仪器分析第17章高效液相色谱法课件

第17章高效液相色谱法第17章高效液相色谱法1一、液相色谱概述二、HPLC仪器构成三、液相色谱的固定相和流动相四、液相色谱法的分离类型及机理五、色谱分离方法的选择主要内容一、液相色谱概述主要内容2一、概述一、概述3高效液相色谱（HPLC）是一种以液体为流动相的快速分离分析色谱技术。具有高压、高速、高效、高灵敏度的特点，对于那些沸点高，热稳定性差，相对分子质量大的有机化合物如烷烃、烯烃、芳烃、染料、蛋白质、氨基酸、核酸等均可进行分离分析。

1、高效液相色谱高效液相色谱（HPLC）是一种以液体为流1、高效液41）高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达10cm3·min-1.2）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。高效液相色谱的优点1）高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效53）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。

4）气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。高效液相色谱的优点3）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产62、液相色谱仪器

（highperformanceliquidchromatograph）液相色谱仪（1）2、液相色谱仪器

（highperformanceli7液相色谱仪（2）液相色谱仪（2）8液相色谱仪（3）液相色谱仪（3）9液相色谱仪（4）LCQDecaXPMAX液相色谱质谱联用仪液相色谱仪（4）LCQDecaXPMAX液相色谱质谱联10液相色谱仪（5）液相色谱仪（5）11二、HPLC仪器构成1、流程二、HPLC仪器构成1、流程122、

HPLC仪器组成：高压输液装置→进样系统→分离系统→

检测系统

2、HPLC仪器组成：13高压输液系统

(1)

贮液器

用来供给足够数量的合乎要求的流动相以完成分析工作。材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK）容积：0.5～2.0L放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差注意：密封、过滤高压输液系统(1)贮液器14流动相过滤与脱气装置流动相过滤装置分为在线过滤和真空过滤流动相脱气装置分为在线真空脱气和超声波脱气流动相过滤与脱气装置15泵体材料耐腐蚀泵腔的体积要小，以便快速更换溶剂能在高压下连续工作,耐压40-50MPa.cm2压力平稳，无脉冲高压输液泵输出流量稳定，重复性高,输出流量范围宽(2)高压输液泵

泵体材料耐腐蚀泵腔的体积要小，以便快速更换溶剂能在高压下连续16高压输液系统高压输液系统17(3)梯度淋洗装置

(内梯度)(外梯度)梯度淋洗装置(3)梯度淋洗装置(内梯度)(外梯度)梯度淋洗装置18等度洗脱与梯度洗脱等度洗脱与梯度洗脱19梯度洗脱的特点改善分离,加快分析速度；改善峰形,减少拖尾;可能引起基线漂移分配比变化范围宽的复杂样品应采取梯度洗脱方式分离梯度洗脱的特点改善分离,加快分析速度；分配比变化范围宽的201)对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2)适用于所选择的检测器。3)化学惰性好，以免破坏固定相。4)低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5)纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。流动相溶剂选择的一般要求1)对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。流动相溶剂选21(2)

进样系统进样针六通阀(2)进样系统进样针六通阀22

准备状态进样状态六通阀进样装置准备状态进样状态六通阀进23六通阀进样装置的使用及保养1、进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用0．45微米的滤膜过滤。2、进样时，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，以免漏液和引入空气；另外，也防止了针头刺坏密封组件及定子。3、进样时，要求完全置换样品定量环内残留的溶液，以此提高精密度及重现性。4、进样时，手柄处于Load和Inject之间时，应尽快转阀，不能停留在中途。5、每次结束后应反复冲洗进样器再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。六通阀进样装置的使用及保养1、进样样品要求无微粒和能阻死24(3)分离系统

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。色谱柱(3)分离系统柱体为直型不锈钢管，内径1251．使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)。2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围。3．避免流动相组成及极性的剧烈变化。4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理。5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中。6．压力升高是需要更换预柱的信号。色谱柱的使用和维护1．使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有色26(4)液相色谱检测器a.紫外检测器b.光电二极管阵列检测器c.示差折光检测器d.

荧光检测器e.电导检测器f.质谱检测器(4)液相色谱检测器a.紫外检测器27a.紫外检测器

应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：

灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。a.紫外检测器28b.光电二极管阵列检测器

紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。b.光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；29仪器分析第17章高效液相色谱法课件30两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器两种检测器的色谱图31紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较普通检测器光电二极管阵列检测器紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较普通检测器光电二极32紫外检测器灵敏度高，精密度及线性范围较好，可用于梯度洗脱。流动相选择有限制。一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂CS2氯仿四氢呋喃苯乙腈甲醇水紫外截止波长/nm380245212210190205187紫外检测器灵敏度高，精密度及线性范围较好，可用于梯度洗脱。33c.示差折光检测器

除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种。c.示差折光检测器

除紫外检测器之外应用最34示差折光检测器示差折光检测器35d.荧光检测器

荧光检测器是高压液相色谱仪常用的一种检测器。用紫外线照射色谱馏分，当试样组分具有荧光性能时，即可检出。其特点是选择性高，只对荧光物质有响应；灵敏度也高，最低检出限可达10-12g/ml，适合于多环芳烃及各种荧光物质的痕量分析。也可用于检测不发荧光但经化学反应后可发荧光的物质。如在酚类分析中，多数酚类不发荧光，为此先经处理使其变为荧光物质，而后进行分析。d.荧光检测器

荧光检测器是高压液相色谱仪361、固定相

高效液相色谱固定相根据其承受压力来分，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体：二氧化硅为基质，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高压，如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶：主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。三、高效液相色谱的固定相和流动相

1、固定相三、高效液相色谱的固定相和流动相37

固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。

表面多孔型：基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固38

全多孔型固定相：它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，这类固定相由于颗粒很细（5～10μm），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。全多孔型固定相：它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成39

40按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。

采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2、液相色谱的流动相液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；按流动相组成分：单组分和多组分；2、液相色谱的流动相液相色谱41流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

常用溶剂的极性顺序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要42选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相43四、液相色谱分离类型与原理1、液-固吸附色谱

固定相：固体吸附剂为硅胶、氧化铝、活性炭等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；

适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。四、液相色谱分离类型与原理1、液-固吸附色谱

44固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相）。固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；（薄壳型微珠担体）30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反柱）。2、液-液分配色谱固定相与流动相均为液体（互不相溶）；2、液-液分配色谱45分离原理K不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关分离原理K不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关46固定相极性>流动相极性正相分配色谱组分极性越大，保留时间越长反相分配色谱组分极性越小，保留时间越长流动相极性>固定相极性固定相极性>流动相极性正相分配色谱组分极性越大，保留时间越长47仪器分析第17章高效液相色谱法课件483、化学键合相色谱采用化学键合相的液相色谱固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。特点3、化学键合相色谱采用化学键合相的液相色谱固定相非常稳定，在491.键合固定相制备ODS(C18)键合相硅胶十八烷基氯硅烷非极性硅烷化反应使用pH范围：2-81.键合固定相制备ODS(C18)键合相硅胶十八烷基氯硅烷50键合固定相类型疏水基团烷烃（C8和C18）、苯基等极性基团丙氨基氰乙基醚和醇等离子交换基团胺基、季铵盐磺酸、羧酸键合固定相类型疏水基团极性基团离子交换基团512.键合相色谱法分类反相键合相色谱:常用固定相：C18分离对象非极性中等极性化合物常用流动相甲醇-水乙睛-水反相键合相色谱疏溶剂分离机制固定相极性<流动相极性2.键合相色谱法分类反相键合相色谱:常用固定相：C18分52正相键合相色谱

固定相极性>流动相极性离子性键合相色谱将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。

正相键合相色谱离子性键合相色谱53例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：甲苯，苯酚十八烷基键合相二醇基键合相例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水出峰顺序：苯酚，甲苯出54保留时间：<例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。没食子酸3,4-二羟基苯甲酸固定相:非极性;流动相:极性组分极性:3,4-二羟基苯甲酸<没食子酸保留时间：<例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下55

56此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。4、离子交换色谱此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定57离子交换原理

离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换。离子交换原理58阳离子交换树脂阳离子交换阴离子交换其交换反应通式如下：阳离子交换树脂阳离子交换阴离子交换其交换反应通式如下：59

达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：

式中[A]r，[B]r分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（B）的浓度，[A]、[B]则代表它们在溶液中的浓度。离子交换反应的选择性系数见从表示试样离子B对于A型树脂亲和力的大小：KB/A越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，B离子电荷越大，水合离子半径越小，KB/A值就越大。一般形式：R一A＋B＝R－B＋A

达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）60

对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以下顺序：

Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二价离子的顺序为：

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+对于季铵型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以61

固定相

作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分。固定相62流动相

离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子的滞留次序为：

柠檬酸离子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。流动相离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐63阳离子的滞留次序大为：

Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十但差别不如阴离子明显。关于pH值的影响，要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低PH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。

仪器分析第17章高效液相色谱法课件64

5、尺寸排阻色谱

尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。

5、尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于65

分离原理

尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质——凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其渗透过程模型见下图。分离原理66排阻色谱分离示意图相对分子质量差别大于10％的化合物才可以分离排阻色谱分离示意图相对分子质量差别67固定相排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。（1）软性凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。

固定相68

（2）半刚性凝胶如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。（3）刚性凝胶如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离。仪器分析第17章高效液相色谱法课件69流动相

排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶。另外，溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质分离，尤需注意。选择溶剂还必须与检定器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。

以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。流动相

排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须70类型主要分离机理主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析离子排斥色谱Donnan膜平衡有机酸、氨基酸、醇、醛分析离子对色谱疏水分配作用离子性物质分析疏水作用色谱疏水分配作用蛋白质分离与纯化手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析高效液相色谱法的类型及分离机理类型主要分离机71五、色谱分离方法的选择五、色谱分离方法的选择72

习题与思考题P301：1，2，3，5，6，9.

73第17章高效液相色谱法第17章高效液相色谱法74一、液相色谱概述二、HPLC仪器构成三、液相色谱的固定相和流动相四、液相色谱法的分离类型及机理五、色谱分离方法的选择主要内容一、液相色谱概述主要内容75一、概述一、概述76高效液相色谱（HPLC）是一种以液体为流动相的快速分离分析色谱技术。具有高压、高速、高效、高灵敏度的特点，对于那些沸点高，热稳定性差，相对分子质量大的有机化合物如烷烃、烯烃、芳烃、染料、蛋白质、氨基酸、核酸等均可进行分离分析。

1、高效液相色谱高效液相色谱（HPLC）是一种以液体为流1、高效液771）高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达10cm3·min-1.2）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。高效液相色谱的优点1）高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效783）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。

4）气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。高效液相色谱的优点3）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产792、液相色谱仪器

（highperformanceliquidchromatograph）液相色谱仪（1）2、液相色谱仪器

（highperformanceli80液相色谱仪（2）液相色谱仪（2）81液相色谱仪（3）液相色谱仪（3）82液相色谱仪（4）LCQDecaXPMAX液相色谱质谱联用仪液相色谱仪（4）LCQDecaXPMAX液相色谱质谱联83液相色谱仪（5）液相色谱仪（5）84二、HPLC仪器构成1、流程二、HPLC仪器构成1、流程852、

HPLC仪器组成：高压输液装置→进样系统→分离系统→

检测系统

2、HPLC仪器组成：86高压输液系统

(1)

贮液器

用来供给足够数量的合乎要求的流动相以完成分析工作。材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK）容积：0.5～2.0L放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差注意：密封、过滤高压输液系统(1)贮液器87流动相过滤与脱气装置流动相过滤装置分为在线过滤和真空过滤流动相脱气装置分为在线真空脱气和超声波脱气流动相过滤与脱气装置88泵体材料耐腐蚀泵腔的体积要小，以便快速更换溶剂能在高压下连续工作,耐压40-50MPa.cm2压力平稳，无脉冲高压输液泵输出流量稳定，重复性高,输出流量范围宽(2)高压输液泵

泵体材料耐腐蚀泵腔的体积要小，以便快速更换溶剂能在高压下连续89高压输液系统高压输液系统90(3)梯度淋洗装置

(内梯度)(外梯度)梯度淋洗装置(3)梯度淋洗装置(内梯度)(外梯度)梯度淋洗装置91等度洗脱与梯度洗脱等度洗脱与梯度洗脱92梯度洗脱的特点改善分离,加快分析速度；改善峰形,减少拖尾;可能引起基线漂移分配比变化范围宽的复杂样品应采取梯度洗脱方式分离梯度洗脱的特点改善分离,加快分析速度；分配比变化范围宽的931)对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2)适用于所选择的检测器。3)化学惰性好，以免破坏固定相。4)低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5)纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。流动相溶剂选择的一般要求1)对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。流动相溶剂选94(2)

进样系统进样针六通阀(2)进样系统进样针六通阀95

准备状态进样状态六通阀进样装置准备状态进样状态六通阀进96六通阀进样装置的使用及保养1、进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用0．45微米的滤膜过滤。2、进样时，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，以免漏液和引入空气；另外，也防止了针头刺坏密封组件及定子。3、进样时，要求完全置换样品定量环内残留的溶液，以此提高精密度及重现性。4、进样时，手柄处于Load和Inject之间时，应尽快转阀，不能停留在中途。5、每次结束后应反复冲洗进样器再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。六通阀进样装置的使用及保养1、进样样品要求无微粒和能阻死97(3)分离系统

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。色谱柱(3)分离系统柱体为直型不锈钢管，内径1981．使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)。2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围。3．避免流动相组成及极性的剧烈变化。4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理。5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中。6．压力升高是需要更换预柱的信号。色谱柱的使用和维护1．使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有色99(4)液相色谱检测器a.紫外检测器b.光电二极管阵列检测器c.示差折光检测器d.

荧光检测器e.电导检测器f.质谱检测器(4)液相色谱检测器a.紫外检测器100a.紫外检测器

应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：

灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。a.紫外检测器101b.光电二极管阵列检测器

紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。b.光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；102仪器分析第17章高效液相色谱法课件103两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器两种检测器的色谱图104紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较普通检测器光电二极管阵列检测器紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较普通检测器光电二极105紫外检测器灵敏度高，精密度及线性范围较好，可用于梯度洗脱。流动相选择有限制。一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂CS2氯仿四氢呋喃苯乙腈甲醇水紫外截止波长/nm380245212210190205187紫外检测器灵敏度高，精密度及线性范围较好，可用于梯度洗脱。106c.示差折光检测器

除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种。c.示差折光检测器

除紫外检测器之外应用最107示差折光检测器示差折光检测器108d.荧光检测器

荧光检测器是高压液相色谱仪常用的一种检测器。用紫外线照射色谱馏分，当试样组分具有荧光性能时，即可检出。其特点是选择性高，只对荧光物质有响应；灵敏度也高，最低检出限可达10-12g/ml，适合于多环芳烃及各种荧光物质的痕量分析。也可用于检测不发荧光但经化学反应后可发荧光的物质。如在酚类分析中，多数酚类不发荧光，为此先经处理使其变为荧光物质，而后进行分析。d.荧光检测器

荧光检测器是高压液相色谱仪1091、固定相

高效液相色谱固定相根据其承受压力来分，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体：二氧化硅为基质，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高压，如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶：主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。三、高效液相色谱的固定相和流动相

1、固定相三、高效液相色谱的固定相和流动相110

固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。

表面多孔型：基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固111

全多孔型固定相：它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，这类固定相由于颗粒很细（5～10μm），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。全多孔型固定相：它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成112

113按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。

采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2、液相色谱的流动相液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；按流动相组成分：单组分和多组分；2、液相色谱的流动相液相色谱114流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

常用溶剂的极性顺序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要115选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相116四、液相色谱分离类型与原理1、液-固吸附色谱

固定相：固体吸附剂为硅胶、氧化铝、活性炭等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；

适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。四、液相色谱分离类型与原理1、液-固吸附色谱

117固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相）。固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；（薄壳型微珠担体）30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反柱）。2、液-液分配色谱固定相与流动相均为液体（互不相溶）；2、液-液分配色谱118分离原理K不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关分离原理K不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关119固定相极性>流动相极性正相分配色谱组分极性越大，保留时间越长反相分配色谱组分极性越小，保留时间越长流动相极性>固定相极性固定相极性>流动相极性正相分配色谱组分极性越大，保留时间越长120仪器分析第17章高效液相色谱法课件1213、化学键合相色谱采用化学键合相的液相色谱固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。特点3、化学键合相色谱采用化学键合相的液相色谱固定相非常稳定，在1221.键合固定相制备ODS(C18)键合相硅胶十八烷基氯硅烷非极性硅烷化反应使用pH范围：2-81.键合固定相制备ODS(C18)键合相硅胶十八烷基氯硅烷123键合固定相类型疏水基团烷烃（C8和C18）、苯基等极性基团丙氨基氰乙基醚和醇等离子交换基团胺基、季铵盐磺酸、羧酸键合固定相类型疏水基团极性基团离子交换基团1242.键合相色谱法分类反相键合相色谱:常用固定相：C18分离对象非极性中等极性化合物常用流动相甲醇-水乙睛-水反相键合相色谱疏溶剂分离机制固定相极性<流动相极性2.键合相色谱法分类反相键合相色谱:常用固定相：C18分125正相键合相色谱

固定相极性>流动相极性离子性键合相色谱将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。

正相键合相色谱离子性键合相色谱126例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：甲苯，苯酚十八烷基键合相二醇基键合相例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水出峰顺序：苯酚，甲苯出127保留时间：<例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。没食子酸3,4-二羟基苯甲酸固定相:非极性;流动相:极性组分极性:3,4-二羟基苯甲酸<没食子酸保留时间：<例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下128

129此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。4、离子交换色谱此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定130离子交换原理

离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换。离子交换原理131阳离子交换树脂阳离子交换阴离子交换其交换反应通式如下：阳离子交换树脂阳离子交换阴离子交换其交换反应通式如下：132

达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：

式中[A]r，[B]r分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（B）的浓度，[A]、[B]则代表它们在溶液中的浓度。离子交换反应的选择性系数见从表示试样离子B对于A型树脂亲和力的大小：KB/A越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，B离子电荷越大，水合离子半径越小，KB/A值就越大。一般形式：R一A＋B＝R－B＋A

达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）133

对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以下顺序：

Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二价离子的顺序为：

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+对于季铵型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以134

固定相

作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分。固定相135流动相

离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子的滞留次序为：

柠檬酸离子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。流动相离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐136阳离子的滞留次序大为：