择243.3点样及点样后处理所谓点样，就是指利用点样仪将已经得到的探针序列通过接触式针点或非接触式喷点的方法点到预先进行过化学修饰的基因芯片载体上。在基因芯片的制备过程中，对点完样的芯片进行后处理是其最后一道工序，也是其中非常关键的一道工序。点样后处理的目的主要是为了使探针能与载体表面牢固结合，同时，还对载体上未与探针结合的游离活性基团进行封闭以避免在杂交过程中非特异性的吸附对实验结果（特别是背景）造成大的影响。因此，基因芯片点样后处理的结果直接影响了实验结果的好坏。更高的探针固定率可提高杂交时的灵敏度；而封闭效果好的芯片在杂交后的背景特别干净，所得到的结果也就相对更为可靠。3.3点样及点样后处理25基因芯片概述课件26基因芯片概述课件27

一般玻片点样后处理的的步骤为：再水合紫外交联室温晾干洗涤剂洗涤

双蒸水洗涤室温晾干封闭液封闭

室温晾干双蒸水洗涤

而一般膜芯片的点样后处理就相对比较简单：80烘干（固定样品）缓冲液中和

室温晾干双蒸水洗涤

一般玻片点样后处理的的步骤为：28

待测样品的靶基因在与基因芯片退火杂交之前必须要进行分离、扩增和逆转录，然后再进行标记。新近发展的多的荧光标记方法用不同激发波长的荧光素对不同来源的靶基因进行标记，可以更直观地比较不同来源样品的基因表达差异。目前虽然已经报道出了诸多可以用来标记的靶基因的荧光或其它标记物，但用的最多的且效果较好的是Cy3和Cy5，它们不但具有很好的荧光强度，而且可以尽可能少的与探针或载体粘连。其实对靶基因进行标记后，它们本身并不是红色或绿色的，而是经过扫描仪的扫描处理后才显现出了我们所预期的颜色。待测样品的靶基因在与基因芯片退火杂交之前29基因芯片概述课件304基因芯片图片获取及图像分析▲图片获取

完成基因芯片的制备后，下一步便是根据不同的研究目的设计和选择实验标本（包括组织、细胞等），然后通过各种方法对其标记上染料分子（多用荧光分子）或同位素（32P、33P），与基因芯片进行杂交。对于用荧光标记的标本，其杂交结果可通过专门的芯片扫描仪进行扫描得到，常用的扫描仪主要有基于PMT（光电倍增管）和CCD（电耦合器件）作为感光器件的两种。下面是一张典型的cDNA基因芯片的图像：4基因芯片图片获取及图像分析▲图片获取31基因芯片概述课件32▲样点的识别

但光学扫描仪扫出的芯片图像并没有给出各个样点的信号值、背景值和荧光信号比等信息，必须通过进一步的图像处理提取并得到各个样点的相应数据信息，供进一步的统计分析。因此，芯片图像处理的主要目的是量化芯片上样点的具体信息。芯片图像的处理首先要识别样点并确定样点的位置。样点识别的第一步是生成网格或圆，以确定样点的大概位置。根据芯片上行和列的数目，由计算机自动生成一个网格或圆，每个网格或圆就为每个点提供了一个相对位置的坐标。样点位置确定后，还得对样点进行识别，主要是对网格或圆按照一定的规则不断的调节大小，找出最合适的位置和大小，使之正好与样点一样大。如下图所示：▲样点的识别33基因芯片概述课件34基因芯片概述课件35基因芯片概述课件36基因芯片概述课件37基因芯片概述课件38▲确定属于信号和背景的像素在样点识别并定位后，点内的区域和周围的一部分区域内的像素就用来计算信号和背景强度，所以样点代表的基因表达情况是由样点的信号值扣除背景值得到的。厂家软件名称BiodiscoveryInc.ImaGenImaGenImagingResearchInc.ArrayVisionArrayVisionTheInstituteofGenomicResearchTIGRSpotfinderTIGRSpotfinderAxonInstrumentsInc.GenePixProGenePixProBioscienceQuantArrayQuantArrayMediaCyberneticArrayProAnalyzerArrayProAnalyzerStanfordUniversityScanalyse▲确定属于信号和背景的像素厂家软件名称Biodisco39▲图像数据的预处理

在得到代表基因表达情况的数据后，应当对数据进行预先处理。目的就是要将一些质量很低、数据可能不准确的点予以清除；还要对芯片进行归一化校正处理；另外还可以用散点图先观察数据的特性，做一些预先的分析准备工作。以cDNA芯片为例，其常用散点图表示在两个组织中基因表达量的比例信息。如果两个样本组织的表达程度一致，那么散点集中在通过远点的斜率为1的直线附近，如果不为1，说明两种荧光标记有一个系统误差，可以通过软件来校正。数据的预处理还包括设定一个阈值来判断真正的弱信号点后，以及利用LOWESS函数来对芯片进行校正。最后再进行相应的数据分析。▲图像数据的预处理40基因芯片概述课件41基因芯片概述课件42基因芯片概述课件43▲图像数据的统计分析

经过预处理的芯片数据，其实还是枯燥无味、难以理解的。需要采用相应的芯片数据分析对其进行分析、判断和推理，从而可以确定很多信息。例如，可以通过分析正常组织与肿瘤组织的差异表达来确定基因DNA的变化情况，可以通过聚类分析进而确定肿瘤的不同亚型。厂家软件名称BiodiscoveryInc.ImaGenGenSightImagingResearchInc.ArrayVisionArrayStatTIGRArrayViewerTIGRAppliedMathesGeneMathesSiliconGeneticsGeneSpringEuropenBioinformaticsInstituteExpressionStanfordUniversity

Cluster&Treeview▲图像数据的统计分析厂家软件名称Biodiscovery44基因芯片概述课件45▲基因芯片数据库

基因芯片包括了成千上万个样点的信息，对应于这些基因的序列信息及图像处理得到的信息；对于cDNA芯片还包括两种荧光的比例信息；同时，芯片制作的目的、制作条件和方法、样品的制备、杂交条件、以及检测条件等均与该芯片相对应；此外还有基因芯片数据处理与信息提取的结果等，在芯片的制作测定前与测定后都有大量的信息数据需要处理，没有专门的数据库是难以想象的。目前比较常用的芯片数据库有许多，比如：ArrayExpress、ChipDB、ExpressDB、GeneExpressionAtlas、GeneX、Read、GeneExpressionOmnibus、M-CHiPS以及StandfordMicroarray等。▲基因芯片数据库46在这些基因数据库中，除了存有基因序列信息、样本信息、实验操作信息、数据提取信息等必备信息外，有的数据库还与芯片扫描仪联机，自动将芯片扫描的结果输入数据库，进行积累。但要真正实现这些数据的共享，就必须要有一个统一的标准来规范基因芯片的实验数据格式、处理用的统计软件以及归一化方法等。基于这种目的，最为著名的关于基因芯片实验的最低限度信息MIAME（MinimumInformationaboutAMicroarrayExperiment）就相应的诞生了，它是由MGED（MicroarrayGeneExperssionDataSociety）提出的，建议所有芯片生产厂家、软硬件供应商和研究人员都应采用该标准，以促进高质量、注释完全的芯片数据的共享。在这些基因数据库中，除了存有基因序列信47▲通用数据库

近年来大量生物学实验数据的积累，形成了当前数以百计的生物信息数据库。它们各自按一定的目标收集和整理生物学实验数据，并提供相关的数据查询、数据处理的服务。同时随着因特网的普及，这些数据库大多可以通过网络或网络下载来访问。通过差异筛选或聚类分析后，从基因芯片中筛选出自己感兴趣的基因后，就面临着深入了解这批基因功能信息的问题。例如，在基因表达谱芯片实验后拿到自己需要的基因后，一般会获得这个基因的GenBank号，这些信息就像一把钥匙一样，只要拥有其中一项信息，通过前面以介绍到的公共数据库中进行查询并结合一些生物信息分析，就能获得这个基因的相关功能的研究信息。▲通用数据库48

三大国际一级生物信息数据库，即美国国家信息中心(NationalCenterofBiotechnologyInformation,NCBI)的GenBank(Http:///web/GenBank/index.html）、欧洲分子生物学室验室(EuropeanMolecularBiologyLaboratory-Euro-peanBioinformaticsInstitute,EMBL-EBI)的EM-BL(http://www.ebi.ac.uk/databases/index.html

)和日本DNA数据库(DNADataBankofJapan,DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp

)新收录的核酸序列数据中，EST占65%以上。下面就以玉米过氧化氢酶3在Entrez中的检索和在BLASTA中的相似性比对来介绍一下：

49玉米过氧化氢酶3序列的检索：（1）调用Internet浏览器并在其地址栏输入Entrez网址：/Entrez；（2）在Search后的选择栏中选择protein；（3）在输入栏输入maizecatalase3；（4）点击go后显示序列接受号及序列名称；（5）点击序列的某接受号后显示序列详细信息；/Entrez玉米过氧化氢酶3序列的检索：50玉米过氧化氢酶3序列序列的蛋白质同源性分析：（1）进入NCBI/Blast网页：http://www.ebi.ac.uk/fasta33/index.html（2）选择Protein-proteinBLAST(blastp)；（3）将FASTA格式序列贴入输入栏；（4）点击BLAST；（5）查看与之同源的蛋白质；

http://www.ebi.ac.uk/fasta33/index.html玉米过氧化氢酶3序列序列的蛋白质同源性分析：51基因芯片概述课件525配置基因芯片系统▲配置点样仪●晶芯®SmartArrayerTM48微阵列芯片点样系统

供应商：博奥生物有限公司

●基因芯片点样仪

供应商：北京金欧亚科技发展有限公司

●芯片点样仪VersArrayChipWriterCompact

供应商：伯乐生命医学产品（上海）有限公司

5配置基因芯片系统▲配置点样仪53▲配置杂交仪●全自动基因芯片杂交仪

生产商/产地：美国GE

供应商：北京金欧亚科技发展有限公司

●芯片温育器2009/3/25生产商/产地：美国

供应商：北京托摩根生物科技有限公司

●芯片杂交仪2009/3/25生产商/产地：美国

供应商：北京托摩根生物科技有限公司

▲配置杂交仪54▲配置基因芯片●MicroRNA微阵列芯片(SangermiRBase13.0版03/2009)

09年3月9日，Sanger

microRNA数据库升级至13.0版。生产商/产地：美国

供应商：联川生物技术有限公司

●MallRNA测序(Solexa高通量测序)

生产商/产地：美国

供应商：联川生物技术公司

●安捷伦ChIP芯片

生产商/产地：美国

供应商：安捷伦科技有限公司

▲配置基因芯片55▲配置基因芯片扫描仪

●晶芯®EcoScanTM-100CCD扫描仪

生产商/产地：北京

供应商：博奥生物有限公司

●晶芯®LuxScanTM10K微阵列芯片扫描仪

生产商/产地：北京

供应商：博奥生物有限公司

●安捷伦基因芯片-微阵列扫描仪

生产商/产地：美国

供应商：安捷伦科技有限公司

▲配置基因芯片扫描仪56ThankyouThankyou57基因芯片

GeneChip基因芯片

GeneChip58什么是基因芯片？基因芯片是干嘛的？基因芯片是啥样的？基因芯片咋做的？基因芯片怎么分析的？我零花钱较多，去哪买个完整基因芯片系统耍耍？什么是基因芯片？基因芯片是干嘛的？基因芯片是啥样的？基因芯片59

定义基因芯片概述

原理

分类基因芯片的应用

载体的准备基因芯片的设计

基因探针的准备

点样及点样后处理基因芯片图片获取及图像分析配置基因芯片系统

60基因芯片概述课件611基因芯片概述

随着人类基因组计划（HPG）的提前完成以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而,怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此，建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。人类基因组计划催生了基因芯片技术。基因芯片近年来又常被称为DNA微阵列（DNAMicroarray）或DNA微阵列芯片。1基因芯片概述随着人类基因组计划（HP621.1基因芯片的定义

基因芯片又称DNA芯片（DNAChip）,是指将大量特定的寡核苷酸探针分子有序地、高密地固定于支持物上，然后与进行了标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而对靶分子的序列和数量进行分析。生物芯片起源于基因芯片。所谓生物芯片指高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子（如寡核苷酸、基因片段、cDNA或多肽、蛋白质）的微阵列，阵列中每个分子的序列及位置都是已知的，并且是预先设定好的。1.1基因芯片的定义63基因芯片概述课件641.2基因芯片的原理

1.2基因芯片的原理65

基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列,据此可重组出靶核酸的序列。大规模基因测序或多态性分析时，每个核苷酸或突变点都必须检测出来。因此，通常设计出一套大量的核苷酸探针，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点的碱基设计上有所不同，根据每套探针在每个位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。如果基因芯片仅是用于检测基因表达的差异，只需设计出针对基因中特定区域的几套寡聚核苷酸即可。

基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通661.3基因芯片的分类

由于基因芯片的制备方法和应用范围的不同，可以将基因芯片依据不同的标准分为不同的种类。按载体材料区分：1）固定在聚合物膜（如尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的膜芯片。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致,相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。2）固定在玻璃板上的玻璃芯片。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。3）固定在硅板上的硅芯片。4）固定在陶瓷表面的陶瓷芯片等。1.3基因芯片的分类由于基因芯片的制备67

按制作方法区分：原位合成芯片、直接点样法芯片等。按载体上探针的种类区分：寡聚核苷酸芯片和cDNA芯片等。按应用又可分为表达谱芯片和检测芯片。平常所说的基因表达谱芯片其实是从应用上讲，可用于对基因及其表达的量进行检测的芯片，寡聚核苷酸芯片和cDNA芯片都可用于表达谱研究，一般而言，基因表达谱芯片主要用于研究基因的功能，是指将待测及对照组的mRNA通过逆转录将荧光分别标记到两种组织的cDNA上，并与基因芯片进行杂交及荧光信号扫描，通过计算机处理就能确定芯片上的基因结合了探针的量，从而来判定此基因是否表达，或在两种组织中的表达是否有变化。

按制作方法区分：原位合成芯片、直接点样682基因芯片的应用

2.1基因表达分析

基因芯片具有高度的敏感性和特异性，它可以监测细胞中几个至几千个mRNA拷贝的转录情况。与用单探针分析mRNA的点杂交技术不同，基因芯片表达探针阵列应用了大约20对寡核苷酸探针来监测每一个mRNA的转录情况。每对探针中，包含一个与所要监测的mRNA完全吻合和一个不完全吻合的探针，这两个探针的差别在于其中间位置的核苷酸不同。比如通过基因芯片绘出基因表达的时空图谱，有助于人类认识生命活动过程和特征；检测基因表达的差异；发现新基因以及进行大规模基因测序等。2基因芯片的应用2.1基因表达分析69

Kanako等利用一个寡聚DNA芯片成功地对普通小麦在盐害逆境中的基因转录图谱进行了分析，最终得到的小麦的转录信息也具有极高的可靠性。Girke等利用基因芯片研究了拟南芥种子发育过程中的基因表达。

Wang等利用5766个cDNA微阵列研究比较正常卵巢和肿瘤卵巢组织基因表达差异,发现了几个和卵巢肿瘤进展相关的基因,为卵巢癌的诊断和治疗提供了新的指导。

Kanako等利用一个寡聚DNA芯片成功地702.2基因型、基因突变和多态性分析

在同一物种不同种群和个体之间，有着多种不同的基因型，而这种不同，往往与个体的不同性状和多种遗传性疾病有着密切的关系。通过对大量具有不同性状的个体的基因型进行比较，就可以得出基因与性状的关系。但是，由于大多数性状和遗传性疾病是由多个基因同时决定的，因此分析起来就十分困难，然而基因芯片技术恰恰解决了这一问题，利用其可以同时反应数千甚至更多个基因的特性，我们就可以分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系。

Halushka等用高密度芯片检测75个非洲和北欧居民的28mb的基因序列,结果获得了1480个等位基因,对人类基因中的SNP性质、图像进行了系统全面的扫描,并试图寻找基因与血压异常性疾病的关系。2.2基因型、基因突变和多态性分析712.3疾病的诊断与治疗

人类的疾病与遗传基因密切相关，基因芯片可以对遗传信息进行快速准确的分析，因此它在疾病的分子诊断中的优势是不言而喻的，是一种新的、强有力的分子工具。基因芯片技术已经被应用于感染性疾病、肿瘤、耐药菌株及耐药性的检测等方面的研究。

Hacia等利用96000种20mer的DNA芯片检测遗传性乳腺癌和卵巢癌基因。在15例患者样品中，发现了14例存在着基因突变，检测准确率达到了99%，这也说明基因芯片技术能够快速准确扫描大量基因，适用于临床试验中的大量患者标本的检测。Falus等利用基因芯片技术来诊断地中海贫血患者体内β-珠蛋白基因的突变，适用于大样本量患者的筛查，高自动化而且准确性极高，他们用红色荧光来标记探针，同时用红色荧光来标记靶基因，这样完全杂交的分子会产生黄色荧光信号，突变可通过分析两种荧光强度的对比度来区分。

2.3疾病的诊断与治疗722.4药物研究中的应用

从经济效益来说，最大的应用领域可能是制药厂用来开发新药。所以已经有多家制药企业介入芯片的开发。如：IncytePharmaaceuticalsInc.，SequanaTherapeutics，MilleniumPharmaceuticalsInc.等。对于寻找新药来说，目标之一是应用芯片可以在基因水平上寻找药物靶标。

Gray

等把基因芯片药物设计和组合化学集成在一起,针对鹅去氧胆酸28p的活性位点设计新的化学制剂,检测了它们在基因组水平上对生物体的影响,就得到了其二类结构。这足以说明，随着基因芯片技术的不断完善，在分子水平上进行药物研究必将达到一个新的高度。2.4药物研究中的应用73探针设计解决杂交条件一致性问题芯片优化提高芯片制备效率公共数据库专用数据库确定目标选择待检测的目标序列数据分析分析杂交检测结果及可靠性基因芯片数据库图像处理数据库查询序列分析生物信息学数据挖掘数据可视化杂交检测图像基因芯片数据流图探针设计芯片优化公共数据库专用数据库确定743基因芯片的设计

载体的准备研究目标的确定基因探针的准备探针的选择和设计参照体系的设计点样及点样后处理3基因芯片的设计753.1载体的准备

制备基因芯片，首先要选择一个合适的固相支持物-载体，以供基因能在上面进行杂交反应，一般的载体包括膜、玻片、塑料、陶瓷及硅等。目前，经过化学修饰的玻片越来越成为人们青睐的对象，比如进行多聚赖氨酸修饰、APS氨基修饰、APS-PDC（异硫氰酸）修饰、APS-GA（戊二醛）修饰以及硫基修饰等，它具有其它载体所不能比拟的诸多优点。很多商业公司可提供修饰好可直接用于基因芯片点样的玻片：比如TeleChem公司、Schott公司和FullMoon公司等。3.1载体的准备76

DNA样品共价链接于载体上可耐受高温、高离子强度不可侵润性，提高退火质量荧光信号本底低，背景干扰弱可使用双杂交系统进行样本平行处理点样密度非常高表面平整，易于实现自动化点样方便，成本较低DNA样品共价链接于载体上773.2基因探针的准备▲研究目标的确定根据不同的实验目的，要设计不同类型的基因芯片，即表达谱芯片还是检测芯片。前者用于检测基因的表达状况，而后者主要用于检测特定基因的突变是否存在。表达谱芯片是目前最成功商业化的基因芯片，和检测芯片一样，表达谱芯片也是检测一群特定的基因，但不同的是，表达谱芯片的检测对象是mRNA，即基因表达的产物。而且要应用双色荧光系统，表达谱芯片可以检测某个基因在两个样本中表达的差异。因此，研究者应当从自己的具体研究出发，设计出符合实验要求的基因芯片。3.2基因探针的准备78▲探针的选择与设计

探针的设计是芯片设计中的核心，探针的特异性决定芯片杂交结果的特异性，同时根据不同的研究目的，探针在选择特异性区域和保守区域时应各有侧重点。另外，探针设计还与检测的灵敏度和稳定性密切相关。就探针的来源，目前比较常用的有cDNA探针和寡核苷酸探针。

cDNA探针就是与mRNA互补的DNA，由逆转录方法获得，一般被认为是真实表达的基因。完整cDNA的长度从几百个碱基对到几千个碱基对之间，由于cDNA文库构建技术已经相当成熟，人们比较容易获得一个组织或个体大量种类的cDNA，这些从文库中扩增的得到的cDNA经纯化、检测、定量分析后溶解在适当的缓冲液中，可作为探针在点样法制备基因芯片时直接使用。▲探针的选择与设计79寡核苷酸探针是人工合成的，随意性好，设计创意的空间也大。设计寡核苷酸探针时，研究人员必须要对该基因有着充分的了解。是选择基因的保守区域还是特异性区域、是一段还是几段、是保留突变点还是另引入新的突变位点等，都要求实验人员根据自己的实际要求来考虑。一般来说，寡核苷酸探针既可以用于检测芯片的制备，也可用于表达谱芯片的制备。长度一般选取在15～70mer左右的片段，探针往往在5端进行氨基修饰，考虑探针在杂交过程中的自由度，在探针的5端氨基后紧跟12个碳原子。探针的杂交区域应尽量避免存在二聚体结构。目前比较通用的DNA合成方法是亚磷酰胺三酯法，合成每个单核苷酸都需要四步以上的操作。美国安捷伦以及国内的赛百盛等公司都可提供寡核苷酸合成服务。当然，如果自己拥有一台DNA合成仪的话，就可以随时依照自己的意愿来合成目的寡核苷酸片段。寡核苷酸探针是人工合成的，随意性好，设计创意的空80▲参照体系的选择一套合适的参照体系的运用，既保证了基因芯片质量的稳定性，又保证了其在不同实验条件下的可对比性。◆阳性对照：一般选用管家基因，是指基因表达水平比较稳定，不太受环境变化而产生变化的一类基因，它能保证各种芯片杂交试验中基本都能保证表达的稳定性，因而它们在各芯片上的信号应该保持一致，以它们作为校验标准，可以保证同一芯片上不同杂交样品间或不同芯片的杂交样品间表达信号的可对比性。◆阴性对照：一般选用与所研究基因无同源性的其它种属的基因作为对照。◆空白对照：一般选用不含任何基因的点样稀释液，空白对照可以作为分析芯片杂交结果时本底信号的参照。▲参照体系的选择813.3点样及点样后处理所谓点样，就是指利用点样仪将已经得到的探针序列通过接触式针点或非接触式喷点的方法点到预先进行过化学修饰的基因芯片载体上。在基因芯片的制备过程中，对点完样的芯片进行后处理是其最后一道工序，也是其中非常关键的一道工序。点样后处理的目的主要是为了使探针能与载体表面牢固结合，同时，还对载体上未与探针结合的游离活性基团进行封闭以避免在杂交过程中非特异性的吸附对实验结果（特别是背景）造成大的影响。因此，基因芯片点样后处理的结果直接影响了实验结果的好坏。更高的探针固定率可提高杂交时的灵敏度；而封闭效果好的芯片在杂交后的背景特别干净，所得到的结果也就相对更为可靠。3.3点样及点样后处理82基因芯片概述课件83基因芯片概述课件84

一般玻片点样后处理的的步骤为：再水合紫外交联室温晾干洗涤剂洗涤

双蒸水洗涤室温晾干封闭液封闭

室温晾干双蒸水洗涤

而一般膜芯片的点样后处理就相对比较简单：80烘干（固定样品）缓冲液中和

室温晾干双蒸水洗涤

一般玻片点样后处理的的步骤为：85

待测样品的靶基因在与基因芯片退火杂交之前必须要进行分离、扩增和逆转录，然后再进行标记。新近发展的多的荧光标记方法用不同激发波长的荧光素对不同来源的靶基因进行标记，可以更直观地比较不同来源样品的基因表达差异。目前虽然已经报道出了诸多可以用来标记的靶基因的荧光或其它标记物，但用的最多的且效果较好的是Cy3和Cy5，它们不但具有很好的荧光强度，而且可以尽可能少的与探针或载体粘连。其实对靶基因进行标记后，它们本身并不是红色或绿色的，而是经过扫描仪的扫描处理后才显现出了我们所预期的颜色。待测样品的靶基因在与基因芯片退火杂交之前86基因芯片概述课件874基因芯片图片获取及图像分析▲图片获取

完成基因芯片的制备后，下一步便是根据不同的研究目的设计和选择实验标本（包括组织、细胞等），然后通过各种方法对其标记上染料分子（多用荧光分子）或同位素（32P、33P），与基因芯片进行杂交。对于用荧光标记的标本，其杂交结果可通过专门的芯片扫描仪进行扫描得到，常用的扫描仪主要有基于PMT（光电倍增管）和CCD（电耦合器件）作为感光器件的两种。下面是一张典型的cDNA基因芯片的图像：4基因芯片图片获取及图像分析▲图片获取88基因芯片概述课件89▲样点的识别

但光学扫描仪扫出的芯片图像并没有给出各个样点的信号值、背景值和荧光信号比等信息，必须通过进一步的图像处理提取并得到各个样点的相应数据信息，供进一步的统计分析。因此，芯片图像处理的主要目的是量化芯片上样点的具体信息。芯片图像的处理首先要识别样点并确定样点的位置。样点识别的第一步是生成网格或圆，以确定样点的大概位置。根据芯片上行和列的数目，由计算机自动生成一个网格或圆，每个网格或圆就为每个点提供了一个相对位置的坐标。样点位置确定后，还得对样点进行识别，主要是对网格或圆按照一定的规则不断的调节大小，找出最合适的位置和大小，使之正好与样点一样大。如下图所示：▲样点的识别90基因芯片概述课件91基因芯片概述课件92基因芯片概述课件93基因芯片概述课件94基因芯片概述课件95▲确定属于信号和背景的像素在样点识别并定位后，点内的区域和周围的一部分区域内的像素就用来计算信号和背景强度，所以样点代表的基因表达情况是由样点的信号值扣除背景值得到的。厂家软件名称BiodiscoveryInc.ImaGenImaGenImagingResearchInc.ArrayVisionArrayVisionTheInstituteofGenomicResearchTIGRSpotfinderTIGRSpotfinderAxonInstrumentsInc.GenePixProGenePixProBioscienceQuantArrayQuantArrayMediaCyberneticArrayProAnalyzerArrayProAnalyzerStanfordUniversityScanalyse▲确定属于信号和背景的像素厂家软件名称Biodisco96▲图像数据的预处理

在得到代表基因表达情况的数据后，应当对数据进行预先处理。目的就是要将一些质量很低、数据可能不准确的点予以清除；还要对芯片进行归一化校正处理；另外还可以用散点图先观察数据的特性，做一些预先的分析准备工作。以cDNA芯片为例，其常用散点图表示在两个组织中基因表达量的比例信息。如果两个样本组织的表达程度一致，那么散点集中在通过远点的斜率为1的直线附近，如果不为1，说明两种荧光标记有一个系统误差，可以通过软件来校正。数据的预处理还包括设定一个阈值来判断真正的弱信号点后，以及利用LOWESS函数来对芯片进行校正。最后再进行相应的数据分析。▲图像数据的预处理97基因芯片概述课件98基因芯片概述课件99基因芯片概述课件100▲图像数据的统计分析

经过预处理的芯片数据，其实还是枯燥无味、难以理解的。需要采用相应的芯片数据分析对其进行分析、判断和推理，从而可以确定很多信息。例如，可以通过分析正常组织与肿瘤组织的差异表达来确定基因DNA的变化情况，可以通过聚类分析进而确定肿瘤的不同亚型。厂家软件名称BiodiscoveryInc.ImaGenGenSightImagingResearchInc.ArrayVisionArrayStatTIGRArrayViewerTIGRAppliedMathesGeneMathesSiliconGeneticsGeneSpringEuropenBioinformaticsInstituteExpressionStanfordUniversity

Cluster&Treeview▲图像数据的统计分析厂家软件名称Biodiscovery101基因芯片概述课件102▲基因芯片数据库

基因芯片包括了成千上万个样点的信息，对应于这些基因的序列信息及图像处理得到的信息；对于cDNA芯片还包括两种荧光的比例信息；同时，芯片制作的目的、制作条件和方法、样品的制备、杂交条件、以及检测条件等均与该芯片相对应；此外还有基因芯片数据处理与信息提取的结果等，在芯片的制作测定前与测定后都有大量的信息数据需要处理，没有专门的数据库是难以想象的。目前比较常用的芯片数据库有许多，比如：ArrayExpress、ChipDB、ExpressDB、GeneExpressionAtlas、GeneX、Read、GeneExpressionOmnibus、M-CHiPS以及StandfordMicroarray等。▲基因芯片数据库103在这些基因数据库中，除了存有基因序列信息、样本信息、实验操作信息、数据提取信息等必备信息外，有的数据库还与芯片扫描仪联机，自动将芯片扫描的结果输入数据库，进行积累。但要真正实现这些数据的共享，就必须要有一个统一的标准来规范基因芯片的实验数据格式、处理用的统计软件以及归一化方法等。基于这种目的，