五章微生物培养技术及理论2课件

第五章

微生物培养技术及理论内容1微生物反应过程的计量关系2微生物反应动力学第一节发酵过程的反应描述

XS（底物）─→X（菌体）＋P（产物）发酵研究的内容：发酵过程反应的描述菌种的来源——找到一个好的菌种发酵过程的工艺控制——最大限度发挥菌种的潜力微生物反应过程的计量学

化学计量学：是对化学反应体系的组成和化学反应转化程度的数量化研究，它与反应热力学和动力学一起共同作为反应工程学的基础。根据化学计量学，可以知道有关反应过程中各种反应组分组成及变化规律，各种反应代谢之间的数量关系。目的：对反应过程进行控制和优化，争取获得最大的经济收益。单细胞蛋白生产（SCP）利用糖类生产单细胞蛋白1.化学计量式2.得率系数第一节微生物反应中的计量关系例题：(选自贾士儒48－69页)1.葡萄糖为基质进行面包酵母（S.cereviseae）培养，培养的反应式可用下式表达，求计量关系中的系数a、b、c、d。反应式为：

C6H12O6＋3O2＋aNH3→bC6H10NO3(面包酵母)＋cH2O＋dCO2

解：据平衡方程式,可得：C:6=6b+dH:12+3a=10b+2cO:6+6=3b+c+2dN:a=b方程联立求解为：a=b＝0.48c=4.32d=3.12上述反应计量关系式为:C6H12O6＋3O2＋0.48NH3→

0.48C6H10NO3＋4.32H2O＋3.12CO2

1.2以形成菌体和产物为目的发酵葡萄糖为碳源，NH3为氮源进行酵母厌氧发酵。培养中分析结果表明，消耗100mol葡萄糖和12molNH3生产了57mol菌体、43mol甘油、130mol乙醇、154molCO2和3.6molH2O。当形成产物时，微生物反应定性表示为：解：据题意写出相应的反应方程为：100C6H12O6＋12NH3→57CaHbOcNd＋43C3H5(OH)3＋130C2H5OH＋154CO2＋3.6H2OC:600=57a＋43×3＋130×2＋154a=1H:100×12+12×3=57×b+43×8+130×6+3.6×2b=1.84O:600=57c+43×3+130＋154×2+3.6c=0.52N:12=57dd=0.21故酵母细胞的化学结构式为CH1.84O0.52N0.21练习1．葡萄糖为碳源，NH3为氮源进行酿酒酵母好氧发酵。呼吸商1.04。消耗100mol葡萄糖和48molNH3生产了48mol菌体、312molCO2和432molH2O。求酵母菌体的化学组成和氧的消耗量。

呼吸商RQ：细胞反应中每消耗1molO2

所产生的CO2

的量，mol/mol。RQ＝CO2

生成速率/O2消耗速率部分菌体得率与产物得率得率定义单位YX/S

消耗1g或1mol基质获得的干菌体克数，g/g,g/molYX/O消耗1g或1mol

O2获得的干菌体克数，g/g,g/molYX/N

消耗1g氮产生的干菌体克数，g/gYX/NO3-消耗1mol

NO3－获得的干菌体克数，g/molYX/H1mol氢受体产生的干菌体克数，g/molYP/S

消耗1mol基质获得的产物的量，mol/molYATP

消耗1molATP获得的干菌体克数，g/molYKJ消耗1KJ热量获得的干菌体克数，g/KJYCO2/S消耗1mol基质产生的CO2的摩尔数，mol/molYCO2/O消耗1molO2产生的CO2的摩尔数，mol/molYATP/S消耗1mol基质获得的ATP的摩尔数，mol/molYave-消耗1个有效电子获得的干菌体克数，g/ave－1．葡萄糖为碳源，NH3为氮源进行某细菌的好氧培养。消耗的葡萄糖有2/3的碳源转化为细胞中的碳。反应式为：C6H12O6＋aO2＋bNH3→c(C4.4OH7.3N0.86O1.2)＋dH2O＋eCO2

计算上述反应中的得率系数YX/S

和YX/O解：据平衡方程式,可得：

C:6=4.4c＋eH:12+3b=7.3c+2dO:6+2a=2.2c+d+2eN:b=0.86c由于1mol葡萄糖中含碳72g,转化为细胞内的碳为72×2/3=48(g)故：（4.4×12）c=48得：c=0.91转化为CO2的碳为72－48＝24（g）故：12e=24e=2解平衡方程中其他未知数，得：

b=0.78;d=3.85;a=1.47故平衡方程为：C6H12O6＋1.47O2＋0.78NH3→0.91(C4.4OH7.3N0.86O1.2)＋3.85H2O＋2CO2YX/S＝0.91×（12×4.4＋16＋7.3＋14×0.86＋16×1.2）/180＝0.46(g/g)(以细胞/葡萄糖计)YX/O＝83.1/（1.47×32）＝1.77(g/g)(以细胞/氧计)一菌体得率1．YKJ：微生物对能量的利用(消耗1KJ热量获得的干菌体克数，g/KJ)YKJ＝

ΔX(细胞生产量)

Ea(细胞贮存自由能)+Eb(分解代谢释放自由能)

＝(-ΔHa)(ΔX)+(-ΔHc)ΔHa:菌体X的燃烧热为基准的焓变，因菌体不同，一般取值ΔHa＝－22.15kJ/gΔHc:所消耗基质的焓变与代谢产物焓变之差，－ΔHc

＝(-ΔHs)(-Δ[S])-∑(-ΔHp)(Δ[P])

＝(-ΔH0*)(-Δ[O2])ΔHs:碳源氧化的焓变，kJ/mol；

ΔHp:产物氧化的焓变，kJ/mol；

ΔH0*:为呼吸反应焓变＝－444kJ/mol-[O2]故总表达式可写为：

YKJ＝

ΔX(-ΔHa)(ΔX)+(-ΔHs)(-Δ[S])-∑(-ΔHp)(Δ[P])

＝

Yx/s(-ΔHa)Yx/s+(-ΔHs)-∑(-ΔHp)Yp/s

干酪乳杆菌在蛋白胨、牛肉膏为主要成分的复合培养基中，分别以葡萄糖、甘露醇为能源进行培养，计算YKJ由化工手册查知：ΔH葡萄糖＝－2816kJ/mol，ΔH乙酸＝－870kJ/mol，ΔH乙醇＝－1368kJ/mol，ΔH甲醇＝－264kJ/mol，ΔH乳酸＝－1363kJ/mol，ΔH甘露醇＝－3038kJ/mol，ΔHa＝－22.15kJ/mol能源Yp/s（mol/mol）(以产物/基质计)Yx/s(g/mol）(以细胞/基质计)乳酸乙酸乙醇甲醇葡萄糖0.051.050.941.7662.0甘露醇0.40.221.291.640.5解：以葡萄糖为能源时，YKJ

＝

Yx/s(-ΔHa)Yx/s+(-ΔHs)-∑(-ΔHp)Yp/s其中:∑(-ΔHp)Yp/s＝1363×0.05＋870×1.05＋1368×0.94

＋264×1.76

＝2732（kJ/mol）YKJ

＝

62.022.15×62.0+2816-2732

＝0.043（g/kJ）以甘露醇为能源时,∑(-ΔHp)Yp/s＝1363×0.4＋870×0.22＋1368×1.29

＋264×1.6

＝2925（kJ/mol）YKJ

＝

40.522.15×40.5+3038-2925

＝0.041（g/kJ）

2．

反应热（代谢热或发酵热）

ΔHh

＝基质燃烧热－菌体燃烧热－产物燃烧热

=ΔHsΔ[S]-ΔHxΔX-∑ΔHpΔ[P]

例题：葡萄糖为惟一碳源进行酵母培养。反应式为：

1.11C6H12O6＋2.10O2→C.3.92H6.5O1.94＋3.42H2O＋

2.75CO2

求（1）Yx/s;(2)生成1kg细胞量时的ΔHh。已知酵母细胞和葡萄糖的燃烧热分别为1.50×104kJ/kg和1.59×104kJ/kg。解：Yx/s＝酵母细胞分子质量/1.11×葡萄糖分子质量＝3.92×12＋6.5＋1.94×16/1.11×180＝84.58/199.8＝0.42（kg/kg）生成1kg酵母细胞需要葡萄糖1/0.42=2.38(kg)ΔHh

＝ΔHsΔ[S]-ΔHxΔX

＝1.59×104×2.38－1.50×104×1

＝2.25×104（kJ）2.分别采用含有蛋白胨和牛肉膏的复合培养基、含有多种氨基酸合成培养基和基本培养基进行单胞菌的厌氧培养。碳源为葡萄糖，获得如下结果(下表)。已知菌体的含碳量（以碳源/细胞计）为0.45g/g,求采用不同培养基时的YkJ.

化工手册可知ΔH葡萄糖＝－2816kJ/mol,ΔH乙醇＝－1368kJ/mol,ΔH乳酸＝－1363kJ/mol,ΔHa＝－22.15kJ/mol.

培养基Yx/s(g/mol)(以细胞/葡萄糖计)Yp/s(mol/mol)(以乙醇/葡萄糖计)Yp/s(mol/mol)(以乳酸/葡萄糖计)菌体中由葡萄糖所来碳元素的量基本4.11.50.21.0合成5.01.50.20.62复合8.01.60.20.48第二部分微生物反应动力学反应动力学反应速度、反应速度常数、反应级数反应速度：反应速率是化学反应快慢程度的量度。单位时间内、单位体积中反应物浓度的减少或生成物浓度的增加表示。

-dC/dt，

式中C为t时间反应物的浓度，负号表示反应物的浓度逐渐减少

反应速度常数

反应速度与反应物浓度之间有下列关系：-dC/dt=KCn

K为反应速度常数，是指各反应物为单位浓度时的反应速度，单位为[时间]-1

。

K值越大，表示反应物的活泼程度越大反应级数：零级、一级、二级等若反应速度与反应物的浓度无关，这种反应称为零级反应

-dC/dt=K若反应速度与反应物浓度的一次方成正比，则称为一级反应

-dC/dt=KC一发酵动力学研究内容：研究细胞生长速度与产物生成速度的关系及环境条件对速度的影响。二发酵过程的反应描述：

XS（底物）─→X（菌体）＋P（产物）发酵反应动力学的研究内容研究反应速度及其影响因素并建立反应速度与影响因素的关联反应动力学模型反应器特性+反应器的操作模型操作条件与反应结果的关系，定量地在线控制反应过程调整期对数期稳定期衰亡期时间细菌数目的对数某种细菌的生长曲线二微生物生长曲线第一节微生物生长动力学的基本概念一、微生物在一个密闭系统中的生长情况：时间菌体浓度延迟期指数生长期减速期静止期衰亡期延迟期：指数生长期:倍增时间：td静止期：;衰亡期:一指数生长方程dX/dt=（μ－α）X

X为微生物的菌体浓度，单位体积内干细胞质量（g/L）；μ比生长速率，每单位细胞浓度的生长速率(1/min;1/h)；ɑ为细胞自溶或内源代谢速率，其导致细胞量的损失.在指数生长期，μ》ɑ,故上式可改写为：dX/dt=μX，积分变形为：ln(X/X0)=μt或t=ln(X/X0)/μ或X=X0eμt第二节微生物生长动力学注：1）一般情况下，在微生物生长的各阶段，细胞增值规律均符合指数生长定律，但μ值随时间变化；2）在指数生长期，μ值达最大μm，且保持稳定；其他生长期，μ值随时间变化。3）表示微生物生长快慢的另一方法：倍增时间td：菌体细胞质量增加一倍所需的时间td=0.693/μ微生物在一个密闭系统中的生长情况：时间菌体浓度延迟期指数生长期减速期静止期衰亡期延迟期：指数生长期:倍增时间：td静止期：;衰亡期:例：

以乙醇为碳源进行产气杆菌培养，菌体初始浓度X0=0.1kg/m3,培养至3.2h,菌体浓度为8.44kg/m3

，若不考虑延迟期，而且μ一定，求td二Monod方程μ随温度、pH、基质浓度、产物浓度、溶氧等条件而变化.μ＝f(s,p,T,pH,……,)Monod发现：在一定条件下(基质限制)

μ＝f(S)经验公式：μ＝μmS/(Ks+S)

μ：菌体的生长比速（1/h）

S：限制性基质浓度（g/L）

Ks：饱和常数(相当于1/2μm时的限制性基质浓度,g/L

)μmax:最大生长比速（1/h）μ：菌体的生长比速S：限制性基质浓度Ks：饱和常数(相当于1/2μm时的限制性基质浓度,g/L

)μmax:最大生长比速（1/h）1/2μmS《Ks时，μ∞S直线关系S》Ks时，μ≈μm，Ks与μm反映了微生物的特征：Ks反映微生物对基质的亲和力：

Ks小，亲和力大,菌体对基质越敏感kmμmMonod方程的参数求解(双倒数法)：Ks与μm将Monod方程取倒数可得：或：

这样通过测定不同限制性基质浓度下，微生物的比生长速度，就可以通过回归分析计算出Monod方程的两个参数。例：在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据：S(mg/l)63364153221μ(h-1)0.060.240.430.660.70求在该培养条件下，求大肠杆菌的μmax，Ks和td?解：将数据整理：S/μ100137.5192.5231.8311.3S63364153221μmax＝1.11(h-1); Ks＝97.6mg/Ltd＝ln2/μmax＝0.64h1.

在5m3的培养液中按5%接种量接种，原接种液含菌5×106（个/mL），求菌含量为4×109（个/mL）的培养时间。（假定培养期间均S>>Ks,μm=0.8h－1）2.采用合成培养基，在1m3的反应器中对大肠杆菌进行分批培养，菌体生长可用Monod方程描述。已知μm=0.935h－1，Ks=0.71kg/m3,基质初始浓度S=50kg/m3，菌体初始浓度X0=0.1kg/m3,菌体得率YX/S=0.6kg/kg(细胞/基质)。问:当80％基质已消耗所需时间。3.以甘油为基质进行阴沟气杆菌分批培养。时间t=0，X0=0.1g/L,S0=50g/L.，菌体生长可用Monod方程描述，μm=0.85h－1，Ks=1.23×10－2g/L，YX/S=0.6kg/kg(细胞/葡萄糖)。不考虑诱导期和死亡期，求培养6h后的菌体浓度及底物浓度。第三节产物形成动力学一、初级代谢产物和次级代谢产物次级代谢产物：还有一类产物，对细胞的代谢功能没有明显的影响，一般是在稳定期形成，如抗生素等这一类化合物称为次级代谢产物。初级代谢产物：微生物合成的主要供给细胞生长的一类物质。如氨基酸、核苷酸等等，这些物质称为初级代谢产物。二、发酵动力学类型（产物形成和菌体生长关系）：偶联型：产物的形成和菌体的生长相偶联xpt混合型：产物的形成和菌体的生长部分偶联xpt非偶联型:产物的形成和菌体的生长非偶联xpt浓度三分批发酵过程的产物形成在分批发酵过程中，微生物生长、产物形成均与基质利用有关，因此可建立平衡方程：微生物生长：细胞积累＝生长dX/dt=μX产物形成：产物积累＝产物合成dP/dt=μX·Yp/x=qpX基质利用：基质积累＝－生长消耗－产物消耗－维持－dS/dt=－μX/Yx/s－qpX/Yp/s－mX

=－qsX

－qpX/Yp/s－mX比速率（μ、qp、qs）：单位时间内单位细胞浓度所引起的细胞生长或产物形成或底物消耗的量。（g/g细胞.h）生长得率Yx/s；产物得率Yp/s四.生产得率系数和产物得率系数1.生产得率系数：Yx/s表示每消耗1mol的基质所形成的菌体质量（g）Yx/s＝ΔX/ΔS＝X-X0/S0-SYx/o2表示每消耗1mol的O2所形成的菌体质量（g）Yx/s＝ΔX/ΔO2Yx/ATP表示每消耗1mol的ATP所形成的菌体质量（g）Yx/s＝ΔX/ΔATP

2.产物得率系数：Yp/s表示每消耗1mol的基质所生成的产物质量（g）Yp/s＝ΔP/ΔS＝P-P0/S0-S

五.分批培养的生产率（Productivity）：

生产率P=细胞或产物浓度（g/L）/发酵时间t(h）

其中：发酵时间t=1/μm·lnXf/X0+tc

+tf+tl

tc

为放罐清洗时间；

tf

为装料消毒时间；

tl为生长停滞时间。X0、Xf

分别为细胞最初与最终浓度。若令:tc

+tf+tl＝tL则：P＝（Xf

－X0）/tP分=(Xf－X0)/[1/μm*ln(Xf

/X0)+tL]

第三节连续培养及其动力学连续培养（cintinuousculture）有称连续发酵，以一定速度向发酵罐注入新鲜培养基，同时以同速排出培养液。使罐内液量维持恒定，使培养物在恒定状态下生长的培养方法。

连续培养与分批培养的区别：维持恒定状态环境条件如基质浓度S、产物浓度P、细胞浓度X、比生长速率μ、pH等始终维持不变维持恒定状态目的：稳定高效的培养微生物或产生大量代谢产物。一单罐连续发酵的前提和假设：稳定状态下物料平衡，参数变化为零：dX/dt=0,dS/dt=0,dP/dt=0；

培养基混合均匀，菌体、基质、含氧等均匀一；微生物无死亡（α比死亡速率＝0）F(L/h)X(g/I)S(g/I)F(L/h)So(g/I)V=液体体积(L)X

s单罐连续培养流入速度=流出速度=F反应器内(V)全混流溶质浓度处处相等连续反应器：二单罐连续发酵的动力学通过连续培养的物料衡算来推导其动力学方程：微生物细胞的物料平衡：

积累细胞＝（进入－流出）细胞＋（生长－死亡）细胞

dX/dt=（X0－X）F/V＋(μ－α)X

由于流入细胞浓度X0＝0，α＝0，故简化为:

dX/dt=－XF/V＋μX＝（μ－F/V）X稳定态下:dX/dt=0

则：μ＝F/V稀释率（dilutionrate）D=F/V,

故：D＝μ连续培养中，稀释率（dilutionrate）D=F/V,

故：D＝μ

D(1/h)：单位时间内新进入的培养液体积占罐内培养液总体积(V)的分数。

1/D(h)：培养液在罐内的平均停留时间，可用t表示注：

D=μ＝F/V，可通过改变F（流加速率）调节μ值：

D<μ,则dX/dt>0,微生物浓度将随时间而增加；D>μ,则dX/dt<0,微生物浓度将随培养物被洗出（washout）而减少；D＝μ,则dX/dt＝0，微生物浓度不随时间而变化，处于恒态―

连续培养稳定状态限制性底物的物料平衡：底物积累＝（进入－流出）底物－（生长＋形成产物＋维持代谢）底物

dS/dt=（S0－S）F/V－（μX/Yx/s＋qpX/Yp/s＋mX）由于mX《μX/Yx/s，产物形成的需求（qpX/YP/s）忽略时，该式简化为：

dS/dt=F（S0－S）/V－μX/Yx/s稳定态下ds/dt=0则：D（S0－S）=μX/Yx/s当稳定态D=μ时，X＝Yx/s（S0－S）

（1）据Monod方程:μ＝μm·S/(Ks+S)

当稳定态D=μ时,

D

＝Dc·S/(Ks+S)

Dc:临界稀释速率（Dc=μm）,代表能运行的最大稀释速率。一般情况下D<Dc；D≥Dc,则菌体将被洗出上式变形为：

S＝DKs/(μm-D)(2)

(1),(2)合并：X＝Yx/s{S0－[DKs/(μm-D)]}（3）(2)(3)式反映了稀释率与细胞浓度、底物浓度的调节关系。注：连续培养的稳定状态下，Yx/s、S0、Ks及μm均定值，故菌种浓度X、底物浓度取决于稀释率D。连续培养的稳定状态下，X、S0、D为主要变量，其他属于因变量。但当D发生改变，均会造成X、S、μ的变化。菌种浓度X、基质浓度S、细胞产率P及稀释率D的变化关系如图：菌种浓度X与稀释率D的关系：随D增加，X逐渐减少，起初不明显，当D渐接近Dc＝μm，X急跌至0，微生物全部洗出。基质浓度S与稀释率D的关系：S变化与X相反：一般当D<0.8时,S很小；随D再增大，S急剧上升，当D渐接近Dc＝μm时，S＝S0。细胞产率P=DX与稀释率D的关系：随D的增加P逐步增大，可达最大DX值（DmXm），Dm为理论上的最适宜稀释速率。菌种浓度X、基质浓度S、细胞产率P及稀释率D的关系

Dc为临界稀释速率；Dm为理论上的最适宜稀释速率。三连续发酵与分批发酵生产率的比较1．分批培养的生产率P分=(Xf－X0)/[1/μm*ln(X