第十章青霉素和头孢菌素培训课程课件

第十章青霉素和头孢菌素第十章青霉素和头孢菌素优选第十章青霉素和头孢菌素2优选第十章青霉素和头孢菌素2二.青霉素生产工艺技术2.发酵工艺控制点发酵温度25度pH值6.5通气量0.51VVM罐压0.030.06MPa溶氧⋝30%葡萄糖补率1.02.5kg/m3h发酵液NH4+浓度250300ppm苯乙酸浓度约100ppm

3二.青霉素生产工艺技术2.发酵工艺控制点3二.青霉素生产工艺技术3.青霉素典型发酵曲线4二.青霉素生产工艺技术3.青霉素典型发酵曲线4二.青霉素生产工艺技术青霉素提取工艺流程发酵液发酵滤液一次萃取液一次水提液二次萃取液脱色液冷却、絮凝、过滤调节pH2.0-2.2，乙酸丁酯逆流萃取碳酸氢钠溶液逆流反萃取加活性碳脱色调节pH2.0-2.2，乙酸丁酯逆流萃取加乙酸钾丁醇溶液，共沸结晶结晶悬液湿晶体青霉素钾盐5二.青霉素生产工艺技术青霉素提取工艺流程发酵液发酵滤液一次菌种(strain)：产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)孢子培养(sporecultivation)：25ºC,6-7d种子培养(seedcultivation)：25ºC，2-3d发酵培养(fermentation)：22-26ºC,6-7d加糖控制(sugarfeeding)：残糖降至0.6％

青霉素发酵(1)PenicillinFermentation6菌种(strain)：产黄青霉菌(Penicillium补氮(nitrogenfeeding)：氨控制在0.01-0.05％前体(precursor)：残余苯乙酰胺0.05-0.08％温度控制(temperature)：前期25-26ºC

后期23ºC通气与搅拌(aeration&stir)：1:0.8VVM泡沫(foam)：天然油脂,如豆油青霉素发酵(2)PenicillinFermentation7补氮(nitrogenfeeding)：氨控制在0.0青霉素发酵过程主要变量的典型变化曲线8青霉素发酵过程主要变量的典型变化曲线8PenicillinFermentationProfile变化曲线9PenicillinFermentationProfil青霉素发酵过程中的代谢流分布发酵100小时。括号内数字是代谢流分布摩尔百分比。10青霉素发酵过程中的代谢流分布发酵100小时。括号内数字是代谢钙离子影响细胞的生长和培养基的pH。泡沫(foam)：天然油脂,如豆油1条件下，将青霉素从BA提取到缓冲液中。可采用连续添加葡萄糖的方法来代替乳糖。在葡萄糖限制生长的条件下，当比生长率低于0.反萃取时表观分配系数K＇与pH值的关系苯乙酸浓度约100ppm超过30～40μg／mL，则发酵单位增长缓慢。补入表面活性剂，如新洁尔灭50mg/L，或聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯和三油酸酯等也能增加青霉素的产量。青霉素发酵分为生长和产物合成两个阶段②分离将乳浊液分成萃取相和萃余相。②钙、镁和钾镁离子少，钾离子多时，菌丝细胞将培养基中氮源转化成各种氨基酸的能力强。影响青霉素萃取效果的主要因素/

(3)萃取(分离)方式①混和料液和萃取剂充分混和形成乳浊液，抗生素自料液转移到萃取相中。(一)发酵液的过滤和预处理菌丝自溶时，在鼓式过滤机表面不能形成紧密的薄层，因而不能自行剥落，使过滤时间增长，滤液量降低，且滤液发浑。青霉素生产工艺青霉素工业化生产主要采用三级发酵的方法11钙离子影响细胞的生长和培养基的pH。青霉素生产工艺青霉素工业２.１菌种青霉（Penicillium)产黄青霉Penicilliumchrysogenum点青霉Penicilliumnotatum12２.１菌种青霉产黄青霉点青霉12一、青霉素生产工艺流程

——种子制备与发酵13一、青霉素生产工艺流程

(二)种子制备

种子制备包括孢子培养和种子培养，孢子培养以产生丰富的孢子为目的，种子培养以繁殖大量健壮的菌丝体(种子罐培养)为主要目的。国内青霉素的生产菌种分为丝状菌和球状菌两种。丝状菌又分为黄孢子丝状菌及绿孢子丝状菌；球状菌分为绿孢子球状菌和白孢子球状菌。生产厂大都采用绿色丝状菌，球状菌发酵单位虽高，但对原材料和设备的要求较高，且提炼收率也低于丝状菌。14(二)种子制备种子制备包括孢子培养和种子培养，孢子培养以产1.丝状菌的种子制备丝状菌的生产菌种保藏在沙土管内。大米茄子瓶内孢子成熟后进行真空干燥，制成大米孢子，并以这种形式低温保存备用。种子质量要求菌丝稠密，菌丝团很少，菌丝粗壮，有中小空胞，处在第Ⅲ～Ⅳ期。种子罐以达到对数生长的后期为培养成熟指标，不能随意延长或缩短培养时间；同时要考虑培养液的流动性，以不影响通过管道向发酵罐接种的速度为宜。151.丝状菌的种子制备丝状菌的生产菌种保藏在沙土管内。152.球状菌的种子制备球状菌的生产菌种是冷冻管孢子。三角瓶培养原始亲米孢子，再移入茄子瓶生产大米孢子(又称生产米)。亲米、生产米孢子都需保存在5℃冰箱内。新鲜的生产米(10d内)接入种子罐培养球状菌以新鲜孢子为佳，其生产水平优于真空干燥的孢子，能使发酵单位的罐批差异减少。162.球状菌的种子制备球状菌的生产菌种是冷冻管孢子。16影响青霉素萃取效果的主要因素/(2)温度和时间二次BA过滤完毕后，对滤饼进行去湿。青霉素易溶于有机溶剂如醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和醚中，在溶媒相中则仅游离酸(青COOH)的形式存在。通过补加糖和生理酸性物质(如硫酸铵等无机氮源)，降低pH。碱化时速度可放慢些，因青霉素在中性环境中破坏要缓和些。加乙酸钾丁醇溶液，共沸结晶青霉素生产工艺流程——提炼通过补加糖和生理酸性物质(如硫酸铵等无机氮源)，降低pH。发酵终点确定及异常情况处理中期泡沫可加油控制，必要时可略为降低空气流量，但搅拌应开足，否则会影响菌的呼吸；07%，V/V)作为助滤剂，通过板框过滤机过滤，得二次滤液。07%外，其余按需要同氮源另行灭菌，待菌丝稠密不再加油时补入。发酵时间的长短应从以下三个方面考虑经过几次反复萃取后共浓缩10倍左右，浓度已符合结晶要求。青霉素发酵过程中的代谢流分布当酸性条件下，呈分子型青霉酸结构，具有良好有机溶剂溶解性质；加入硫代硫酸钠能减少它们的毒性。为了防止较大冰块的产生，冷冻罐一直开动搅拌，尽管如此，仍需要过滤过程迅速。0mg／mL)，对后续各步提取有很大影响，必须去除。(三)发酵培养基组成/1.碳源青霉菌能利用乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、天然油脂等。葡萄糖是容易利用的碳源，有利于菌体的生长。乳糖能被产生菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，故为最佳碳源，但货源少、价格高。玉米油、豆油也能被缓慢利用作为有效的碳源，但不可能大规模使用。采用葡萄糖和乳糖两种碳源就能适合青霉菌发酵过程中的生理变化，在发酵初期利用氧化速率快的葡萄糖使青霉菌大量、迅速、强壮地繁殖菌丝体；当葡萄糖耗尽时青霉菌进入发酵后期，此时利用氧化缓慢的乳糖，使发酵液pH较稳定，避免速效碳源的分解产物阻遏作用，有利于青霉菌大量、持久地分泌青霉素。17影响青霉素萃取效果的主要因素/(2)温度和时间(三)发酵培养(三)发酵培养基组成/1.碳源单独使用葡萄糖，常常因为发酵前期葡萄糖浓度过高，其分解代谢产物对青霉素合成酶产生阻遏(或抑制)或对菌体生长产生抑制作用，而后期葡萄糖浓度降低，限制了菌丝生长和产物合成。为了避免这一现象，青霉素发酵中采用连续流加的方法加入葡萄糖来替代乳糖，既节约了成本，又有利于青霉素的合成。目前生产上用的碳源是葡萄糖母液和工业用葡萄糖，最为经济合理。18(三)发酵培养基组成/1.碳源单独使用葡萄糖，常常因为发酵前(三)发酵培养基组成/2.氮源玉米浆是青霉素发酵最好的氮源。玉米浆是淀粉生产的副产物，含多种氨基酸，如精氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸以及以及为苄青霉素生物合成提供侧链前体β苯乙胺等。现因国内玉米浆产量少，且质量难以控制，也可选用便于保藏和质量稳定的花生饼粉或棉籽饼粉来代替，生产水平也可达到技术指标。目前生产上用的氮源是花生饼粉、麸质、玉米胚芽粉及尿素等。19(三)发酵培养基组成/2.氮源玉米浆是青霉素发酵最好的氮源。(三)发酵培养基组成/3.前体物质前体有苯乙酸及其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等。它们可以作为青霉素G侧链的前体物直接结合到青霉素分子中，也可以作为养料和能源被利用。前体物质对青霉菌都有一定的毒性。苯乙酸、苯乙酰胺等对菌体生长和生物合成均有毒性，其毒性的大小与培养基的pH有关。苯乙酰胺在碱性(pH8)下抑制菌体生长；苯乙酸在酸性(pH5.5)下毒性较大；中性pH下苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前体用量大于0.1％时，除了苯氧乙酸外，其他都对青霉素合成产生抑制。20(三)发酵培养基组成/3.前体物质前体有苯乙酸及其衍生物苯乙前体苯乙酸青霉素G苯氧乙酸青霉素V辛酸青霉素K………..21前体苯乙酸青霉素G21(三)发酵培养基组成/4.无机元素①硫和磷硫浓度降低时青霉素产量减少至1/3，磷浓度降低时青霉素产量减少一半。②钙、镁和钾镁离子少，钾离子多时，菌丝细胞将培养基中氮源转化成各种氨基酸的能力强。钙离子影响细胞的生长和培养基的pH。③铁离子铁易渗入菌丝内，它对青霉素发酵有毒害作用。Fe3+含量6μg／mL以下时无影响；超过30～40μg／mL，则发酵单位增长缓慢。60μg／mL时降低产量30％；300μg／mL时降低产量90％。22(三)发酵培养基组成/4.无机元素①硫和磷硫浓度降低时青霉青霉素发酵培养基基本组成葡萄糖10%；玉米浆4～5％；苯乙酸0.5～0．8％；猪油或植物油、消泡剂0.5％。23青霉素发酵培养基基本组成葡萄糖10%；232.3发酵过程的控制三个不同的代谢时期：菌丝生长繁殖期青霉素分泌期菌丝自溶期242.3发酵过程的控制三个不同的代谢时期：菌丝生长繁殖期青霉Fe3+含量6μg／mL以下时无影响；PenicillinFermentation混合可用机械搅拌混合罐、管道混合器或喷射混合器等。5％，需浓缩才便于结晶。为提高萃取效率将两台离心机串联使用，进行二级对向逆流萃取。加入硫代硫酸钠能减少它们的毒性。07%，V/V)作为助滤剂，通过板框过滤机过滤，得二次滤液。影响青霉素萃取效果的主要因素/

(4)浓缩比影响青霉素萃取效果的主要因素/

(4)浓缩比青霉素发酵分为生长和产物合成两个阶段(三)发酵培养基组成/2.丁酯用量太多，虽然萃取较完全、收率高，但达不到结晶浓度要求，反而增加溶媒的耗用量；根据此机理设计萃取/反萃取步骤进行粗分离。青霉素发酵过程中的代谢流分布中期泡沫可加油控制，必要时可略为降低空气流量，但搅拌应开足，否则会影响菌的呼吸；加入硫代硫酸钠能减少它们的毒性。在葡萄糖限制生长的条件下，当比生长率低于0.醋酸钾乙醇溶液配制的水分应控制在9.将发酵滤液用10％硫酸调pH2.0mg／mL)，对后续各步提取有很大影响，必须去除。07%外，其余按需要同氮源另行灭菌，待菌丝稠密不再加油时补入。(四)发酵条件控制环境变量比较直观，容易控制。包括温度、pH值、基质浓度、溶氧饱和度等。生理变量，在许多情况下不能直接测定和定量，控制也较困难。包括菌丝浓度、菌丝生长速度、菌丝形态等。25Fe3+含量6μg／mL以下时无影响；(四)发酵条件控制环境1.加糖控制乳糖是青霉素生物合成的最好碳源，葡萄糖的分解代谢物会抑制青霉素的合成。可采用连续添加葡萄糖的方法来代替乳糖。对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质(葡萄糖、胺、苯乙酸等)进行缓慢流加，以维持一定的最适浓度。加糖主要控制残糖量，加入量主要决定于耗糖速度、pH值变化、菌丝量及培养液体积。目前，糖浓度的检测尚难在线进行，故葡萄糖的流加不是根据糖浓度控制，而是间接根据pH值、溶氧或CO2释放率予以调节。261.加糖控制乳糖是青霉素生物合成的最好碳源，葡萄糖的分解代谢2.pH控制前期60h内维持pH6.8～7.2，以后稳定在pH6.5左右。应尽量避免pH超过7.0。因为青霉素在碱性条件下不稳定，容易加速其水解。通过补加糖和生理酸性物质(如硫酸铵等无机氮源)，降低pH。通过补加CaCO3、氨水或尿素，也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高pH。加油较多时要适当减少葡萄糖的量。用酸或碱来调节往往会超过控制范围，导致菌体代谢朝不利于抗生素合成的方向变化。不同方法控制pH对青霉素合成的影响如图所示。272.pH控制前期60h内维持pH6.8～7.2，以后稳定在p不同方法控制pH对青霉素合成的影响

28不同方法控制pH对青霉素合成的影响283.补料及添加前体分次补加硫酸铵、氨或尿素等氮源，可以延长发酵周期、调节pH、前体转化率为46％～90％。浓度过大对菌体产生不利影响，除基础料中加入0.07%外，其余按需要同氮源另行灭菌，待菌丝稠密不再加油时补入。为了尽量减少苯乙酸的氧化，采用间歇或连续添加低浓度前体物质的方法，保持前体的供应速率仅略大于生物合成的需要，控制苯乙酸0.1％、苯乙酰胺0.05％～0.08％。加入硫代硫酸钠能减少它们的毒性。293.补料及添加前体分次补加硫酸铵、氨或尿素等氮源，可以延长发3.补料及添加前体补入表面活性剂，如新洁尔灭50mg/L，或聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯和三油酸酯等也能增加青霉素的产量。加入少量可溶性高分子化合物，如40mg／L聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚二乙胺或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，能使青霉素产率增加。①高分子化合物能使邻近搅拌叶的液体速度梯度降低，避免打断菌丝，②高分子化合物起分散剂的作用，菌丝不致成团，增加了氧传递到菌丝体内的速度。同时还有利于除去CO2；303.补料及添加前体补入表面活性剂，如新洁尔灭50mg/L，或4.温度控制青霉菌生长的适宜温度为30℃，而分泌青霉素的适宜温度是20℃左右，采用分段变温控制，可延缓菌丝衰老，增加溶解氧浓度，延长发酵周期，有利于发酵后期青霉素单位的增长，减少发酵液中青霉素的降解破坏，提高产量。种子罐培养丝状菌25℃，球状菌28℃。发酵罐丝状菌26℃→24℃→23℃→22℃；球状菌26℃→25℃→24℃。314.温度控制青霉菌生长的适宜温度为30℃，而分泌青霉素的适宜5.溶氧浓度控制溶氧浓度降到30％饱和度以下，青霉素产量急剧下降；低于10%饱和度时，则造成不可逆转的损失。发酵液中溶氧浓度过高，说明菌丝生长不良或加糖率过低，使呼吸强度下降同样影响生产能力的发挥。一般控制通气比为l∶(0.8～1)[W/(V·min)]，搅拌转速为150～200r／min。中、后期减慢转速对球状菌的生理生化代谢有利，能提高发酵单位，并能节约能源。丝状菌种子罐的搅拌转速快于发酵罐，而球状菌种子罐的转速慢于发酵罐。氧消耗与糖消耗成正比，故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的参考指标之一。325.溶氧浓度控制溶氧浓度降到30％饱和度以下，青霉素产量急剧6.菌体浓度青霉素发酵分为生长和产物合成两个阶段①菌丝生长繁殖期糖及含氮物质迅速利用。对丝状菌而言，孢子发芽长出菌丝，分枝旺盛。对球状菌而言，孢子发芽后菌丝生长逐步发育成球状。此时青霉素分泌量很少，菌体浓度迅速增加，应通过限制糖的供给进行控制。②青霉素分泌期菌丝生长趋势减弱，青霉素分泌旺盛。应间歇添加葡萄糖、花生饼粉、尿素、前体。丝状菌pH要求6.2～6.4，球状菌pH要求6．6～6.9。氧传递率(OTR)及氧消耗率(OUR)与菌体浓度关系密切。每个具有固定通气、搅拌条件的发酵罐，都有一个使OTR和OUR在某一溶氧水平上达到平衡的临界菌体浓度，必须控制菌体浓度使之不超越临界值。336.菌体浓度青霉素发酵分为生长和产物合成两个阶段338菌体生长速度在葡萄糖限制生长的条件下，当比生长率低于0.015／h时，比生产率与比生长率成正比；当比生长率高于0.015／h时，比生产率与比生长率无关。因此，要在发酵过程中达到并维持最大比生产率，必须使比生长率不低于0.015／h。这一比生长率称为临界比生长率。事实上，青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长率要比这一理论值低得多，却仍然能达到很高的比生产率。这是由于不断有部分菌丝自溶，故虽然表观比生长率较低，但真比生长率却要高一些。348菌体生长速度在葡萄糖限制生长的条件下，当比生长率低于0.09.菌丝形态丝状菌所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触，故一般比生产率较高。菌丝球则由于发酵液粘度显著降低，使气液两相间氧的传递速率大大提高，从而允许更多的菌丝生长(即临界菌丝浓度较高)，发酵罐体积产率甚至高于丝状菌。在丝状菌发酵中，控制菌丝形态使其保持适当的分枝和长度并避免结球，是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中，使菌丝球保持适当的大小和松紧，并尽量减少游离菌丝的含量，也是充分发挥其生产能力的关键要素之一。这种形态的控制，与糖和氮源的流加状况、搅拌的剪切强度及比生长率(稀释率)密切相关。359.菌丝形态丝状菌所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触10.泡沫与消沫前期泡沫主要是花生饼粉和麸质水引起的，泡沫多，可间歇搅拌，不能多加油；中期泡沫可加油控制，必要时可略为降低空气流量，但搅拌应开足，否则会影响菌的呼吸；发酵后期尽量少加消泡剂。“泡敌”(聚醚树脂类消沫剂)可部分代替天然油脂。BAPE型(聚氧丙烯聚氧乙烯三聚丙醇胺醚)的消泡能力强、毒性较低，优于GPE型(聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚)，在菌丝生长繁殖期不宜多用，中、后期泡敌与豆油交替加入。3610.泡沫与消沫前期泡沫主要是花生饼粉和麸质水引起的，泡沫多11.发酵终点确定及异常情况处理发酵时间的长短应从以下三个方面考虑①累计产率(发酵累计总亿产量与发酵罐容积及发酵时间之比值)最高；②单产成本(发酵过程中的累计成本投入与累计总亿产量之比值)最低；③发酵液质量好(抗生素浓度高，降解产物少，残留基质少。菌丝自溶少)。前期菌丝生长不良，发酵异常时可采取倒出部分发酵液，补入部分新鲜料液和良好的种子。前期染菌或种子带菌，可采用重新消毒并补入适量的糖、氮成分。中后期发生染菌若是产气细菌则应及时放罐过滤、提炼，事后彻底消毒处理。发酵单位停滞不长，可酌情提前放罐。3711.发酵终点确定及异常情况处理发酵时间的长短应从以下三个方发酵级别主要培养基搅拌速度(rpm)培养时间(h)酸度范围培养温度一级发酵葡萄糖、乳糖、玉米浆300~35040自然pH27℃±1二级发酵葡萄糖、玉米浆250~2800~14自然pH25℃±1三级发酵花生饼粉、葡萄糖、尿素、苯乙酰氨、硫代硫酸钠等150~200按产生青霉素的趋势决定停止发酵前６０h左右６.７～７.２以后为６.７前６０h左右２６℃，以后２４℃38发酵主要搅拌培养酸度培养一级葡萄糖、乳糖、玉米浆300~35青霉素发酵的主要工艺控制点操作变量工艺控制点操作变量工艺控制点发酵罐容积150~200m3发酵温度~25℃装料率~80%发酵液pH~6.5搅拌输入功率3~4kW/m3初始菌体浓度1.5~1.8kg(干重)/m3通气率40~60Nm3/(m3·h)葡萄糖料液浓度~450kg/m3空气压力（表压）0.2MPa葡萄糖补加率1.0~2.5kg/(m3·h)发酵液上方压力（表压）0.03~0.06MPa发酵液中铵氮浓度0.25~0.34kg/m3液相氧体积传递系数(kLa)200h-1发酵液中苯乙酸浓度~0.1kg/m3发酵液中溶氧浓度>30%饱和度发酵时间180~240h39青霉素发酵的主要工艺控制点操作变量工艺控制点操作变量工艺控制青霉素生产工艺流程——提炼40青霉素生产工艺流程——提炼40二.青霉素提取工艺原理1.青霉素的两性性质由于青霉素结构中羧基结构，使得青霉素在不同pH下呈现不同的溶解性质。当酸性条件下，呈分子型青霉酸结构，具有良好有机溶剂溶解性质；当碱性条件下，呈离子型结构，易溶于水而难溶于有机溶剂。根据此机理设计萃取/反萃取步骤进行粗分离。

2.共沸结晶青霉素钾在乙酸丁酯中溶解度非常低，青霉素钾盐丁醇稀释液蒸馏时形成丁醇一水二元共沸物，利用丁醇一水二组分在较宽的液相组成范围内蒸馏温度稳定、溶液沸点下降等特点，在共沸蒸馏过程中以补加丁醇的方法将水分带走，使溶液逐步达到过饱和状态而析出结晶。41二.青霉素提取工艺原理1.青霉素的两性性质41四、青霉素的提取发酵液中青霉素的浓度很低，折合重量计算仅含2.5％，需浓缩才便于结晶。早期曾用活性炭吸附法，沉淀法或离子交换法，目前多用溶剂萃取法。青霉素游离酸易溶于醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和醚等有机溶剂，在水中的溶解度很小，且迅速丧失其抗菌能力。由于青霉素的性质不稳定，整个提取和精制过程应在低温下快速进行，并应注意清洗和保持在稳定的pH值范围，注意对设备清洗消毒减少污染，尽量避免或减少青霉素效价的破坏损失。42四、青霉素的提取发酵液中青霉素的浓度很低，折合重量计算仅含2四、青霉素的提取青霉素的金属盐极易溶于水，几乎不溶于乙醚、氯仿或醋酸戊酯，易溶于低级醇，略溶于乙醇、丁醇、酮类或醋酸乙酯中，但如果此类溶剂中含有少量水分时，则青霉素的金属盐在溶剂中的溶解度就大大增加。溶剂萃取法提取即利用青霉素与碱金属所生成的盐类在水中溶解度很大，而青霉素游离酸易溶解于有机溶剂中这一性质，将青霉素在酸性溶液中转入有机溶剂醋酸丁酯(BA)中，然后再转入中性水相中。经过这样反复几次萃取，就能达到提纯和浓缩的目的。43四、青霉素的提取青霉素的金属盐极易溶于水，几乎不溶于乙醚、氯2.4青霉素的提取

发酵停止冷却（加入１％～２％甲醛，加入CaCl2)过滤萃取（先酸化，然后用萃取剂萃取,再用缓冲溶液提取）脱色结晶（加入３～４倍体积的丁醇，真空蒸馏，将水与丁醇蒸出）烘干442.4青霉素的提取发酵停止冷却（加入１％～２％甲醛青霉素游离酸的丁酯提取液加入醋酸钾、醋酸钠，就分别析出青霉素钾盐、钠盐的结晶；影响青霉素萃取效果的主要因素/

(4)浓缩比丁酯用量太多，虽然萃取较完全、收率高，但达不到结晶浓度要求，反而增加溶媒的耗用量；PenicillinFermentationProfile变化曲线(三)发酵培养基组成/2.酸度大，溶解度增大通过补加糖和生理酸性物质(如硫酸铵等无机氮源)，降低pH。加乙酸钾丁醇溶液，共沸结晶丝状菌的生产菌种保藏在沙土管内。青霉素在水溶液中固然不稳定，在丁酯中也要发生破坏，于0～15℃放置24h，几乎不损失效价，在室温放置2h损失1.在二次醋酸丁酯萃取液中，青霉素的纯度只有50％～70％，结晶后纯度可提高至90％以上。否则，结冰块增大将增大料浆在管道流动中的阻力，甚至影响过滤的正常进行。②钙、镁和钾镁离子少，钾离子多时，菌丝细胞将培养基中氮源转化成各种氨基酸的能力强。Fe3+含量6μg／mL以下时无影响；苯乙酸、苯乙酰胺等对菌体生长和生物合成均有毒性，其毒性的大小与培养基的pH有关。亲米、生产米孢子都需保存在5℃冰箱内。氧消耗与糖消耗成正比，故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的参考指标之一。0，加相当于发酵滤液体积1/3的BA，混合后以碟片式离心机分离。乳糖能被产生菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，故为最佳碳源，但货源少、价格高。前体转化率为46％～90％。(一)发酵液的过滤和预处理放罐后要冷却。青霉素在低温时比较稳定，细菌繁殖也较慢，可避免青霉素迅速破坏。预处理用鼓式过滤机及板框过滤机二次过滤。青霉素发酵液菌丝较粗大，一般过滤较容易。菌丝自溶时，在鼓式过滤机表面不能形成紧密的薄层，因而不能自行剥落，使过滤时间增长，滤液量降低，且滤液发浑。发酵液最高单位时，常常也是菌丝开始自溶的时候，最好控制在自溶前放罐。45青霉素游离酸的丁酯提取液加入醋酸钾、醋酸钠，就分别析出青霉素(一)发酵液的过滤和预处理从鼓式过滤机得到的滤液，pH值6.2～7.2，略发浑，棕黄色或棕绿色。蛋白质含量0.5～2.0mg／mL(个别情况下可达到7.0mg／mL)，对后续各步提取有很大影响，必须去除。二次过滤前，通常用硫酸调pH4.5～5.0。由于发酵液中含有过剩的碳酸钙，在酸化时会有部分溶解，使钙离子呈游离状态，在酸化萃取时，遇到大量硫酸根离子(SO42)，会形成硫酸钙沉淀。故酸化时pH应控制得高些(pH4～5)。加入0.07%(V/V)的溴代十五烷吡啶PPB，同时再加入硅藻土(0.07%，V/V)作为助滤剂，通过板框过滤机过滤，得二次滤液。46(一)发酵液的过滤和预处理从鼓式过滤机得到的滤液，pH值6.(一)发酵液的过滤和预处理酸化过滤工序青霉素的损失主要是由于滤液的流失和过滤时青霉素的破坏，一般该工序的收率为90％左右。随着高效高速萃取离心机的出现，如德国Westfalia公司出品的倾析器(decantor)，可免去过滤工序，使用破乳剂D5387，萃取相可以分离得很清，比用板框过滤除去菌丝后再提取的收率高出2％～3％。二次滤液一般澄清透明，可进行提取。47(一)发酵液的过滤和预处理酸化过滤工序青霉素的损失主要是由于三相倾析式离心机结构倾析式离心萃取机萃取操作过程及设备萃取分离原理及设备离心萃取机48三相倾析式离心机结构倾析式离心萃取机萃取操作过程及设(二)青霉素的萃取工艺/1.分配系数与pH的关系青霉素易溶于有机溶剂如醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和醚中，在溶媒相中则仅游离酸(青COOH)的形式存在。青霉素游离酸在水中的溶解度很小，但在水中有部分离解成负离子(青COO－)。故青霉素萃取过程中，同时存在着两种平衡，一种是青霉素游离酸分子在有机溶媒相和水相间的分配平衡，另一种是青霉素游离酸在水中的电离平衡，前者用分配系数Ko来表征，后者用电离常数Kp来表征(图1011)。49(二)青霉素的萃取工艺/1.分配系数与pH的关系青霉素易溶于青霉素的分配和电离平衡50青霉素的分配和电离平衡50青霉素G的分配系数

溶剂pH=2.5(溶剂/水)pH=7.0(溶剂/水)醋酸戊酯45/11/235醋酸丁酯47/11/186醋酸乙酯39/11/260氯仿39/11/220三氯乙烯21/11/260乙醚12/11/19051青霉素G的分配系数溶剂pH=2.5pH=7.0醋酸戊酯451.分配系数与pH的关系从表101可知，当pH较小时，青霉素G转移到溶剂相，称为萃取；pH较大时，又从溶剂相转移到水相，称为反萃取。青霉素自醋酸丁酯反萃取到水相时，表观分配系数K′(水相浓度与醋酸丁酯相浓度之比)与pH值的关系如图1012所示，也可用下面方程式来描述lgK′=－0．06+0．35(pH)pH＞6521.分配系数与pH的关系从表101可知，当pH较小时，青霉素反萃取时表观分配系数K＇与pH值的关系

53反萃取时表观分配系数K＇与pH值的关系532.萃取工艺操作萃取操作包括三个步骤①混和料液和萃取剂充分混和形成乳浊液，抗生素自料液转移到萃取相中。②分离将乳浊液分成萃取相和萃余相。③溶剂回收。目前多采用醋酸丁酯(BA)为溶剂，两次提取青霉素。将发酵滤液用10％硫酸调pH2.0，加相当于发酵滤液体积1/3的BA，混合后以碟片式离心机分离。为提高萃取效率将两台离心机串联使用，进行二级对向逆流萃取。得到的一次BA提取液用1.3～1.9%NaHCO3在pH6.8～7.1条件下，将青霉素从BA提取到缓冲液中。然后pH调至2.0，再一次将青霉素从缓冲液转入到BA中去(方法同上)，得到二次BA提取液。542.萃取工艺操作萃取操作包括三个步骤54青霉素提取工艺要点1.青霉素溶解状态下对热、酸、碱都不稳定。因此在调节pH进行萃取操作中，要注意控制温度和缩减时间。采用高速逆流离心萃取是比较常用的方法。

55青霉素提取工艺要点1.青霉素溶解状态下对热、酸、碱都不稳定青霉素提取工艺要点2.发酵滤液接近中性，其中溶解有一定量蛋白。当加入乙酸丁酯萃取时，易使丁酯相乳化而影响萃取效果。因此需要加入破乳剂破除乳化，同时蛋白质也可保留于水相而与青霉素分离开来。56青霉素提取工艺要点2.发酵滤液接近中性，其中溶解有一定量蛋3.影响青霉素萃取效果的主要因素/

(1)溶剂和pH除分配系数外，选择溶剂时尚需考虑下列条件在水中溶解度较小，不和青霉素起作用，在5～30℃间的蒸气压较低，回收温度不超过120～140℃，价格低廉，来源方便等。目前工业生产所采用的溶剂多为醋酸丁酯和醋酸戊酯。青霉素在酸性下极易水解破坏，但青霉素酸要在酸性时才能转移到有机溶媒中，这是个矛盾。因此正确选择萃取和反萃取时的pH值有很重要的意义。573.影响青霉素萃取效果的主要因素/

(1)溶剂和pH除分配系0，加相当于发酵滤液体积1/3的BA，混合后以碟片式离心机分离。种子罐以达到对数生长的后期为培养成熟指标，不能随意延长或缩短培养时间；活性炭颗粒越小，比表面积就越大，吸附能力也就越强。中期泡沫可加油控制，必要时可略为降低空气流量，但搅拌应开足，否则会影响菌的呼吸；采用葡萄糖和乳糖两种碳源就能适合青霉菌发酵过程中的生理变化，在发酵初期利用氧化速率快的葡萄糖使青霉菌大量、迅速、强壮地繁殖菌丝体；为了防止较大冰块的产生，冷冻罐一直开动搅拌，尽管如此，仍需要过滤过程迅速。发酵液NH4+浓度250300ppm超过30～40μg／mL，则发酵单位增长缓慢。发酵时间的长短应从以下三个方面考虑菌丝自溶时，在鼓式过滤机表面不能形成紧密的薄层，因而不能自行剥落，使过滤时间增长，滤液量降低，且滤液发浑。按产生青霉素的趋势决定停止发酵0mg／mL(个别情况下可达到7.青霉素游离酸在水中的溶解度很小，但在水中有部分离解成负离子(青COO－)。Penicilliumnotatum(三)发酵培养基组成/2.溶氧浓度降到30％饱和度以下，青霉素产量急剧下降；为了防止较大冰块的产生，冷冻罐一直开动搅拌，尽管如此，仍需要过滤过程迅速。乳糖能被产生菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，故为最佳碳源，但货源少、价格高。优选第十章青霉素和头孢菌素Fe3+含量6μg／mL以下时无影响；苯乙酸、苯乙酰胺等对菌体生长和生物合成均有毒性，其毒性的大小与培养基的pH有关。3.影响青霉素萃取效果的主要因素/(2)温度和时间整个萃取过程应在低温下进行(在10℃以下)，在保证萃取效率的前提下，尽量缩短操作时间，减少青霉素的破坏。青霉素在水溶液中固然不稳定，在丁酯中也要发生破坏，于0～15℃放置24h，几乎不损失效价，在室温放置2h损失1.96％，4h损失2.32％，8h损失2.78％，24h损失可达5.32%。酸化时速度应快些，使青霉素游离酸尽快地转移到醋酸丁酯中。碱化时速度可放慢些，因青霉素在中性环境中破坏要缓和些。

580，加相当于发酵滤液体积1/3的BA，混合后以碟片式离心机分3.影响青霉素萃取效果的主要因素/

(3)萃取(分离)方式一般采用多级逆流萃取(常为二级)。混合可用机械搅拌混合罐、管道混合器或喷射混合器等。分离采用离心机。也有将混合和分离同时在一个设备内完成的，称为离心萃取机。二次丁酯萃取液在结晶前要求有较低的水分(应低于0.9％)，可使结晶后母液的单位降低。因青霉素钾盐或钠盐在水中溶解度较大。脱水可以用无水硫酸钠等脱水剂，工业上常用冷冻脱水法。593.影响青霉素萃取效果的主要因素/

(3)萃取(分离)方式一3.影响青霉素萃取效果的主要因素/

(3)萃取(分离)方式第一次丁酯萃取时，由于滤液中有大量蛋白质等表面活性物质存在，易发生乳化，故需加入去乳化剂。通常用PPB（溴代十五烷基吡啶

），加入量为0.05％～0.1％。由于蛋白质的憎水性质，形成W／O型乳浊液，即在丁酯相乳化，加入PPB后，由于其亲水性较大，乳浊液发生转型而破坏，同时使蛋白质表面成为亲水性，而被拉入水相，而且PPB是碱性物质，在酸性下留在水相，这样可使丁酯相含杂质较少。603.影响青霉素萃取效果的主要因素/

(3)萃取(分离)方式第3.影响青霉素萃取效果的主要因素/

(4)浓缩比丁酯用量太多，虽然萃取较完全、收率高，但达不到结晶浓度要求，反而增加溶媒的耗用量；如丁酯用量太少，则萃取不完全，影响收率。萃取时醋酸丁酯用量为原液的25％～30％时，色素相对含量最少，而萃取液干渣中青霉素含量最高，浓缩比为1∶(1.5～2.5)。从丁酯反萃取到水相时，因分配系数之值较大，故浓缩倍数可较高些(2～5倍)。经过几次反复萃取后共浓缩10倍左右，浓度已符合结晶要求。613.影响青霉素萃取效果的主要因素/

(4)浓缩比丁酯用量太(三)青霉素的脱色/1.活性炭脱色的机理活性炭颗粒越小，比表面积就越大，吸附能力也就越强。粉末状的活性炭总面积最大，因而吸附效果最佳，但粉末状的活性炭很容易随液体透过过滤介质，而影响药品质量。青霉素是热敏性物质，脱色是在13℃下进行二次BA含有一定量的水分，冷冻脱色的过程也是脱水过程。活性炭在吸附有害物质的同时也吸附少量的青霉素，为减少损失，过滤后要用醋酸丁酯对滤饼进行洗涤。62(三)青霉素的脱色/1.活性炭脱色的机理活性炭颗粒越小，比表(三)青霉素的脱色/

2.冷冻脱色后的过滤流程冷冻脱色后过滤目的是去除冰、活性炭及吸附的杂质。这里的滤饼不仅仅是活性炭，而是活性炭和细小冰块的混合物。为了防止较大冰块的产生，冷冻罐一直开动搅拌，尽管如此，仍需要过滤过程迅速。否则，结冰块增大将增大料浆在管道流动中的阻力，甚至影响过滤的正常进行。传统的脱色过滤机为多层加压过滤器，其过滤流程为过滤→滤饼去湿→洗涤→滤饼去湿→卸料63(三)青霉素的脱色/

2.冷冻脱色后的过滤流程冷冻脱色后过(三)青霉素的脱色/3.脱色过滤操作要求二次BA(青霉素溶液)冷冻罐加入适量的活性炭，打开冷冻罐搅拌开关，使活性炭与二次BA(青霉素溶液)充分接触以吸附各种色素和杂质，然后进行过滤操作。二次BA过滤完毕后，对滤饼进行去湿。当滤饼的干湿度达到一定的要求时，开始滤饼洗涤(顶洗)。洗涤结束后卸渣。过滤操作中物料的输送靠离心泵来完成，冷冻罐、洗涤液罐、过滤机、输送泵、废渣罐等需要有合理的位差。尽可能使操作稳定、过渡周期要短，避免影响滤液质量和造成残留料液。64(三)青霉素的脱色/3.脱色过滤操作要求二次BA(青霉素溶液(四)青霉素盐的结晶在二次醋酸丁酯萃取液中，青霉素的纯度只有50％～70％，结晶后纯度可提高至90％以上。青霉素游离酸在有机溶媒中的溶解度是很大的，当它与某些金属或有机胺结合成盐之后，由于极性增大，溶解度大大减小而自溶媒中析出青霉素游离酸的丁酯提取液加入醋酸钾、醋酸钠，就分别析出青霉素钾盐、钠盐的结晶；普鲁卡因青霉素在水中溶解度很小。因此在青霉素钾盐的水溶液中(pH值中性的磷酸盐缓冲液)加盐酸普鲁卡因溶液，普鲁卡因青霉素就结晶析出。65(四)青霉素盐的结晶在二次醋酸丁酯萃取液中，青霉素的纯度只有1.青霉素钾盐结晶青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很小，在二次丁酯萃取液中加入醋酸钾乙醇溶液，青霉素钾盐就结晶析出溶液中的水分、温度和酸度对青霉素钾盐在此溶液中的溶解度有很大影响，因而也影响青霉素钾盐的结晶效果。水分含量高，溶解度增大；温度升高，溶解度降低；酸度大，溶解度增大661.青霉素钾盐结晶青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很小，在二次丁碱化时速度可放慢些，因青霉素在中性环境中破坏要缓和些。2，略发浑，棕黄色或棕绿色。青霉素的分配和电离平衡加乙酸钾丁醇溶液，共沸结晶酸化时速度应快些，使青霉素游离酸尽快地转移到醋酸丁酯中。为了防止较大冰块的产生，冷冻罐一直开动搅拌，尽管如此，仍需要过滤过程迅速。从丁酯反萃取到水相时，因分配系数之值较大，故浓缩倍数可较高些(2～5倍)。青霉素发酵分为生长和产物合成两个阶段因此，要在发酵过程中达到并维持最大比生产率，必须使比生长率不低于0.一般采用多级逆流萃取(常为二级)。二次BA含有一定量的水分，冷冻脱色的过程也是脱水过程。PenicillinFermentation发酵液上方压力（表压）2，以后稳定在pH6.新鲜的生产米(10d内)接入种子罐培养优选第十章青霉素和头孢菌素加乙酸钾丁醇溶液，共沸结晶由于青霉素结构中羧基结构，使得青霉素在不同pH下呈现不同的溶解性质。0mg／mL)，对后续各步提取有很大影响，必须去除。1.青霉素钾盐结晶①水分的影响醋酸丁酯中含水量过高会使收率下降，但其中水分可溶去一部分杂质，提高晶体纯度。水分控制在0.9％以下，则影响收率较少。醋酸钾乙醇溶液配制的水分应控制在9.5％～11％范围内，醋酸钾浓度在46％～51%范围内为好。如醋酸钾浓度高，而水分含量低，则醋酸钾在配制过程中易析出结晶。如果二次丁酯提取液水分含量低于0．75％，加之醋酸钾溶液水分也低，会使晶体包含色素多而色变深，影响色泽。如果配制醋酸钾溶液水分过高(12％～12.5％)，再加上二次丁酯提取液水分含量，整个反应母液中总水量增高，就会影响结晶收率。67碱化时速度可放慢些，因青霉素在中性环境中破坏要缓和些。1.青第十章青霉素和头孢菌素第十章青霉素和头孢菌素优选第十章青霉素和头孢菌素69优选第十章青霉素和头孢菌素2二.青霉素生产工艺技术2.发酵工艺控制点发酵温度25度pH值6.5通气量0.51VVM罐压0.030.06MPa溶氧⋝30%葡萄糖补率1.02.5kg/m3h发酵液NH4+浓度250300ppm苯乙酸浓度约100ppm

70二.青霉素生产工艺技术2.发酵工艺控制点3二.青霉素生产工艺技术3.青霉素典型发酵曲线71二.青霉素生产工艺技术3.青霉素典型发酵曲线4二.青霉素生产工艺技术青霉素提取工艺流程发酵液发酵滤液一次萃取液一次水提液二次萃取液脱色液冷却、絮凝、过滤调节pH2.0-2.2，乙酸丁酯逆流萃取碳酸氢钠溶液逆流反萃取加活性碳脱色调节pH2.0-2.2，乙酸丁酯逆流萃取加乙酸钾丁醇溶液，共沸结晶结晶悬液湿晶体青霉素钾盐72二.青霉素生产工艺技术青霉素提取工艺流程发酵液发酵滤液一次菌种(strain)：产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)孢子培养(sporecultivation)：25ºC,6-7d种子培养(seedcultivation)：25ºC，2-3d发酵培养(fermentation)：22-26ºC,6-7d加糖控制(sugarfeeding)：残糖降至0.6％

青霉素发酵(1)PenicillinFermentation73菌种(strain)：产黄青霉菌(Penicillium补氮(nitrogenfeeding)：氨控制在0.01-0.05％前体(precursor)：残余苯乙酰胺0.05-0.08％温度控制(temperature)：前期25-26ºC

后期23ºC通气与搅拌(aeration&stir)：1:0.8VVM泡沫(foam)：天然油脂,如豆油青霉素发酵(2)PenicillinFermentation74补氮(nitrogenfeeding)：氨控制在0.0青霉素发酵过程主要变量的典型变化曲线75青霉素发酵过程主要变量的典型变化曲线8PenicillinFermentationProfile变化曲线76PenicillinFermentationProfil青霉素发酵过程中的代谢流分布发酵100小时。括号内数字是代谢流分布摩尔百分比。77青霉素发酵过程中的代谢流分布发酵100小时。括号内数字是代谢钙离子影响细胞的生长和培养基的pH。泡沫(foam)：天然油脂,如豆油1条件下，将青霉素从BA提取到缓冲液中。可采用连续添加葡萄糖的方法来代替乳糖。在葡萄糖限制生长的条件下，当比生长率低于0.反萃取时表观分配系数K＇与pH值的关系苯乙酸浓度约100ppm超过30～40μg／mL，则发酵单位增长缓慢。补入表面活性剂，如新洁尔灭50mg/L，或聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯和三油酸酯等也能增加青霉素的产量。青霉素发酵分为生长和产物合成两个阶段②分离将乳浊液分成萃取相和萃余相。②钙、镁和钾镁离子少，钾离子多时，菌丝细胞将培养基中氮源转化成各种氨基酸的能力强。影响青霉素萃取效果的主要因素/

(3)萃取(分离)方式①混和料液和萃取剂充分混和形成乳浊液，抗生素自料液转移到萃取相中。(一)发酵液的过滤和预处理菌丝自溶时，在鼓式过滤机表面不能形成紧密的薄层，因而不能自行剥落，使过滤时间增长，滤液量降低，且滤液发浑。青霉素生产工艺青霉素工业化生产主要采用三级发酵的方法78钙离子影响细胞的生长和培养基的pH。青霉素生产工艺青霉素工业２.１菌种青霉（Penicillium)产黄青霉Penicilliumchrysogenum点青霉Penicilliumnotatum79２.１菌种青霉产黄青霉点青霉12一、青霉素生产工艺流程

——种子制备与发酵80一、青霉素生产工艺流程

(二)种子制备

种子制备包括孢子培养和种子培养，孢子培养以产生丰富的孢子为目的，种子培养以繁殖大量健壮的菌丝体(种子罐培养)为主要目的。国内青霉素的生产菌种分为丝状菌和球状菌两种。丝状菌又分为黄孢子丝状菌及绿孢子丝状菌；球状菌分为绿孢子球状菌和白孢子球状菌。生产厂大都采用绿色丝状菌，球状菌发酵单位虽高，但对原材料和设备的要求较高，且提炼收率也低于丝状菌。81(二)种子制备种子制备包括孢子培养和种子培养，孢子培养以产1.丝状菌的种子制备丝状菌的生产菌种保藏在沙土管内。大米茄子瓶内孢子成熟后进行真空干燥，制成大米孢子，并以这种形式低温保存备用。种子质量要求菌丝稠密，菌丝团很少，菌丝粗壮，有中小空胞，处在第Ⅲ～Ⅳ期。种子罐以达到对数生长的后期为培养成熟指标，不能随意延长或缩短培养时间；同时要考虑培养液的流动性，以不影响通过管道向发酵罐接种的速度为宜。821.丝状菌的种子制备丝状菌的生产菌种保藏在沙土管内。152.球状菌的种子制备球状菌的生产菌种是冷冻管孢子。三角瓶培养原始亲米孢子，再移入茄子瓶生产大米孢子(又称生产米)。亲米、生产米孢子都需保存在5℃冰箱内。新鲜的生产米(10d内)接入种子罐培养球状菌以新鲜孢子为佳，其生产水平优于真空干燥的孢子，能使发酵单位的罐批差异减少。832.球状菌的种子制备球状菌的生产菌种是冷冻管孢子。16影响青霉素萃取效果的主要因素/(2)温度和时间二次BA过滤完毕后，对滤饼进行去湿。青霉素易溶于有机溶剂如醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和醚中，在溶媒相中则仅游离酸(青COOH)的形式存在。通过补加糖和生理酸性物质(如硫酸铵等无机氮源)，降低pH。碱化时速度可放慢些，因青霉素在中性环境中破坏要缓和些。加乙酸钾丁醇溶液，共沸结晶青霉素生产工艺流程——提炼通过补加糖和生理酸性物质(如硫酸铵等无机氮源)，降低pH。发酵终点确定及异常情况处理中期泡沫可加油控制，必要时可略为降低空气流量，但搅拌应开足，否则会影响菌的呼吸；07%，V/V)作为助滤剂，通过板框过滤机过滤，得二次滤液。07%外，其余按需要同氮源另行灭菌，待菌丝稠密不再加油时补入。发酵时间的长短应从以下三个方面考虑经过几次反复萃取后共浓缩10倍左右，浓度已符合结晶要求。青霉素发酵过程中的代谢流分布当酸性条件下，呈分子型青霉酸结构，具有良好有机溶剂溶解性质；加入硫代硫酸钠能减少它们的毒性。为了防止较大冰块的产生，冷冻罐一直开动搅拌，尽管如此，仍需要过滤过程迅速。0mg／mL)，对后续各步提取有很大影响，必须去除。(三)发酵培养基组成/1.碳源青霉菌能利用乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、天然油脂等。葡萄糖是容易利用的碳源，有利于菌体的生长。乳糖能被产生菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，故为最佳碳源，但货源少、价格高。玉米油、豆油也能被缓慢利用作为有效的碳源，但不可能大规模使用。采用葡萄糖和乳糖两种碳源就能适合青霉菌发酵过程中的生理变化，在发酵初期利用氧化速率快的葡萄糖使青霉菌大量、迅速、强壮地繁殖菌丝体；当葡萄糖耗尽时青霉菌进入发酵后期，此时利用氧化缓慢的乳糖，使发酵液pH较稳定，避免速效碳源的分解产物阻遏作用，有利于青霉菌大量、持久地分泌青霉素。84影响青霉素萃取效果的主要因素/(2)温度和时间(三)发酵培养(三)发酵培养基组成/1.碳源单独使用葡萄糖，常常因为发酵前期葡萄糖浓度过高，其分解代谢产物对青霉素合成酶产生阻遏(或抑制)或对菌体生长产生抑制作用，而后期葡萄糖浓度降低，限制了菌丝生长和产物合成。为了避免这一现象，青霉素发酵中采用连续流加的方法加入葡萄糖来替代乳糖，既节约了成本，又有利于青霉素的合成。目前生产上用的碳源是葡萄糖母液和工业用葡萄糖，最为经济合理。85(三)发酵培养基组成/1.碳源单独使用葡萄糖，常常因为发酵前(三)发酵培养基组成/2.氮源玉米浆是青霉素发酵最好的氮源。玉米浆是淀粉生产的副产物，含多种氨基酸，如精氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸以及以及为苄青霉素生物合成提供侧链前体β苯乙胺等。现因国内玉米浆产量少，且质量难以控制，也可选用便于保藏和质量稳定的花生饼粉或棉籽饼粉来代替，生产水平也可达到技术指标。目前生产上用的氮源是花生饼粉、麸质、玉米胚芽粉及尿素等。86(三)发酵培养基组成/2.氮源玉米浆是青霉素发酵最好的氮源。(三)发酵培养基组成/3.前体物质前体有苯乙酸及其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等。它们可以作为青霉素G侧链的前体物直接结合到青霉素分子中，也可以作为养料和能源被利用。前体物质对青霉菌都有一定的毒性。苯乙酸、苯乙酰胺等对菌体生长和生物合成均有毒性，其毒性的大小与培养基的pH有关。苯乙酰胺在碱性(pH8)下抑制菌体生长；苯乙酸在酸性(pH5.5)下毒性较大；中性pH下苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前体用量大于0.1％时，除了苯氧乙酸外，其他都对青霉素合成产生抑制。87(三)发酵培养基组成/3.前体物质前体有苯乙酸及其衍生物苯乙前体苯乙酸青霉素G苯氧乙酸青霉素V辛酸青霉素K………..88前体苯乙酸青霉素G21(三)发酵培养基组成/4.无机元素①硫和磷硫浓度降低时青霉素产量减少至1/3，磷浓度降低时青霉素产量减少一半。②钙、镁和钾镁离子少，钾离子多时，菌丝细胞将培养基中氮源转化成各种氨基酸的能力强。钙离子影响细胞的生长和培养基的pH。③铁离子铁易渗入菌丝内，它对青霉素发酵有毒害作用。Fe3+含量6μg／mL以下时无影响；超过30～40μg／mL，则发酵单位增长缓慢。60μg／mL时降低产量30％；300μg／mL时降低产量90％。89(三)发酵培养基组成/4.无机元素①硫和磷硫浓度降低时青霉青霉素发酵培养基基本组成葡萄糖10%；玉米浆4～5％；苯乙酸0.5～0．8％；猪油或植物油、消泡剂0.5％。90青霉素发酵培养基基本组成葡萄糖10%；232.3发酵过程的控制三个不同的代谢时期：菌丝生长繁殖期青霉素分泌期菌丝自溶期912.3发酵过程的控制三个不同的代谢时期：菌丝生长繁殖期青霉Fe3+含量6μg／mL以下时无影响；PenicillinFermentation混合可用机械搅拌混合罐、管道混合器或喷射混合器等。5％，需浓缩才便于结晶。为提高萃取效率将两台离心机串联使用，进行二级对向逆流萃取。加入硫代硫酸钠能减少它们的毒性。07%，V/V)作为助滤剂，通过板框过滤机过滤，得二次滤液。影响青霉素萃取效果的主要因素/

(4)浓缩比影响青霉素萃取效果的主要因素/

(4)浓缩比青霉素发酵分为生长和产物合成两个阶段(三)发酵培养基组成/2.丁酯用量太多，虽然萃取较完全、收率高，但达不到结晶浓度要求，反而增加溶媒的耗用量；根据此机理设计萃取/反萃取步骤进行粗分离。青霉素发酵过程中的代谢流分布中期泡沫可加油控制，必要时可略为降低空气流量，但搅拌应开足，否则会影响菌的呼吸；加入硫代硫酸钠能减少它们的毒性。在葡萄糖限制生长的条件下，当比生长率低于0.醋酸钾乙醇溶液配制的水分应控制在9.将发酵滤液用10％硫酸调pH2.0mg／mL)，对后续各步提取有很大影响，必须去除。07%外，其余按需要同氮源另行灭菌，待菌丝稠密不再加油时补入。(四)发酵条件控制环境变量比较直观，容易控制。包括温度、pH值、基质浓度、溶氧饱和度等。生理变量，在许多情况下不能直接测定和定量，控制也较困难。包括菌丝浓度、菌丝生长速度、菌丝形态等。92Fe3+含量6μg／mL以下时无影响；(四)发酵条件控制环境1.加糖控制乳糖是青霉素生物合成的最好碳源，葡萄糖的分解代谢物会抑制青霉素的合成。可采用连续添加葡萄糖的方法来代替乳糖。对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质(葡萄糖、胺、苯乙酸等)进行缓慢流加，以维持一定的最适浓度。加糖主要控制残糖量，加入量主要决定于耗糖速度、pH值变化、菌丝量及培养液体积。目前，糖浓度的检测尚难在线进行，故葡萄糖的流加不是根据糖浓度控制，而是间接根据pH值、溶氧或CO2释放率予以调节。931.加糖控制乳糖是青霉素生物合成的最好碳源，葡萄糖的分解代谢2.pH控制前期60h内维持pH6.8～7.2，以后稳定在pH6.5左右。应尽量避免pH超过7.0。因为青霉素在碱性条件下不稳定，容易加速其水解。通过补加糖和生理酸性物质(如硫酸铵等无机氮源)，降低pH。通过补加CaCO3、氨水或尿素，也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高pH。加油较多时要适当减少葡萄糖的量。用酸或碱来调节往往会超过控制范围，导致菌体代谢朝不利于抗生素合成的方向变化。不同方法控制pH对青霉素合成的影响如图所示。942.pH控制前期60h内维持pH6.8～7.2，以后稳定在p不同方法控制pH对青霉素合成的影响

95不同方法控制pH对青霉素合成的影响283.补料及添加前体分次补加硫酸铵、氨或尿素等氮源，可以延长发酵周期、调节pH、前体转化率为46％～90％。浓度过大对菌体产生不利影响，除基础料中加入0.07%外，其余按需要同氮源另行灭菌，待菌丝稠密不再加油时补入。为了尽量减少苯乙酸的氧化，采用间歇或连续添加低浓度前体物质的方法，保持前体的供应速率仅略大于生物合成的需要，控制苯乙酸0.1％、苯乙酰胺0.05％～0.08％。加入硫代硫酸钠能减少它们的毒性。963.补料及添加前体分次补加硫酸铵、氨或尿素等氮源，可以延长发3.补料及添加前体补入表面活性剂，如新洁尔灭50mg/L，或聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯和三油酸酯等也能增加青霉素的产量。加入少量可溶性高分子化合物，如40mg／L聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚二乙胺或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，能使青霉素产率增加。①高分子化合物能使邻近搅拌叶的液体速度梯度降低，避免打断菌丝，②高分子化合物起分散剂的作用，菌丝不致成团，增加了氧传递到菌丝体内的速度。同时还有利于除去CO2；973.补料及添加前体补入表面活性剂，如新洁尔灭50mg/L，或4.温度控制青霉菌生长的适宜温度为30℃，而分泌青霉素的适宜温度是20℃左右，采用分段变温控制，可延缓菌丝衰老，增加溶解氧浓度，延长发酵周期，有利于发酵后期青霉素单位的增长，减少发酵液中青霉素的降解破坏，提高产量。种子罐培养丝状菌25℃，球状菌28℃。发酵罐丝状菌26℃→24℃→23℃→22℃；球状菌26℃→25℃→24℃。984.温度控制青霉菌生长的适宜温度为30℃，而分泌青霉素的适宜5.溶氧浓度控制溶氧浓度降到30％饱和度以下，青霉素产量急剧下降；低于10%饱和度时，则造成不可逆转的损失。发酵液中溶氧浓度过高，说明菌丝生长不良或加糖率过低，使呼吸强度下降同样影响生产能力的发挥。一般控制通气比为l∶(0.8～1)[W/(V·min)]，搅拌转速为150～200r／min。中、后期减慢转速对球状菌的生理生化代谢有利，能提高发酵单位，并能节约能源。丝状菌种子罐的搅拌转速快于发酵罐，而球状菌种子罐的转速慢于发酵罐。氧消耗与糖消耗成正比，故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的参考指标之一。995.溶氧浓度控制溶氧浓度降到30％饱和度以下，青霉素产量急剧6.菌体浓度青霉素发酵分为生长和产物合成两个阶段①菌丝生长繁殖期糖及含氮物质迅速利用。对丝状菌而言，孢子发芽长出菌丝，分枝旺盛。对球状菌而言，孢子发芽后菌丝生长逐步发育成球状。此时青霉素分泌量很少，菌体浓度迅速增加，应通过限制糖的供给进行控制。②青霉素分泌期菌丝生长趋势减弱，青霉素分泌旺盛。应间歇添加葡萄糖、花生饼粉、尿素、前体。丝状菌pH要求6.2～6.4，球状菌pH要求6．6～6.9。氧传递率(OTR)及氧消耗率(OUR)与菌体浓度关系密切。每个具有固定通气、搅拌条件的发酵罐，都有一个使OTR和OUR在某一溶氧水平上达到平衡的临界菌体浓度，必须控制菌体浓度使之不超越临界值。1006.菌体浓度青霉素发酵分为生长和产物合成两个阶段338菌体生长速度在葡萄糖限制生长的条件下，当比生长率低于0.015／h时，比生产率与比生长率成正比；当比生长率高于0.015／h时，比生产率与比生长率无关。因此，要在发酵过程中达到并维持最大比生产率，必须使比生长率不低于0.015／h。这一比生长率称为临界比生长率。事实上，青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长率要比这一理论值低得多，却仍然能达到很高的比生产率。这是由于不断有部分菌丝自溶，故虽然表观比生长率较低，但真比生长率却要高一些。1018菌体生长速度在葡萄糖限制生长的条件下，当比生长率低于0.09.菌丝形态丝状菌所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触，故一般比生产率较高。菌丝球则由于发酵液粘度显著降低，使气液两相间氧的传递速率大大提高，从而允许更多的菌丝生长(即临界菌丝浓度较高)，发酵罐体积产率甚至高于丝状菌。在丝状菌发酵中，控制菌丝形态使其保持适当的分枝和长度并避免结球，是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中，使菌丝球保持适当的大小和松紧，并尽量减少游离菌丝的含量，也是充分发挥其生产能力的关键要素之一。这种形态的控制，与糖和氮源的流加状况、搅拌的剪切强度及比生长率(稀释率)密切相关。1029.菌丝形态丝状菌所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触10.泡沫与消沫前期泡沫主要是花生饼粉和麸质水引起的，泡沫多，可间歇搅拌，不能多加油；中期泡沫可加油控制，必要时可略为降低空气流量，但搅拌应开足，否则会影响菌的呼吸；发酵后期尽量少加消泡剂。“泡敌”(聚醚树脂类消沫剂)可部分代替天然油脂。BAPE型(聚氧丙烯聚氧乙烯三聚丙醇胺醚)的消泡能力强、毒性较低，优于GPE型(聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚)，在菌丝生长繁殖期不宜多用，中、后期泡敌与豆油交替加入。10310.泡沫与消沫前期泡沫主要是花生饼粉和麸质水引起的，泡沫多11.发酵终点确定及异常情况处理发酵时间的长短应从以下三个方面考虑①累计产率(发酵累计总亿产量与发酵罐容积及发酵时间之比值)最高；②单产成本(发酵过程中的累计成本投入与累计总亿产量之比值)最低；③发酵液质量好(抗生素浓度高，降解产物少，残留基质少。菌丝自溶少)。前期菌丝生长不良，发酵异常时可采取倒出部分发酵液，补入部分新鲜料液和良好的种子。前期染菌或种子带菌，可采用重新消毒并补入适量的糖、氮成分。中后期发生染菌若是产气细菌则应及时放罐过滤、提炼，事后彻底消毒处理。发酵单位停滞不长，可酌情提前放罐。10411.发酵终点确定及异常情况处理发酵时间的长短应从以下三个方发酵级别主要培养基搅拌速度(rpm)培养时间(h)酸度范围培养温度一级发酵葡萄糖、乳糖、玉米浆300~35040自然pH27℃±1二级发酵葡萄糖、玉米浆250~2800~14自然pH25℃±1三级发酵花生饼粉、葡萄糖、尿素、苯乙酰氨、硫代硫酸钠等150~200按产生青霉素的趋势决定停止发酵前６０h左右６.７～７.２以后为６.７前６０h左右２６℃，以后２４℃105发酵主要搅拌培养酸度培养一级葡萄糖、乳糖、玉米浆300~35青霉素发酵的主要工艺控制点操作变量工艺控制点操作变量工艺控制点发酵罐容积150~200m3发酵温度~25℃装料率~80%发酵液pH~6.5搅拌输入功率3~4kW/m3初始菌体浓度1.5~1.8kg(干重)/m3通气率40~60Nm3/(m3·h)葡萄糖料液浓度~450kg/m3空气压力（表压）0.2MPa葡萄糖补加率1.0~2.5kg/(m3·h)发酵液上方压力（表压）0.03~0.06MPa发酵液中铵氮浓度0.25~0.34kg/m3液相氧体积传递系数(kLa)200h-1发酵液中苯乙酸浓度~0.1kg/m3发酵液中溶氧浓度>30%饱和度发酵时间180~240h106青霉素发酵的主要工艺控制点操作变量工艺控制点操作变量工艺控制青霉素生产工艺流程——提炼107青霉素生产工艺流程——提炼40二.青霉素提取工艺原理1.青霉素的两性性质由于青霉素结构中羧基结构，使得青霉素在不同pH下呈现不同的溶解性质。当酸性条件下，呈分子型青霉酸结构，具有良好有机溶剂溶解性质；当碱性条件下，呈离子型结构，易溶于水而难溶于有机溶剂。根据此机理设计萃取/反萃取步骤进行粗分离。

2.共沸结晶青霉素钾在乙酸丁酯中溶解度非常低，青霉素钾盐丁醇稀释液蒸馏时形成丁醇一水二元共沸物，利用丁醇一水二组分在较宽的液相组成范围内蒸馏温度稳定、溶液沸点下降等特点，在共沸蒸馏过程中以补加丁醇的方法将水分带走，使溶液逐步达到过饱和状态而析出结晶。108二.青霉素提取工艺原理1.青霉素的两性性质41四、青霉素的提取发酵液中青霉素的浓度很低，折合重量计算仅含2.5％，需浓缩才便于结晶。早期曾用活性炭吸附法，沉淀法或离子交换法，目前多用溶剂萃取法。青霉素游离酸易溶于醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和醚等有机溶剂，在水中的溶解度很小，且迅速丧失其抗菌能力。由于青霉素的性质不稳定，整个提取和精制过程应在低温下快速进行，并应注意清洗和保持在稳定的pH值范围，注意对设备清洗消毒减少污染，尽量避免或减少青霉素效价的破坏损失。109四、青霉素的提取发酵液中青霉素的浓度很低，折合重量计算仅含2四、青霉素的提取青霉素的金属盐极易溶于水，几乎不溶于乙醚、氯仿或醋酸戊酯，易溶于低级醇，略溶于乙醇、丁醇、酮类或醋酸乙酯中，但如果此类溶剂中含有少量水分时，则青霉素的金属盐在溶剂中的溶解度就大大增加。溶剂萃取法提取即利用青霉素与碱金属所生成的盐类在水中溶解度很大，而青霉素游离酸易溶解于有机溶剂中这一性质，将青霉素在酸性溶液中转入有机溶剂醋酸丁酯(BA)中，然后再转入中性水相中。经过这样反复几次萃取，就能达到提纯和浓缩的目的。110四、青霉素的提取青霉素的金属盐极易溶于水，几乎不溶于乙醚、氯2.4青霉素的提取

发酵停止冷却（加入１％～２％甲醛，加入CaCl2)过滤萃取（先酸化，然后用萃取剂萃取,再用缓冲溶液提取）脱色结晶（加入３～４倍体积的丁醇，真空蒸馏，将水与丁醇蒸出）烘干1112.4青霉素的提取发酵停止冷却（加入１％～２％甲醛青霉素游离酸的丁酯提取液加入醋酸钾、醋酸钠，就分别析出青霉素钾盐、钠盐的结晶；影