医药基因工程

第十七章医药基因工程自１９７２年ＤＮＡ重组技术诞生以来，基因工程技术得到飞速发展，并在医疗领域中展露出独特的优越性。基因工程药物就是利用基因工程技术生产的药物。基因工程药物是将药物蛋白或多肽的编码基因通过特定的受体细胞中，通过受体生物或者细胞表达出药物蛋白或多肽，最后将其纯化并制成药剂的过程。基因工程药物生产的过程与其他基因工程产品的基本原理是相通的，基本过程都包括了载体构建，工程菌或细胞培养，目的产物的分离纯化与鉴定等。从１９８２年最早的基因工程药物－－胰岛素上市到２００４年底，已经有１００多种基因工程药物通过审查并上市，另外还有３００多种基因工程药物进入二期及三期临床实验，涉及治疗１５０多种疾病。我国于１９９３年批准了第一个基因工程药物重组人干扰素a－１b的生产，标志着我国基因工程药物生产实现了零的突破。我国药品市场上基因工程药品主要有基因工程乙肝疫苗，重组干扰素，重组人红细胞生成素等２２种自主开发的基因工程药物。第一节基因工程药物的开发状况一.基因工程药物的分类１.按照结构组成不同分类：蛋白多肽类药物，基因工程疫苗和核酸类药物三类。２.按照作用方式分类：基因水平作用药物，转录水平作用药物和蛋白质水平作用药物。３.按照药物作用机理分类：其一：蛋白或多肽药物，通过蛋白自身的生理生化特性而抵抗疾病其二：基因工程疫苗，基因工程抗体和ＤＮＡ疫苗，基于抗原抗体反应的原理而抵抗疾病其三：反义核酸，核酶和ＲＮＡi，基于中断基因表达而抵抗疾病。二.基因工程药物的发展１.反应器的变迁根据反应器的不同可将蛋白多肽类基因工程药物的发展分为三个阶段：

a.早期大多数蛋白多肽类基因工程药物通过细菌和酵母等微生物来表达。

b.后来发展了真核生物细胞表达系统，利用离体培养的昆虫细胞和脊椎动物（如哺乳动物和鸟类）细胞表达蛋白多肽类药物。

c.近年来发展的动植物生物反应器为基因工程药物的开发带来美好的前途。２.从基因工程到蛋白质工程随着技术的进步，人们通过蛋白质工程可获得修改了氨基酸序列的蛋白质或多肽。通过定点突变、功能域的交换、分子进化等手段，已经开发了一些活性提高、适应性改善和专一性增强的蛋白药物。３.从蛋白药物到核酸药物

传统药物是通过增加某些人体内源性的有益蛋白多肽或者破坏致病蛋白本身来治疗疾病；而核酸类基因工程药物则是提供产生蛋白的基因，通过破坏或者扩大基因的功能来克服疾病。基因工程药物的开发关键在于探知什么蛋白或多肽、或核酸可以成为药物，已经通过什么样的方式制备药物或通过什么样的方式使用药物。三.基因工程药物的产业化状况第一个基因工程药物－－基因工程人胰岛素的问世期间经历了不到十年。至１９７６年第一个以基因工程制药为对象的美国Ｇenentech公司成立以来，有药物进入临床实验的生物技术公司已有约５００个。在２００２年，超过８０种基因工程药物获准在美国和欧盟使用，７５０中正在进行临床实验，市场份额超过１５０亿美元。我国共有２２种基因工程药物和疫苗，其中４种为具有自主知识产权的”一类“新药，进入临床研究的大约有１５０种，销售收入超过３亿人民币。表第二节基基因工工程蛋白白和多肽肽药物一.基因因工程胰胰岛素１.胰岛素与与糖尿病病胰岛素（insulin）是一种种激素，，能够调节糖代代谢，促进葡葡萄糖转转变为糖糖原并储储存于肌肌肉和肝肝内。当人体胰胰腺的ＢＢ－细胞胞不能产产生足量量的胰岛岛素时，，就会导导致人体体内的葡萄糖浓浓度增高高，并伴随随因胰岛岛素分泌泌或作用用缺陷引引起的糖、脂肪肪和蛋白白质代谢谢紊乱，即糖尿病。而对于于胰岛功功能完全全消失的的Ⅰ型糖尿病病患者，，不注射射胰岛素素就无法法维持生生命。２.胰岛岛素的结结构胰岛素是是一种由由两条多多肽链（（Ａ链和和Ｂ链））组成的的蛋白质质。Ａ链链含有２２１个氨氨基酸，，Ｂ链含含有３００个氨基基酸，链链间通过过二硫键结合。胰岛素在在人体内内合成的的过程中中首先合合成前胰岛素素原（preproinsulin），包括括信号肽序序列、ＡＡ链、ＢＢ链和连连接序列列４个部分分。胰岛素是是经过去掉信号号肽序列列后形成胰岛素原原，去掉连接接序列后剩下的的Ａ链和和Ｂ链通通过二硫硫键结合合，形成成了胰岛岛素。（（图１８８—１）３.基因工程程胰岛素素的生产产方式主要有两两种生产产方式：a.利用大肠肠杆菌为为受体，分别表表达胰岛岛素Ａ链链和Ｂ链链，再分分别提取取和纯化化产生的的Ａ链和和Ｂ链，，最后利利用化学学方法使使两条链链之间形形成二硫硫键，从从而得到到胰岛素素。b.以酵母为为受体分分泌表达达人胰岛岛素。在胰岛岛素编码码基因前前段增加加一个信信号肽编编码序列列，这个个信号肽肽引导合合成的胰胰岛素从从细胞内内分泌到到周围的的培养基基中，从从而简化化了胰岛岛素的纯纯化过程程，最后后通过酶酶学反应应使之变变成人胰胰岛素。。二.基因因工程人人红细胞胞生成素素１.人红细胞胞生成素素的组成成和生物物活性成熟的人人红细胞胞生成素素（ＥＰＰＯ）是一种由由１６５５个氨基基酸组成成的糖蛋蛋白，多多肽结构构中由４４个半胱胱氨酸形形成２条条二硫键键，相对对分子质质量为３３４×１０３ＥＰＯ又又称促红细胞胞生成素素或红细胞生生产刺激激因子，是一类类造血生生长因子子，刺激激和调节节哺乳动动物红细细胞的生生成，维维持外周周血红细细胞处于于正常水水平。肾是产生生ＥＰＯＯ的主要要器官，目前只只有应用用基因工工程技术术生产ＥＥＰＯ才才能满足足患者的的需求。。２.重组红细细胞生成成素的生生产人类ＥＰＰＯ位于于第７号染染色体长长２２区区，１９８８５年克克隆到其其cＤＮＡ。。由于糖糖基化的的问题，，目前只只利用脊脊椎动物物表达系系统来生生产人红红细胞生生成素，，其糖基基化特性性与人体体中自然然产生的的糖基化化特性最最相近。。方法：通过将将编码人红红细胞生生成素的的基因装入哺乳乳动物细细胞表达达载体，，转染二二氢叶酸酸还原酶酶缺陷的的ＣＨＯＯ细胞（（ＣＨＯＯ－dhfrˉ）株，，并进一一步筛选选获得高高产人红红细胞生生成素的的ＣＨＯＯ。经过过一系列列细胞培培养和蛋蛋白质纯纯化等工工艺制备备过程，，产生有有生物学学活性的的重组人人ＥＰＯＯ。现在上市市的红细细胞生成成素主流流产品都都是通过过基因重重组技术术，利用用中国仓鼠鼠卵巢细细胞（ＣＣhinesehamsterovary，ＣＨＯＯ）生产的。。三.基因因工程干干扰素１.干扰素的的结构组组成、生生物活性性和临床床应用干扰素（（interferon，ＩＦＮＮ）是一种具具有广谱谱抗病毒、、抗肿瘤瘤和免疫疫调节作作用的可溶性性糖蛋白白细胞因因子，最最早于１１９５７７年发现现。干扰素是是一类多多功能细细胞因子子，按其其结构和和功能的的差异可可以分为为三类，，即干扰扰素α、干扰素素β和干扰扰素γ。干扰扰素α含有２２３种种不同同的亚亚型，，干扰扰素β和干扰扰素γ都只有有１种种亚型型。干扰素素α的成熟熟产物物由１１６５５～１１６６６个氨氨基酸酸组成成，其其中含含４个个半胱胱氨酸酸，形形成对对生物物活性性至关关重要要的２２个二二硫键键。干干扰素素α主要由由白细胞胞、Ｂ淋巴巴细胞胞、成纤维维细胞胞和一一些肿肿瘤细细胞分分泌；临床床上主主要用用来治治疗白白血病病，以以及一一些慢慢性病病毒，，如乙乙型肝肝炎、丙型肝肝炎和和疱疹疹病毒毒感染染。2.基因工工程干干扰素素的生生产早期制制备是是通过过诱导或或重组组诱导导天然或或人工工培养养的人人体细细胞或或血细细胞产产生天然干干扰素素。利用基基因工工程生生产干干扰素素：a.先要获获得干干扰素素的编编码基基因；；b.利用诱诱生剂剂诱导导细胞胞表达达干扰扰素；；c.然后提提取干干扰素素的mＲＮＡＡ，反反转录录成cＤＮＡＡ；d.将干扰扰素编编码基基因通通过合合适的的表达达载体体，导导入大大肠杆杆菌进进行表表达可可产生生大量量干扰扰素；；e.经过分分离纯纯化便便可制制成药药物制制剂。。四、基基因工工程疫疫苗疫苗的的定义义：由灭活或或减毒毒的病原体体做成的的可预预防相相应病病原物物引起起疾病病的药药物，，通过过接种种人或或动物物在其其体内内建立立抗感感染免免疫反反应而而产生生保护护作用用。１.基因工工程疫疫苗的的分类类：a.亚单位位疫苗苗。指用用病原原体的的组分分制成成的疫疫苗，，包括括病毒毒的结结构蛋蛋白和和细菌菌的脱脱毒毒毒素蛋蛋白，，其中中病毒毒的结结构蛋蛋白是是指病病毒组组成成成分中中能引引起人人体对对病毒毒颗粒粒产生生免疫疫反应应且不不致病病的蛋蛋白组组分；；细菌菌脱毒毒毒素素蛋白白是利利用ＤＤＮＡＡ重组组技术术在基基因水水平上上对细细菌的的毒素素蛋白白进行行脱毒毒所获获得的的基因因工程程疫苗苗。b.无毒疫疫苗或或减毒毒活疫疫苗。利用用ＤＮＮＡ重重组技技术去去掉致致病菌菌的毒毒素基基因后后得到到的即即保留留了其其侵入入细胞胞和刺刺激免免疫系系统的的能力力，却却又不不能引引起疾疾病的的减毒毒病原原菌。。c.疫苗载载体。把目目的基基因转转到已已经在在临床床上使使用的的安全全的活活疫苗苗中，，利用用该活活疫苗苗作为为载体体表达达目的的抗原原基因因，从从而达达到针针对某某种传传染病病的免免疫保保护作作用。。２.重组乙乙型肝肝炎疫疫苗乙型肝肝炎的的定义义：由乙乙型肝肝炎病病毒（（ＨＢＢＶ））引起起的、、以肝肝为主主要病病变并并可累累及多多器官官损害害的一一种传传染病病。乙型肝肝炎病病毒颗颗粒由由囊膜和含有ＤＤＮＡＡ分子子的核核衣壳壳组成，，又称称Ｄane颗粒。。最初的的乙型型肝炎炎疫苗苗都是是血液液乙型型肝炎炎疫苗苗，是是从乙乙型肝肝炎患患者血血液中中分离离提取取乙型肝肝炎表表面抗抗原（（ＨＢＢsＡg）。疫苗的的制备备一般般选定定具有有免疫疫原性性的乙乙型肝肝炎表表面抗抗原基基因片片段，，将起起插入入表达达载体体，并并引入入到与与表达达载体体相对对应的的宿主主细胞胞，构构成重重组体体。重重组体体像一一个加加工厂厂，可可以表表达、、加工工、生生产出出乙型型肝炎炎表面面抗原原，即即得到到基因因工程程疫苗苗。（１））.重组酵酵母乙乙型肝肝炎疫疫苗用来表表达抗抗原的的酵母母主要要是酿酒酵酵母、、汉逊逊酵母母和毕毕赤酵酵母。。表达质质粒上上用来来在酵酵母中中表达达ＨＢＢsＡg的主要要部件件有３３个：：⑴在在酵母母中表达ＨＨＢsＡg的启动动子。⑵不含有有内含含子的的乙型型肝炎炎病毒毒ＨＢＢsＡg的基因因。⑶在在酵母母细胞胞中终止ＨＨＢsＡg转录的的ＤＮＮＡ序序列。。利用酵酵母细细胞表表达ＨＨＢsＡg存在缺点：⑴酵酵母细细胞不不能分分泌ＨＨＢsＡg颗粒；；⑵酵酵母细细胞对对ＨＢＢsＡg蛋白的的糖激激化与与哺乳乳动物物的不不同，，使得得获得得的酵酵母ＨＨＢsＡg可能具具有与与血液液ＨＢＢsＡg不同的的免疫疫原性性；⑶在酵酵母中中装配配２２２nmＨＢsＡg颗粒不不稳定定；⑷⑷酵母母细胞胞产生生的ＨＢsＡg需要化化学方方法处处理才才能与与血液液的ＨＨＢsＡg相同，，在这这过程程中可可能改改变ＨＨＢsＡg分子的的结构构，从从而减减小ＨＨＢsＡg抗原性性。（２））.重组中中国仓仓鼠卵卵巢细细胞（（ＣＨＨＯ））乙型型肝炎炎疫苗苗将乙型肝肝炎表表面抗抗原基基因片片段重组到到中国国仓鼠鼠卵巢巢细胞胞（ＣＣＨＯＯ）内内，通通过对对细胞的的培养养增殖殖，分泌泌乙型型表面面抗原原（ＨＨＢsＡg）于培培养液液中，，经纯纯化，，加佐佐剂氢氢氧化化铝后后制成成疫苗苗。优点：⑴ＣＨＯ乙型肝肝炎疫苗产生生的ＨＢsＡg的糖基化与血血液ＨＢＶ颗颗粒的糖基化化一样；⑵产生的ＨＢsＡg颗粒是以自然然方式装配的的，而不需要要其他的化学学处理；⑶装配的２２nmＨＢsＡg颗粒最后会被被分泌到培养养基中，不需需要裂解细胞胞，简化了纯纯化步骤；⑷成本不高，有有利于那些负负担不起现有有的高价疫苗苗的患者。五.基因工程程抗体抗体的定义：：是机体受抗原原刺激后由Ｂ淋巴细胞产生，并且能能与该抗原发发生特异性结合的具有免疫功功能的球蛋白，是体液免疫应答中发挥免免疫功能的最最主要的免疫疫分子，主要要分布与血清清中，在组织织液和外分泌泌液中也存在在。常规抗体体是针对多种种不同抗原决决定蔟产生的的抗体，又称称多克隆抗体；而针对某种种抗原决定蔟蔟的抗体称单克隆抗体，一般由杂交交瘤细胞分泌泌。在临床上，抗抗体可用于抗肿瘤、抗感感染、抗器官官移植排斥反反应、抗血栓栓形成和解毒毒，以及构建独特型疫疫苗、治疗自自身免疫性疾疾病和变态反反应疾病，此外还可用用于体外诊断和发发挥体内药物物导向作用。基因工程抗抗体在临床上上可发挥更多多更重要的作作用。第三节基因因工程抗体一.抗体的结结构抗体分子是由由４条多肽链链组成的四聚聚体，即由２条相同的轻轻链（Ｌ）和和２条相同的的重链（Ｈ））组成，重链之之间以及轻链链之间通过二二硫键连接，，呈Ｙ字型结结构（图１８８－２）。重链由４５０个氨基基酸组成（如抗体体ＩgＧ），轻链由由２１４个氨基基酸组成，完整抗抗体的相对分分子质量约为为１５０×１０３。抗原的识别别位点位于轻轻链和重链的的Ｎ端区域，，该区称称作作抗体的可变区区（Ｖ区），，识别位点就在在Ｖ区内的３３个互补决定区（（ＣＤＲ），，也称超变区，每个ＣＤＲＲ长约５～１１６个氨基酸酸。Ｖ区以外的部部分称为框架区（ＦＲＲ），其氨基酸序列列相对保守，，不与抗原分分子直接结合合，可维持抗抗体的空间构构型。抗体分子含有有多个功能区区，除Ｖ区外外，每一条轻轻链含有１个个保守区（Ｃ区区）ＣＬ，每一个重链链含有３个保保守区（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）。二.天然抗体的局局限性抗原有多种不不同抗原决定定蔟，可刺激激产生多克隆抗体。这种抗原是是不均一的，会影响检检测抗原的特特异性及敏感感性，在临床床上应用受到到很大限制。。单克隆抗体的的定义：是由识别一一种抗原决定定蔟的细胞克克隆所产生的的均一抗体，，可视为第二代抗体，具高度特异性、均一一性，且亲和和力强、效价价高，在临床上发发挥了重要作作用。单克隆抗体在在临床中的问问题：⑴单克隆抗抗体具有免疫原性；⑵杂交瘤制制备的单克隆隆抗体在人体体内的半衰期期只有５～６６h，不利于药效效发挥作用；；⑶吸收差，，抗体相对分分子质量大，，很难通过血血管进入细胞胞间隙，大大大降低治疗效效果；⑷生产产复杂，价格格较高。三.基因工程程抗体的种类类１.单克隆抗体的的人源化为了解决鼠源源抗体的免疫疫原性问题，，应改造抗体体，构建人－－鼠嵌合抗体体和人源化抗抗体。a.人－鼠嵌合抗抗体通过基因重组组，将鼠源单单克隆抗体的的Ｆv片段替换人源源抗体的相应应片段，制成成人－鼠嵌合合抗体（图１１８－３）。。７０％序列列来自人源抗抗体，３０％％序列来自鼠鼠源抗体；可可保留抗体的的特异性结合合位点，也可可减弱其免疫疫原性。b.人源化抗体是对嵌合抗体体进一步改进进的结果，即即用鼠源单克克隆抗体的ＣＣＤＲ所获得得的杂合抗体体，９５％序序列来自人源源抗体，５％％的序列来自自鼠源抗体，，最大限度地地使鼠源抗体体人源化（图图１８－４））。抗体的抗抗原结合特性性保留，在人人体内产生免免役原性的程程度降到最低低。２.小分子抗体为了解决穿透透性问题，对对抗体改造，，保留抗原结结合位点，成成为小分子抗抗体，分为下下面５种：a.Ｆab抗体抗体的Ｆab片段由重链的的Ｖ区和Ｃm区与轻链以二二硫键相连，，能发挥抗体体的抗原结合合功能，大小小为完整抗体体的１／３。。b.单链抗体将抗体的ＶＨ和ＶＬ用连接肽连接接，形成具有有抗原结合合能力的单链链抗体多肽，，即所谓的单单链抗体（ＳＳcＦv）。其大小仅仅为完整抗体体的１／６，，免疫原性弱弱，药物动力力学优于Ｆab片段和完整抗抗体，能有效效到达完整抗抗体无法达到到的靶部位。。c.单域抗体抗体结合抗原原的部位主要要在Ｖ区，只含有Ｖ区的小分子抗体体，如ＶＨ或ＶＬ，也能保持原单单克隆抗体的的特异性，这这种小分子抗抗体称为单域域抗体，其大大小为完整抗抗体的１／１１２，其只有有一个功能区区，制备简单单，更容易穿穿过靶细胞。。d.超变区多肽由单个ＣＤＲＲ多肽构成的的小分子抗体体称为超变区区多肽，其只只有１６～３３０个氨基酸酸，具有与抗抗原结合的能能力，穿透力力极强。但亲亲和力低，稳稳定性不高，，实际应用有有很大局限性性。e.双体抗体将两种不同抗抗体的ＶＨ区和ＶＬ区通过连接肽肽（５～１００个氨基酸））连接，形成成“杂交”的的单链抗体称称作双体抗体体（diabody），也称双特特异性抗体。。在宿主细胞胞中表达后，，２条链自动动折叠，形成成双特异性的的抗体片段，，其大小为ＩＩgＧ的１／３或或Ｆab的１／２，是是相对分子质质量最小的双双功能抗体，，在免疫诊断断和治疗方面面有广阔的应应用前景。３.双功能抗体双功能抗体的的定义：天然的抗体体分子是双价价单特异性的的，将小分子子抗体（如ＦＦab或Ｆv）与其他蛋白白如毒素、酶酶、细胞因子子及受体分子子连接在一起起，可形成一一种新型分子子，这样的杂杂和分子称双双功能抗体。。双功能抗体即即可以与靶位点点结合，又可将特定的活性性分子导向特特定部位，发挥其生物物学功能，如如杀死肿瘤细细胞、发挥催催化功能等。。将人细胞受体体或黏附分子子与抗体的恒恒定区（主要要是Ｆc片段）的Ｎ段段连接，形成成免疫黏连素，既可发挥抗抗体的效应功功能，又能发发挥细胞黏附附功能。对于于杀伤缺少相相应表面抗原原的肿瘤细胞胞有一定意义义，可减少肿肿瘤的免疫逃逃逸。４.人源性抗体制备人源单克克隆抗体的２２种方法：a.噬菌体抗体库库噬菌体抗体库库技术是噬菌菌体表面展示示技术在基因因工程抗体应应用上的一个个成功范例；；通过噬菌体表表面展示技术术，可将目的蛋白或多多肽的编码基基因与编码Ｍ１３噬噬菌体颗粒末末端蛋白的基基因Ⅲ构建成融合基因，将含有融合合基因的重组组Ｍ１３噬菌菌体转染大肠肠杆菌，可以以在噬菌体颗颗粒表面展示示目的蛋白。。（图１８－－５）b.人源性抗体转转基因小鼠通过构建转基基因小鼠，可可使小鼠产生生人源性单克克隆抗体。用人的抗体体基因转入小小鼠并替代小小鼠的相应基基因，产生能能分泌人抗体体的转基因小小鼠，第一个个获得的人源源性抗体是抗抗破伤风类毒毒素的单克隆隆抗体。在转基因小鼠鼠基础上，建建立了一种产产生人抗体的的小鼠模型ＸＸenoＭouse。将小鼠的全全套抗体基因因敲除掉，同同时将人的大大部分轻链和和重链基因插插入到小鼠的的染色体中，，当用抗原刺刺激小鼠时就就可产生人源源性抗体。利利用该模型已已制备了多种种类型的人单单克隆抗体，，如抗人表皮皮生长因子受受体的人源性性抗体。５.基因工程抗体体的产生⑴大肠杆菌菌表达系统⑵酵母表达达系统⑶哺乳动物物表达系统⑷植物表达达系统⑸昆虫表达达系统第四节核酸酸类药物一.反义核酸药物物反义核酸是一些人工合合成的单链反反义分子，可可以通过碱基基互补原则与与被感染细胞胞内的某个靶靶标mＲＮＡ或ＤＮＮＡ结合，抑抑制或封闭该该基因的转录录和表达，或或切割mＲＮＡ使其丧丧失功能。反义核酸作为为药物可以治治疗正常蛋白白超量表达的的疾病，如癌癌症，炎症，，病毒或寄生生虫感染。根据组成的特特点可将其分分为反义ＲＮＡ，，反义ＤＮＡＡ，肽核酸和和核酶。１.反义义ＲＲＮＮＡＡ机理理：：利用用反义义ＲＲＮＮＡＡ可可以以与与mＲＮＮＡＡ结结合合形成成互互补补双双链链，，阻断断核酸酸蛋蛋白白体体同同mＲＮＮＡＡ的的结结合合，，从从而而抑制制了mＲＮＮＡＡ翻翻译译成成蛋蛋白白质质的的过过程程。。反义义ＲＲＮＮＡＡ在在细细胞胞核核中中与与mＲＮＮＡＡ结结合合后后会会干扰扰其其加加工工和和剪剪切切，如如加加帽帽和和加加poly（ＡＡ））尾尾，，还还会会干扰扰mＲＮＮＡＡ转转运运至至细细胞胞质质。反反义义核核酸酸和和mＲＮＮＡＡ结结合合后后还还使使得得mＲＮＮＡＡ更更加加易易被被核核酸酸识识别别而而降降解解，，从从而而大大大大缩短短mＲＮＮＡＡ的的半半衰衰期期。反反义义ＲＲＮＮＡＡ除除了了可可以以影响响基基因因的的表表达达外，，还还可可与与引引物物ＲＲＮＮＡＡ前前体体互互补补结结合合，，从从而而抑制制ＤＤＮＮＡＡ复复制制。反义义ＲＲＮＮＡＡ可可以以人人工工合合成成，，更更多多的的是是将将目目的的ＤＤＮＮＡＡ以以反反方方向向插插入入载载体体通通过过反反义义表表达达载载体体产产生生。。通通过过这这些些载载体体可可用用于于研研发发新新型型，，高高特特异异性性和和高高效效的的反反义义治治疗疗药药物物，，在在治治疗疗艾艾滋滋病病和和麻麻疹疹以以及及恶恶性性肿肿瘤瘤方方面面起起到到了了一一定定作作用用。。２.反义义ＤＤＮＮＡＡ反义义ＤＤＮＮＡＡ的的定定义义：也也称称反反义义寡寡核核苷苷酸酸或或反反义义脱脱氧氧核核苷苷酸酸，，是是一一种种人人工工合合成成的的，，能能与与mＲＮＮＡＡ互互补补的的，，用用于于抑抑制制翻翻译译的的短短小小反反义义核核酸酸分分子子。。反义义ＤＤＮＮＡＡ与与mＲＮＮＡＡ结结合合后后还还可可以以诱诱导导ＲＲＮＮaseＨ的的产产生生，，降降解解ＤＤＮＮＡＡ－－ＲＲＮＮＡＡ复复合合物物中中的的ＲＲＮＮＡＡ，，从从而而大大大大缩缩短短了了mＲＮＮＡＡ的的半半衰衰期期。。反义义ＲＲＮＮＡＡ可可以以通通过过自自动动合合成成仪仪，，但但其其很很易易被被降降解解，，为为提提高高其其稳稳定定性性，，亲亲和和力力，，降降解解靶靶核核酸酸的的能能力力以以及及其其他他性性能能，，由由此此催催生生了了第第一一代代反反义义核核酸酸药药物物硫硫代代磷磷酸酸脱脱氧氧寡寡核核苷苷酸酸（（ＰＰＳＳ－－ＯＯＤＤＮＮ））。。第第一一个个反反义义核核酸酸药药物物福福米米韦韦生生就就是是ＰＰＳＳ－－ＯＯＤＤＮＮ药药物物，，由由２２１１个个硫硫代代磷磷酸酸脱脱氧氧核核苷苷酸酸组组成成，，核核苷苷酸酸序序列列为为５５‘‘－－ＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＧＧＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＧＧ－－３３’’，，具具有有强强大大的的抗抗病病毒毒作作用用。。３.肽核核酸酸肽核核酸酸是以以肽链链骨骨架架代代替替核核糖糖－－磷磷酸酸骨骨架架的ＤＤＮＮＡＡ类类似似物物，，是是通通过过计计算算机机模模拟拟设设计计出出来来的的新新核核酸酸类类似似物物。。以以２－－氨氨基基乙乙基基甘甘氨氨酸酸为为骨骨架架，４４种种碱碱基基为为侧侧链链，，碱碱基基通通过过亚亚甲甲碳碳基基与与骨骨架架相相连连，，保保持持与与天天然然核核酸酸中中相相邻邻碱碱基基以以及及碱碱基基与与骨骨架架间间相相近近的的键键数数目目，，相相邻邻碱碱基基间间间间隔隔６６个个键键，，碱碱基基与与骨骨架架间间为为２２～～３３个个键键。。肽核核酸酸保保留留了了与互互补补ＤＤＮＮＡＡ或或ＲＲＮＮＡＡ杂杂交交的性能，，亲和力力得到进进一步提提高，同同时，其其化学和和生物学学稳定性性更强，，不易被被核酸酶酶和蛋白白酶降解解；从化化学角度度看，更更易进行行大规模模生产。。４.核酶核酶是一类具具有催化化活性的的ＲＮＡＡ分子，，具有核核苷酸水水解活性性,可特异性性剪切ＲＲＮＡ分分子，相当于ＲＲＮＡ酶酶。核酶可可以调节节基因的的表达，，在ＲＮＮＡ的自自我裂解解，自我我剪切，，tＲＮＡ的的转录后后加工等等过程中中起重要要作用。。可用于于药物的的开发，，抑制特特定基因因的表达达。核酶具有有特定的的催化域域和底物物结合域域。底物结合合域可通过碱碱基互补补与靶序序列结合合，相当当于反义义ＲＮＡＡ；而催化域可在特定定位点剪剪切目的的ＲＮＡＡ。通过过改变结结合域的的序列，，核酶可可切割特特定序列列的mＲＮＡ。。核酶用用作药物物的一个个优点是不易引引起动物物或人的的免疫反反应。具有催化化活性的的脱氧核酶酶（ＤＮＡＡzyme），是通通过合成成随机寡核核苷酸库库，从中筛筛选到一一个具有有核酶活活性的寡寡核苷酸酸。该寡寡核苷酸酸含一个个由１５５个核苷苷酸组成成的催化化域，两两侧是７７～８个个核苷酸酸的臂，，与目标标ＲＮＡＡ互补配配对。针针对不同同目的基基因的脱脱氧核酶酶已经在在体外和和体内发发生了酶酶学反应应。二.核酸疫苗苗１.核酸疫苗苗的工作作方式核酸疫苗苗又称基因疫苗苗或ＤＮＮＡ疫苗苗，是利用用基因重重组技术术将编码码抗原的的基因装装入载体体，然后后直接导导入动物物体内，，通过机机体细胞胞的转录录系统合合成蛋白白，产生生的蛋白白作为抗抗原诱导导免疫系系统产生生免疫应应答，即即通过细细胞和体体液免疫疫反应产产生抗体体，从而而达到预预防和治治疗疾病病的目的的。２.疫苗载体体核酸疫苗苗是通过过疫苗载载体将抗原编编码基因因导入机机体而激激发免疫疫的。导入入方式有有⑴裸ＤＮＡＡ直接注注射到肌肌肉内；；⑵用脂质体体包裹ＤＤＮＡ后后在注射射；⑶将ＤＮＡＡ用基因因枪注入入体内；；⑷通过去毒毒的内生生细菌引引导ＤＮＮＡ进入入体内。。疫苗载体体是一种种穿梭质粒粒载体，含含有真核表达达系统的的启动子子，以及用用于真核核细胞的的选择标记记；用于动动物实验验的载体体还含有有在哺乳乳动物细细胞中复制的病病毒复制制区；为提高高疫苗的的免疫原原性，载载体中还还加入具具有强烈烈佐剂作作用的ＣＣＧ序列列。典型的核核酸疫苗苗载体有有pcＤＮＡ３３.１，以及在在此基础础上去掉掉病毒复复制单位位并用于于双宿主主可用的的卡那霉霉素抗性性基因替替换氨苄苄青霉素素抗性基基因和新新霉素抗抗体基因因的改建建载体pＶＡＸ１１。（图１８－－６）３.核酸疫苗苗的特点点优点：⑴安全性好好，没有有感染的的危险；⑵免疫效果果好，核酸疫疫苗能在在自身细细胞中产产生于自自然抗原原接近的的外源性性蛋白，，能诱导导产生类类似自然然抗原的的免疫应应答；⑶制备简单单，只需对对编码抗抗原的基基因进行行克隆；；⑷核酸疫疫苗的本本质是核核酸分子子，因而而不同于于蛋白质质和活疫疫苗，可可以在室温条条件下保保存，不存在在疫苗的的冷藏和和低温运运输问题题，从而而保证ＤＤＮＡ疫疫苗的高高效接种种率；⑸免疫应答答持久，外源基基因的不不断表达达可持续续提供抗抗原。三.ＲＮＡ干干扰１.ＲＮＡ干干扰现象象ＲＡＮ干干扰（ＲＲＮＡi）是指对应应于某种种mＲＮＡ的的正义ＲＲＮＡ和和反义ＲＲＮＡ组组成的双链ＲＮＮＡ（dsＲＮＡ））分子使mＲＮＡ发发生特异异性降解解，导致致其不能能表达的的转录后后基因沉沉默（ＰＰＴＧＳＳ）现象象。ＲＮＡi发挥作用用包括两两个阶段段：⑴起始阶阶段：双链ＲＲＮＡ分分子进入入细胞后后被称为为Ｄicer的核酸酶酶切割为为２１～～２３个个核苷酸酸长的小分子干干扰ＲＮＮＡ片段段（siＲＮＡ））。Ｄicer核酸酶属属于ＲＮＮaseⅢⅢ家族，能能够特异异识别双双链ＲＮＮＡ，产产生的小小片段ＲＲＮＡ的的３‘端端都有２２个突出出碱基。。然后双双链siＲＡＮ与与核酸酶酶结合形形成ＲＮＡ诱诱导沉默默复合体体（ＲＩＩＳＣ））。⑵效应阶阶段：siＲＡＮ打打开双链链从而激激活ＲＩＩＳＣ，，激活的的ＲＩＳＳＣ通过过碱基配配对与对对应的mＲＮＡ结结合，并并在距离离siＲＡＮ３３’端１１２个碱碱基的位位置切割割mＲＮＡ。。同时，siＲＡＮ可可作为引引物并以以mＲＡＮ为为摸板合合成新的的dsＲＮＡ；；这样又又进入上上述循环环，继续续对目的的mＲＮＡ进进行切割割，从而而使目的的基因沉沉默，产产生ＲＮＮＡi现象。（（图１８８－７））四.基因治疗疗１.基因治疗疗的思想想基因治疗疗是将目的的基因放放进特定