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氨基末端单聚乙二醇化重组人内皮抑素的制备及其稳定性聂永军，张馨，新昌王，君辉陈*

国家重点实验室，医药生物技术，生物化学系，南京大学，南京210093

中国体育河。收到05年12月14日;收到修改稿2006年5月27日内皮抑素能特异地抑制内皮细胞增殖，有效地抑制血管生成和肿瘤的生长。

重组人内皮抑素氨基末端特定位点的单聚乙二醇被使用平均达5000分子量甲氧基聚乙二醇（MPEG）的丙醛通过终端醛基反应来实现。该特定的共轭乙二醇是在最好的条件下生成的，这是通过统计学的L9（34）正交试验检测来确定的。在这项研究中，我们已经调查聚乙二醇-rhES的稳定性和抗肿瘤活性。聚丙烯酰胺凝胶电泳，反相高效液相色谱法，紫外分光光度分析被用来确定乙二醇-rhES的纯度和稳定性。当孵育蛋白酶或放置在一

极端环境下的MPEG-rhES比rhES稳定。未修改和聚乙二醇的链接RHE进行了测试他们抑制雄性小鼠H22肝癌肿瘤生长的能力。在多与单剂量的比较研究，日常服用为0.25，0.50和1.00微mol/公斤的rhES

七天导致了26.9％，43.0％和64.9%肿瘤重量减少，而单剂量0.13，0.25，

和0.50微mol/公斤聚乙二醇化的蛋白质每天导致24.8％，38.0％和64.5％减少，分别为。这两种治疗导致肿瘤减少的平均重量相比用生理盐水处理(对照)显着减少的多，而用乙二醇rhES换成一半剂量的rhES，而肿瘤抑制率分别为相似。因此，有人建议，聚乙二醇化提高了稳定性和连接RHE提高其抗肿瘤活性。蛋白质和多肽类药物作为治疗剂代理有很大的潜力。然而，其中许多是由蛋白水解降解在体内的酶，它们迅速就被肾脏排出。另外，B细胞能产生中和抗体来抵抗这些蛋白质和多肽。因此，这些药物通常有短期循环半衰期（1）。聚（乙二醇）（聚乙二醇）是一个广泛的研究聚合物用于许多药学和生物药学中生物大分子的共价修饰，尤其是肽和蛋白质（2）。通过增加蛋白质和多肽分子质量来避免蛋白水解酶，从而改善药物动力学（1）。广泛的治疗类蛋白质，包括人体生长激素，干扰素，胰岛素，粒细胞集落刺激因子（G-CSF），和白细胞介素二，聚乙二醇化（3）。头几的PEG-蛋白质现在市场上（Adagen，Oncospar和PEGIntron）产品，制定了利用聚乙二醇化学的第一代。第二代的聚乙二醇化的目的是要避免第一代化学的问题，特别是去活化的聚乙二醇杂质，低分子量的限制，乙二醇，不稳定的联系，并缺乏修改选择性。近日，特定蛋白质的聚乙二醇化已尝试在特定的共轭条件下用一类特殊职能化的聚乙二醇衍生物。例如，氨基-末端粒细胞集落刺激因子特殊的聚乙二醇由共轭在酸性pH值条件下甲氧基聚乙二醇衍生物中获得的。这策略是基于这样的事实，初级胺残留在蛋白质中使其有不同的pKa值：pKa=7.8是氨基末端的@氨基，pKa=10.1的是赖氨酸残基的@氨基（5）。当丙醛或N-羟基聚乙二醇偶联在较低pH值条件下，在聚乙二醇N-末端的位点优先发生是由于两种@伯胺之间不同的pKa值。

内皮抑素，一个20kDa（千道尔顿-原子质量单位）的羧基端片段的胶原蛋白十八，被孤立于血管内皮瘤的条件培养基（EOMA）细胞。它专门抑制血管内皮的增殖和有效地抑制血管生成和肿瘤增长（7）。内皮抑素来源于弹性蛋白酶介导的切割（8）。血管生成是固体肿瘤持续快速增长的关键，以这看来，肿瘤直接影响'血管生成开关'，以维持细胞的连续增殖（9）。有趣的是，内皮抑素似乎不诱导抗药性。此外，反复循环的系统性内皮抑素在荷瘤小鼠体内反应的进一步实验中所引起的持续肿瘤休眠。因此，内皮抑素将成为新的重要抗肿瘤剂。3在这项研究中，聚​​乙二醇化rhES的N-端在特定方式下与聚乙二醇丙醛衍生物（4,6）。各种表征方法，如快速蛋白质液相色谱（FPLC）和反相高性能液相色谱法（RP-HPLC法）技术被用来表明，单一聚乙二醇反应发生网站专门

在N-端的R-胺组的特定位点。在体外稳定性实验，如孵化胰蛋白酶或糜蛋白酶与被保持在一个极端的pH值或温度的活的有机体肝癌H22小鼠中抗肿瘤活性的实验研究，表明单聚乙二醇化内皮抑素进行抗癌治疗的潜在能力。实验步骤材料。重组人血管内皮抑制素（rhES）的捐赠

由仲恺生物制药（苏州，江苏，中国）。该5kDa的乙二醇，丙购自SunBio（安阳市，汉城，韩国）;胰蛋白酶，糜蛋白酶，钠

氰基，和透析膜（兆瓦截止1000）由Sigma提供（圣路易斯，密苏里州）;CM-琼脂糖凝胶法来自于Amersham公司PharmaciaBiotech公司（白金汉郡，英国），5um的BDS的孔径C18反相柱（150×4.6mm）提供于Hypersil（尚法，朗科恩，柴郡，英国）;及小鼠H22肝癌细胞的形态和昆明小鼠SIPI（上海，中国）。

聚乙二醇与聚乙二醇的连接RHE-丙醛衍生物。

该反应的最佳条件，是实现通过统计采用正交试验。这四个因素

pH值，乙二醇丙醛摩尔比，温度，和时间。表1报告每个因素的三个层次。被终止的反应，用1mol/L的盐酸调节PH至3.5，利用SDS和中间软件系统进行样品分析。通过快速液相色谱仪进行分离纯化。反应混合物被装上一个CM阳离子交换层析法郎

柱（1.0cm×20cm），预平衡20毫米醋酸钠，pH值4.5（缓冲液A）在1.0毫升/min的流速，使用快速液相色谱仪系统。300毫升的缓冲液A洗前一梯梯度20％，40％和60％缓冲液B（缓冲液A+1M氯化钠）的

应用梯度大约5柱体积。该组分被分析通过非还原SDS–PAGE及中间软件系统。该样本含有单聚乙二醇化及未经修改的rhES被顺序收集。通过透析和冷冻干燥后样品于20℃下存放。紫外分光光度法。聚乙二醇化蛋白质含量可以通过在波长280nm的紫外线下比较rhES和MPEG-rhES的吸光度测定出。其纯度和聚乙二醇醇化后的残余物可以通过蛋白质含量来确定。反相高效液相色谱法（RP-HPLC法）。聚乙二醇化rhES或rhES可被分析通过一台HypersilBDS的C18的平衡柱

用缓冲液c（含0.1％TFA的水）在其流速为

1.0毫升/分钟并在波长为280nm处进行监测，并用

浓度为60％缓冲液类（含0.1％TFA的乙腈）进行线性洗脱

20分钟以上。

体外蛋白质水解。mPEG-rRHE（1.25mg/ml，pH值7.4磷酸盐缓冲液（PBS））的400ul被制备通过4微升的胰蛋白酶(1.0mg/ml）或20微升的糜蛋白酶（2.0mg/ml）在37℃下。每个样品的20微升装在一个在不同的C18柱中间进行阶段培养并通过反相高效液相色谱法鉴定。MPEG-rhES的峰面积的保留时间区域用以指示剩余的MPEG-rhES。同时，rhES用来和MPEG-rhES作比较;mPEG-rhES在极端的pH值或温度下的稳定性。

要获得rhES和mPEG-rhES对温度的影响，mPEG-rhES（1.25mg/ml，pH值7.4的PBS，400ul）或rhES（1.0mg/ml，pH值7.4的PBS，400ul）分别在4，25，37，45，50，55，60，65℃下进行制备。制备好过24小时后，所有样品在15000转/秒下离心10min。同样，要获得酸或碱的影响，MPEG-rhES（1.25mg/ml，pH值7.4的PBS，400ul）或rhES（1.0mg/ml，pH值7.4的PBS，400ul）用醋酸溶液和氢氧化钠溶液将其pH分别值调整为2，3，4，5，6和8，9，10，11。样品经培养24小时，在37℃下离心收集。剩余的蛋白质含量用紫外分光光度法进行测定。图1。SDS-PAGE电泳分析样品的正交染色

考马斯蓝。1至9行：九正交试验样品

相应的检验号。第10行：未经修改的原始

rhES的解决方案。mPEG-rhES在被移植H22肝癌小鼠体内的抗肿瘤活性

患H22肝癌小鼠体内良好的成长性腹水，从SIPI获得（上海药物工业研究所

，上海，中国），分别稀释于4倍体积生理盐水中。取0.2毫升稀释后

的腹水用套管针对每个雄性昆明小鼠（4周大;体重19-21g×100。对所有的动物进行实验，按照所求肿瘤抑制率指导实验。结果rhES中的聚乙二醇。统计采用正交试验,

经SDS-PAGE分析表明单聚乙二醇较好,

在1至4行（图1）。单聚乙二醇rhES的比例

分别为66.80％和63.08%在第1行和第4行。该

PEG浓度较高，导致了聚乙二醇化rhES的比例较高（行3，6，9，图1）。经过正向

对四个因素的分析，我们发现在反应最重要的角色是MPEG与rhES的摩尔比，温度，时间次之，最后是pH值（表2）在聚乙二醇酰化反应产生单聚乙二醇化rhES，多聚乙二醇化rhES

与未反应的阳离子层析交换生成rhES分子

（图2）。经过透析，冷冻干燥，用SDS–PAGE测定

单聚乙二醇化rhES的含量（图3），紫外分光光度法和反相高效液相色谱法（图4）。经SDS-PAGE和反向高效液相色谱层析结果

指出了MPEG-rhES是纯粹的。实验测出聚乙二醇化rhES蛋白质含量为80.21％，其残余的PEG

计数是1。这一结果不仅表明mPEG—rhES

是纯粹的，但也正是表明，该产品是

单一的聚乙二醇。mPEG-rhES的稳定性。余下的质量分数的rhES经胰蛋白酶或糜蛋白酶培养，经C18柱高效液相色谱法分析，结果表明，聚乙二醇化rhES更单聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素表2。结果正交Testsa1.因素，在反应中发挥最重要作用经统计发现，正交试验。2.单聚乙二醇化rhES（RMPES％）的比例是从凝胶工作由一维的中间Gelwoks软件系统测定。3.K值是该RMPES％有一定的因素的总和具有相同的水平。4.K1/3意味着K1的值除以3。5.在一定的因素，最小Kx/3（x=1，2或3）减去最大一个给了R值。R值越大，更重要的因素的

反应中的作用。在递减的顺序，最重要的因素是对MPEG的摩尔比(rhES)，受温度，时间，pH值。图2。阳离子交换的快速蛋白质液相色谱专一的聚乙二醇化连接RHE。抗胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶与rhES。后40分钟的孵化与胰蛋白酶，只有4％的rhES存活，而相比之下单聚乙二醇化90％的rhES存活图5）。当乙二醇-rhES和rhES分别与糜蛋白酶反应，结果表明，半数的mPEG-rhES寿命约60岁而rhES的分钟约24分钟（图6）。因此，聚乙二醇化显着增加了antiproteolytic稳定性

重组胚胎稳定在4°C至40°C就像乙二醇-rhES。然而，当温度升高到50°C时，只有20％的rhES乙二醇-rhES剩余,而其余几乎100％变性。当连接RHE变性比例为50％的温度为47.6°C间，而，mPEG-rhES相应的温度约为62.6°C间（图7）因此，聚乙二醇化能显著增加血管内皮抑制素的热稳定性。

重组胚胎是在pH值2，稳定pH值至7以及乙二醇-rhES。当pH值超过9的MPEG-rhES是较稳定rhES。即使是pH值上升至10，乙二醇-rhES仍然稳定，而变性比例较低。图3。SDS-PAGE分析纯化的两个部位对一非还原17％凝胶和考马斯亮蓝染色。

甲，分子量标记乙，未经修改的连接RHE（图2）丙，单聚乙二醇化rhES（峰值在图21）。图4。纯化后的单聚乙二醇化rhES高效液相色谱专页。图5。在聚乙二醇rhES（9）和rhES（]），以相对电阻胰蛋白酶的蛋白质。每个数据值表示方式（标准差（n=3）。rhES达到84.4％（图8）。因此，在N-末端

还增强了具体的聚乙二醇酸基稳定性显著的rhES。体内聚乙二醇化rhESímol/公斤未修改rhES

7天分别导致26.9％，43.0％和64.9％削减肿瘤重量。图6。在聚乙二醇rhES（9）和rhES（]），以相对电阻糜蛋白酶蛋白质。每个数据值表示方法(n=3)图7。对相对敏感的聚乙二醇的影响。聚乙二醇rhES（9）和rhES（]）的温度。每个数据值代表

指（标准差（n=3）。图8。对相对敏感的聚乙二醇的影响

聚乙二醇rhES（9）和rhES（]），以pH值。每个数据值表示方法

（标准差（n=3）。

这两种治疗分别显著导致24.8％，38.0％和64.5％肿瘤的平均重量下降（见表3）。生理盐水（对照）处理的P-值“0.001小鼠。mPEG-rhES的剂量是rhES的一半，repectively，而肿瘤抑制率（红外热光谱％）相当接近。讨论聚乙二醇衍生物的共轭伯胺组内皮抑素的发生主要是通过亲核取代反应：对unprotonated胺的羰基群攻组醛。表3。抗肿瘤活性的rhES和MPEG–rfES作用相反

小鼠H22肝癌移植的1.10天后，杀死小鼠，提取小鼠体内的肿瘤用于测量。测量值的标准差代表两种药物对10个肿瘤的不同效果。2.肿瘤抑制率（红外热光谱％）=（1-平均治疗组肿瘤重量/模型组平均肿瘤的重量）×1

003.值得注意的是不同于PSS控制组在P<0.001（a和e）也同样有反应聚乙二醇化基础条件，所以多聚乙二醇化非均相混合物

物种可能会产生。与此相反，在酸性条件下，选择性unprotonation的N-端的R-氨基能发生时，做出比胺组有更多的反应在赖氨酸由于残留的pKa值的差异：7-8

的R-胺，并为10-11胺（5）。这还原胺化反应与N-端的R-胺组中，在场氰基钠作为还原剂，可能导致在特定地点的单聚乙二醇化CSF和表皮生长因子（4，6）。单聚乙二醇化蛋白质复合物，如血管内皮抑制素，亦同样获得通过的N-端选择性共轭的R-胺残留的统计正交试验。阳离子交换后，简单的纯化步骤层析，透析，纯单聚乙二醇rhES在共轭可以得到证明的情况下作为rhES经SDS-PAGE和反相高效液相色谱法分析。rhES在单聚乙二醇化连接rhES蛋白测定采用紫外280纳米。通过计算，蛋白质含量的MPEG-rhES为80.21％，而聚乙二醇残留数（N）为1。这一结果不仅表明目前MPEG-rhES是纯粹的，但也充分显示，在良好的分子量与血管内皮抑制素的协议包含一个单一的共轭5000大聚乙二醇衍生物。在美国，治疗期临床试验rhES均采用1