华中科技大学发酵工程 第二章 工业用微生物菌种

发酵工程FermentationEngineering精品课程华中科技大学生命科学与技术学院http：///jpkc第二章发酵工业菌种/jpkc本章内容

一、常用的工业微生物二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术三、发酵工业菌种改良/jpkc/jpkc对产物进行菌种筛选时，有两条经验：进化上向上兼容；次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才有筛选意义。/jpkc/jpkc最常用的工业微生物细菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌乳酸杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌/jpkc最常用的工业微生物酵母菌酿酒酵母假丝酵母属产朊假丝酵母解脂假丝酵母热带假丝酵母毕赤酵母属、汉逊酵母属/jpkc最常用的工业微生物霉菌曲霉属米曲霉黑曲霉青霉属青霉菌：点青霉、产黄青霉桔青霉根霉属德氏根霉米根霉、小麦曲根霉红曲霉属紫红曲霉/jpkc最常用的工业微生物放线菌链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌/jpkc未培养微生物定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99％。研究方法模拟自然培养法:原位培养、培养条件优化、单细胞操作宏基因组分析法/jpkc二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求（二）分离筛选原理与技术（三）应用举例/jpkc1.菌菌种选择的的总趋势野生菌→变变异菌自然选育→→代谢控制制育种诱发基因突突变→基因因重组的定定向育种/jpkc2.菌种种选择的要要求能在廉价原原料制成的的培养基上上迅速生长长，且生成成的目的产产物产量高高、易于回回收；生长速度和和反应速度度较快，发发酵周期较较短；培养条件易易于控制；；抗噬菌体及及杂菌污染染的能力强强；/jpkc2.菌种种选择的要要求（续））菌种不易变变异退化；；对放大设备备的适应性性强；菌种不是病病原菌，不不产生任何何有害的生生物活性物物质和毒素素。/jpkc（二）分离离筛选原理理与技术1.筛选的指导导思想2.分离筛选工工作在实际际中应用的的几个方面面3.新种分离筛筛选原理与与技术/jpkc1.筛选选的两种指指导思想先分离纯化化，再结合合工艺要求求进行筛选选。分离纯化同同时富于筛筛选条件，，一步得出出所需菌株株。结果有两种种可能：获得适于工工业发酵菌菌株只获得选育育所需的出出发菌株/jpkc2.分离离筛选工作作在实际中中应用的几几个方面从被污染的的生产及科科研用菌中中分离目的的菌；生产中长期期使用的菌菌种的定期期分离筛选选；从各种育种种方法处理理的微生物物材料中分分离筛选适适于工业目目的的优良良菌株；从已知菌种种和大自然然中分离新新菌株寻找新的发发酵产品的的产生菌；；寻找老产品品的新的优优良菌株。。从保藏机构构获取菌种种进行分离离筛选有两两个好处：：经济性指导性/jpkc设计筛选方方案时必须须考虑两个个要点选择性灵敏度/jpkc3.新种种分离与筛筛选的步骤骤调查研究（（包括资料料查阅）试验方案设设计含微生物物样品的的采集（如何使使样品中中含所需需微生物的可可能性大大？）样品预处处理（如何在在后续的的操作中中使这种种可能性实现现）菌种分离离/jpkc根据目的的菌株及及其产物物特点分分选择性分分离方法法随随机分离离方法(定向筛选选←选择择压力)(用筛选方方案-检检测系系统进行行间接分分离）富集液体体培养固固体体培养基基条件培培养(初筛)菌种纯化化复筛/jpkc菌种纯化化初步工艺艺条件摸摸索再再复筛生生产产性能测测试较优菌株株1-3株保藏及进进一步做做生产试试验某某些些必要试试验和或作为育育种的出出发菌株株毒毒性性试验等等/jpkc含微生物物样品的的采集采样时应应注意的的问题:土壤微生生物的分分布采土深度度土壤植被被情况采样季节节土壤的酸酸碱度对于分离离筛选新新菌种，，还存在在另两个个选择标标准：土壤来源源广泛在已适应应相当苛苛刻环境境压力的的微生物物类群中中寻找新新菌种/jpkc样品的预预处理目的：提提高分离离效率方法：物理方法法：热处处理；膜膜过滤法法；离心心法化学方法法诱饵法/jpkc分离方法法的选择择根据目的的菌有无无选择性性特征来来选择分分离方法法菌种的营营养特征征独特生长特征征独特无选择性特特征根根据据产物的的特征进进行随机分离离选择性分分离的关关键：生生长培养养条件的的选择与与控制，，从而实实现定向向富集筛筛选。选择性分分离/jpkc选择性分分离原理理和技术术生长条件件的选择择与控制制原理控制营养养成分控制培养养基酸碱碱度添加抑制制剂控制培养养温度控制通气气条件选择性分分离技术术富集液体体培养技技术固体培养养技术施加选择择压力，，进行定定向筛选选/jpkcA.富集集液体培培养增加混合合菌群中中所需菌菌株数量量的一种种技术技术特点点：给混混合菌群群提供一一些有利利于目的的菌株生生长或不不利于目目的菌以以外的其其他菌型型生长的的条件培养方式式分批培养养方式：：以最大大比生长长速率（（μmax）筛选，，存在选选择压力力的控制制、移种种时间和和次数等等问题连续培养养方式：：以比生生长速率率（μμ）筛选选/jpkcμABS0基质浓度度对A、、B两种种菌的比比生长速速率（μμ）的影影响当S<S0时，富集集什么菌菌株？当S>S0时，富集集什么菌菌株？/jpkc连续富集集培养技技术分离离菌株的的优点分离的菌菌株特别别适合连连续发酵酵生产过过程有利于分分离具有有某种工工业生产产特性的的菌株可以筛选选出能共共生的稳稳定混合合培养物物/jpkcB.固体培养养技术常用于分分离某些些酶产生生菌选择压力力：在选选择培养养基中加加入所需需酶的基基质/jpkc随机分离离原理与与技术从产物入入手，通通过设计计高产培养养基和建立快快速灵敏敏专一的的筛选方方法，从从随机分分离的菌菌落中筛筛选出所所需的目目的菌。。技术关键：产产物合成成条件的的选择与与控制及及相应筛筛选方法法的确定定。随机分离离技术举举例抗生素产产生菌的的筛选药理活性性化合物物产生菌菌的筛选选生长因子子产生菌菌的筛选选多糖产生生菌的筛筛选/jpkc高产培养养基设计计的几个个原则制备一系系列的培培养基，，其中有有各种类类型的养养分成为为生长限限制因素素；使用一聚聚合或复复合形式式的生长长限制养养分；避免使用用容易同同化的碳碳源或氮氮源，防防止分解解代谢物物阻遏；；确定含有有所需的的辅因子子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH缓冲剂以以减少pH变化；前体、促促进剂及及抑制剂剂的采用用。/jpkc抗生素产产生菌的的筛选筛选模型型：试验菌筛选方法法：铺菌法复印平板板法液体培养养筛选抗药性筛选筛选模型型：氨苄青霉霉素和β-内酰酰胺酶产生菌（（克雷白白氏菌））协同III无试样时时（不含含棒酸时时），I对II菌作用用不大有试样时时（含棒棒酸时）），I对对II菌菌恢复药药效，棒棒酸抑制制水解酶酶活性固体培养养筛选/jpkc试验菌代代表微生生物类型型金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌209p革革兰兰氏氏阳阳性性球球菌菌枯草草杆杆菌菌6633革革兰兰氏氏阳阳性性杆杆菌菌大肠肠杆杆菌菌革革兰兰氏氏阴阴性性肠肠道道细细菌菌耻垢垢分分枝枝杆杆菌菌607结核核杆杆菌菌白色色念念珠珠菌菌酵酵母母状状真真菌菌青霉霉菌菌丝状状真真菌菌/jpkc药理理活活性性化化合合物物产产生生菌菌的的筛筛选选药理理活活性性化化合合物物是是指指能能抑抑制制人人类类代代谢谢中中某某一一个个关关键键酶酶的的微微生生物物产产物物即即酶酶抑抑制制剂剂，，从从而而达达到到治治疗疗的的目目的的。。筛选选模模型型：：目目标标酶酶/jpkc生长长因因子子产产生生菌菌的的筛筛选选筛选选模模型型：：营营养养缺缺陷陷型型试试验验菌菌筛选选方方法法：：利利用用被被分分离离的的微微生生物物产产物物能能否否促促进进营营养养缺缺陷陷型型试试验验菌菌生生长长/jpkc氨基基酸酸产产生生菌菌的的筛筛选选样品品预处处理理初筛筛（（除除真真菌菌））在分分离离平平板板上上生生长长获获得得多多个个单单菌菌落落复印印平平板板（（copy法法））平板板培培养养，，其其中中有有产产生生氨氨基基酸酸的菌菌落落分分泌泌氨氨基基酸酸对应应到到copy前前相相应应u.v线线杀杀死死长长好好的的菌菌落落位置置，，找找到到目目的的菌菌落落再铺铺上上一一层层含含营营养养缺缺陷陷型型试试验验菌菌的的琼琼脂脂培养养后后产氨氨基基酸酸菌菌落落周周围围有有生生长长圈圈目的的菌菌落落进进行行液液体体培培养养，，对产产物物进进行行定定量量测测定定筛选选产产物物含含量量高高的的菌菌株株多糖糖产产生生菌菌的的筛筛选选取样特特点：：碳水水化合合物工工业的的废弃弃物筛选方方案：：从菌菌落外外观判判断，，选择择外观观呈粘粘液状状的菌菌落，，然后后根据据液体体培养养测定定多糖糖含量量来筛筛选高高产菌菌。/jpkc细菌分分离：：以乳乳酸菌菌为例例取未成成熟的的酱醪醪样品品1g至至无菌菌磨口口瓶中中加麦芽芽汁至至瓶口口处，，封塞塞，25℃℃培养养24-48h培养基基中长长出绢绢丝状状波动动物，，镜检检杆杆状，，阳性性染色色初初步断断定乳乳酸菌菌用选择择性培培养基基分批批富集集培养养2-3代稀释分分离法法分离离单菌菌落，，培养养基为为含麦麦芽汁汁、CaCO3的琼脂脂培养养基根据透透明圈圈挑选选菌落落性能测测定（（镜检检杆状状，染染色阳阳性；；乳酸酸纸层层析鉴鉴定））Rf值定性性（有机机酸呈呈黄斑斑点））乳酸生生成量量测定定（滴滴定法法）/jpkc放线菌菌的分分离：：以以产链链霉素素菌种种的分分离为为例（（从从退化化菌种种中筛筛选））取工业业发酵酵液（（含孢孢子））样品品1环环放入带带玻璃璃珠的的装有有10ml无菌水水的小小三角角瓶中中，摇摇匀采用稀稀释法法制平平板，，获取取单菌菌落斜面保保藏高高产产菌恢恢复根据高高产菌菌的特特点，，选择择目的的菌落落放大培培养，，发酵酵液性性能测测试/jpkc筛选模模型：：形态态依据据真菌的的分离离筛选选：以以啤酒酒酵母母的分分离为为例取发酵酵液少少许以以10倍稀稀释成成10-1-10-7稀释分分离法法取0.1ml加加入入固体体培养养基铺铺平皿皿（××2））在麦芽芽汁固固体培培养基基上，，25℃培培养48-72h形态筛筛选根根据正正常株株特点点进行行挑选选，接接种斜斜面备备用纯化，，采用用平板板分离离法进进一步步纯化化，至至少反反复三三次①生成成子囊囊孢子子速度度测定定②②发酵酵力测测定性能测测定③③热死死温度度测定定④凝集集力测测定⑤双乙乙酰含含量测测定/jpkc菌种选选育改改良的的具体体目标标提高目目标产产物的的产量量提高目目标产产物的的纯度度，减减少副副产物物改良菌菌种性性状，，改善善发酵酵过程程改变生生物合合成途途径，，以获获得高高产的的新产产品/jpkc发酵工工业菌菌种改改良方方法常规育育种(诱变育育种)细胞工工程育育种基于代代谢调调节的的育种种技术术基因工工程育育种蛋白质质工程程育种种代谢工工程育育种/jpkc赖氨酸酸生产产菌种种的选选育改改良思思路出发菌菌株：黄色色短杆杆菌、、谷氨氨酸棒棒杆菌菌、乳乳糖发发酵短短杆菌菌育种思思路1.优优先合合成的的转换换———渗漏漏缺陷陷型的的选育育2.切切断支支路代代谢———营营养缺缺陷型型的选选育：：高丝丝氨酸酸缺陷陷型3.抗抗结构构类似似物突突变株株的选选育：：AEC4.解解除代代谢互互锁：：Leu-、抗Leu结结构类类似物物、喹喹啉s、苯苯醌s5.增增加前前体物物的合合成和和阻塞塞副产产物的的生成成：Ala-、抗Asp结构构类似似物选育适适宜的的CO2固定酶酶/TCA循环环酶活活性比比突变变株6.改改善细细胞膜膜的透透过机机能7.选选育育温度度敏感感突变变株8.应应用用细胞胞工程程和基基因工工程育育种选育适适宜的的CO2固定酶酶/TCA循环环酶活活性比比突变变株赖氨酸酸合成成中间间代谢谢有以以下两两条途途径：：①通过TCA循环葡萄糖糖丙丙酮酸酸草草酰酰乙酸酸天天冬氨氨酸赖氨酸酸②通过磷磷酸烯烯醇丙丙酮酸酸羧化化反应应葡萄糖糖磷磷酸酸烯醇醇草草酰酰乙酸酸天天冬氨氨酸式丙酮酮酸丙酮酸酸赖氨酸酸/jpkc代谢工工程的的定义义利用多多基因因重组组技术术有目目的地地对细细胞代代谢途途径进进行修修饰、、改造造，改改变细细胞特特性，，并与与细胞胞基因因调控控、代代谢调调控及及生化化工程程相结结合，，为实实现构构建新新的代代谢途途径，，生产产特定定目的的产物物而发发展起起来的的一个个新的的学科科领域域。又称作作途径径工程程，是是多基基因的的基因因工程程。/jpkc代谢工工程发展基基础代谢网网络理理论：：是把把细胞胞的生生化反反应以以网络络整体体，而而不是是孤立立地来来考虑虑。代谢网网络分分流处处的代代谢产产物称称为节节点，，其中中对终终产物物合成成起决决定作作用的的少数数节点点称为为主节节点。。根据节节点下下游分分支的的可变变程度度，节节点分分为：：柔性节节点：解解除一一个分分支的的反馈馈抑制制可提提高该该分支支下游游产物物的产产量。。半柔性性节点点：须降降低主主分支支的酶酶活并并同时时提高高次分分支的的酶活活或解解除其其反馈馈抑制制，才才可提提高次次分支支下游游产物物的产产量。。刚性节节点：其下下游各各分支支的比比例不不易改改变。。/jpkc代谢工工程发展基基础相依网网络：代谢谢网络络中各各主节节点集集中于于产物物，为为了避避免中中间物物的过过量积积累，，各分分支的的代谢谢流都都必须须保持持平衡衡，各各分支支的分分流相相等，，各节节点的的重要要性相相同。。独立网网络：代谢谢网络络的主主节点点不集集中，，可以以通过过对代代谢的的修饰饰来影影响产产物的的产量量,其其对代代谢修修饰的的应答答能力力，取取决于于各节节点的的刚柔柔性及及其位位置。。SIPSⅠⅠⅡⅡPⅡBB1B2相依网网路独立网网路/jpkc（三））代谢谢工程程育种种思路路1.改变代代谢流流：改变分分支代代谢途途径的的流向向，阻阻断有有害代代谢产产物的的合成成。（1））加速速限速速反应应（2））改变变分支支代谢谢途径径流向向：提高代代谢分分支点点的某某一分分支代代谢途途径酶酶系的的活